银杉的分子谱系地理学研究

银杉（Cathaya argyrophylla）是中国特有的濒危裸子植物，孤立分布于我国亚热带山地。虽然以往等位酶和RAPD标记的研究表明，银杉群体的遗传多样性水平很低而群体间的遗传分化很高，但迄今对该种群体的动态变化以及物种的进化历史仍缺乏了解，包括影响群体遗传结构的因素以及物种可能的避难所等，对如何有效地保护和恢复银杉群体仍缺乏科学依据。本文根据8个核基因片段和2个线粒体片段的序列数据，运用群体遗传学和谱系地理学方法，探讨了银杉在DNA水平上的多样性和群体的动态历史，探讨了影响银杉特殊的群体遗传结构的各种因素，并推测了银杉第四纪冰期的避难所，对银杉花粉活力及其变异进行检测。在此基础上，提出了保护和恢复银杉群体的具体策略和措施。主要研究结果如下： 　　1. 核甘酸多态性和群体遗传结构 　　从101个核基因片段中筛选了8个适用于银杉的片段，对来自四个地区15个群体共86个个体的胚乳总DNA进行了扩增和测序。8个核基因座位的平均核苷酸多态性（θs＝0.0022，πs＝0.0027）显著低于其它松杉植物遗传多态性的多座位估计值。四个地区中，大瑶山（DY）的多态性最高（θs＝0.0026，πs＝0.0027），八面山（BM）最低（θs＝0.0014，πs＝0.0018），大娄山（DL���和越城岭（YC）介于二者之间。大多数座位内的多态位点间紧密连锁，座位间的连锁只在八面山地区检测到。AMOVA分析表明显著性的多态性比例存在于地区间（20.05％）和地区内群体间（9.37％）。FST分析也显示群体间（FST＝0.294）和地区间（FST =0.131-0.319）存在显著的遗传分化。推测伴随着瓶颈效应而出现的遗传漂变及其有限的基因流（Nm=1.2）是导致银杉群体低水平多态性和群体间强烈分化的主要原因。 　　2．谱系地理学分析 　　利用2个线粒体片段（nad1和nad4）序列以及高变异量的核2009片段序列对银杉的谱系地理进行了探讨。2个线粒体片段的多态位点组合成3种单倍型，将银杉分成大娄山（DL���、八面山（BM）以及越城岭（YC）和大瑶山（DY）3个地区，地区间的单倍型完全不同（GST=1.0），结合核基因呈现的群体遗传结构，推测现存银杉群体至少来源于4个冰期避难所，相当于银杉现存的4个相互隔离的地区。2009座位上12个变异位点组合成8种单倍型，位于单倍型谱系内部节点的4种祖先单倍型分布广泛、出现频率最高，其它7个核基因座位具有类似谱系结构。遗传距离和地理距离没有相关性，NST (0.138)与GST (0.134)没有显著性差异，说明现存的银杉群体是相对较近的时间内片断化的产物。2009片段分离位点的失配分布（mismatch distribution）呈双峰和多峰，表明银杉群体没有经历近期的扩张，与古生物学研究证据相吻合。 　　3. 银杉的基因杂合性和花粉生命力 　　利用2009和cad两个核基因片段，采用多胚乳序列法得到总的杂合体比率为64％（2009）和60％（cad），说明银杉群体中存在高比例的杂合体。大娄山地区的杂合体比率是八面山地区的2倍。银杉杂合体比率的高低可能与其遗传多态性有关，也可能是自然选择的结果。采用TTC染色法对银杉的花粉生命力进行了测定，在干燥低温条件下银杉花粉的活力很稳定，保存一年后有活力的花粉数仍高达80％以上。通过对来自两个地区（DY和YC）7个群体共16个银杉个体花粉活力的测定发现，银杉有活力花粉比例高达93.3％，与其它裸子植物相当。花粉活力在地区间和群体间存在显著差异，花坪地区（95.2%）的花粉活力高于大瑶山（91.3%）。花粉活力在群体内个体间差异不显著。 　　4．银杉的进化历史及其保护 　　银杉的低水平的遗传多样性和独特的群体遗传结构对我们推测其冰川期避难所提供了重要依据。本研究在银杉4个孤立分布区发现了彼此不重叠的线粒体单倍型，同时核基因表现出了4个地理群，说明随着第四纪冰期气候的波动和银杉分布范围的片段化，原来广布的群体逐步萎缩，最后被保留在位于西部大娄山（DL���，东部八面山(BM)，中南部越城岭(YC)和南部大瑶山(DY) 4个相互隔离的避难所。银杉独特的群体结构和动态历史对进一步制定相应的保护措施具有重要参考价值。由于遗传多态性很低，群体又小，几乎所有现存的银杉群体都面临由于随机事件导致的物种灭绝。更严重的是，当前该物种的适生环境不断恶化和片段化，以及异常低的生殖和存活率导致银杉与其它物种竞争能力很低。因此，除目前采取的原地保护策略外，迁地保护应给予优先考虑。此外，采用传统的控制授粉策略（在遗传上有显著差异的群体间开展人工杂交）是丰富其遗传多态性、恢复衰退群体的可行措施之一。

四川黄龙杓兰属植物的传粉生物学

兰科植物传粉生物学的研究以往多集中于单个物种上，很少对两个以上的物种同时进行研究。但后一类研究对于理解一个地区或一个代表类群的传粉适应是大有裨益和非常必要的，毕竟单一种植物与其传粉者在一个居群或是一年中的相互关系所提供的有效信息是非常有限的。杓兰属Cypripedium L.是兰科植物中比较原始的类群，全世界约有50种;中国是杓兰属植物的分布中心，有30多种。但是，有关该属植物的传粉生物学研究集中在欧、美的种类，中国绝大部分物种尚未进行这方面的研究。本文通过对分布于四川省黄龙寺自然保护区的8种杓兰属植物的传粉生物学研究，探讨了该属植物的传粉机制、适应进化及生殖隔离等问题。 1． 杓兰属植物的繁育系统 虽然所研究的8种杓兰人工自交授粉均可以成功结实，但在自然条件下都必须依赖于昆虫才能结实成功，表明杓兰属植物的繁殖系统以异交授粉为主。 2． 杓兰属植物的传粉系统以及传粉系统的进化趋势 杓兰属植物一向被认为是典型的蜂类传粉物种，本文所包括的西藏杓兰C. tibeticum King ex Rolfe、离萼杓兰C. plectrochilum Franch.、绿花杓兰C. henryi Rolfe与褐花杓兰C. smithii Schltr.的传粉生物学研究也证明了这一点。但研究发现最进化的“无苞组”的3种杓兰，即无苞杓兰C. bardolphianum W. W. Smith et Farrer、小花杓兰C. micranthum Franch.与四川杓兰C. sichuanense Perner都是由蝇类传粉的，而黄花杓兰C. flavum P. F. Hunt et Summerh.则可由蜂类和蝇类共同传粉。结合杓兰的种间系统关系，本文认为杓兰属中存在从蜂类传粉系统向蝇类传粉系统的进化趋势。 3．杓兰属植物传粉系统的特化机制 传粉观察表明8种杓兰均有多种多样的访花昆虫，但只有1种或1类具有相同功能的昆虫能成为其传粉者。这说明杓兰属植物是具备特化传粉系统的种类。以离萼杓兰为例进行的花色、花香及花结构的分析表明，杓兰拥有特化的传粉者几乎完全是由于受到花结构的限制，特别是雄蕊到唇瓣底高度（AL）、柱头到唇瓣底高度（SL）、唇瓣入口直径（DL���与唇瓣出口宽度（EL）的大小。这些因素决定了昆虫是否能进入唇瓣，是否能碰触到柱头和花粉，是否能从出口挤出来。因此，杓兰的唇瓣的主要功能不仅是象原来所认为的作为“陷阱”来诱捕昆虫，而且同样作为一种促进产生“特化传粉”的机制而存在。 4． 杓兰属植物吸引昆虫的机制 杓兰属植物具有复杂的吸引昆虫的机制。离萼杓兰、黄花杓兰主要以泛化的食源性欺骗机制来吸引昆虫，绿花杓兰能通过其唇瓣和退化雄蕊的光滑特性诱使其传粉昆虫被动进入唇瓣中，西藏杓兰可以通过“筑巢式欺骗”来吸引昆虫，无苞杓兰则可通过模拟成熟果实来吸引其特化的传粉者—果蝇Drosophila spp.。 5． 杓兰属植物的花部特征与传粉系统的适应 在整个杓兰属内，不同种类植物的花色与花香和传粉者种类间没有统一的规律。但是，杓兰属植物的唇瓣大小与其传粉者大小之间存在比较明显的适应关系。体积最大的西藏杓兰、褐花杓兰与黄花杓兰由体型最大的熊蜂Bombus spp.传粉，体积中等的离萼杓兰、绿花杓兰、四川杓兰由中等大小的蜂或蝇传粉，而体积最小的无苞杓兰与小花杓兰由体型很小的果蝇传粉。 在杓兰属中，大部分种类的花粉只是粘性的团状，只有一部分能在一次访问中被昆虫带出，如黄花杓兰、西藏杓兰、离萼杓兰及绿花杓兰的花粉团。与此不同，在2个“无苞组”的杓兰，即无苞杓兰、小花杓兰中，它们的花粉凝聚成块状，而且它们的传粉昆虫(果蝇)的一次访问可带出一侧雄蕊的全部花粉。它们的花粉成块可能是对果蝇这类小昆虫传粉的一种适应。 6． 杓兰属植物的生殖隔离机制 本文的研究表明，杓兰属植物之间人工杂交授粉可以成功结实，它们主要是通过受精前隔离机制保持物种界限的。它们的受精前隔离机制多种多样。具有相同传粉者—果蝇的无苞杓兰与小花杓兰通过地理隔离机制保持物种界限; 同域的西藏杓兰与黄花杓兰通过利用不同大小的熊蜂作为传粉者来保持生殖隔离;同域的离萼杓兰与绿花杓兰可能通过花香成分的不同特化吸引同一属中不同种的传粉昆虫;而同域的西藏杓兰与褐花杓兰之间并不具备完善的生殖隔离机制。

内蒙古退化草原对不同类型干扰的响应研究

本文结合野外调查、野外实验和模型模拟方法研究了内蒙古退化草原在继续放牧和啮齿类动物活动干扰下，植物多样性、种群空间格局、种间空间关联、小尺度鼠丘和小尺度空斑（Gap）上植被发展动态的生态响应。研究结果如下： （1）经过长期不同强度的放牧干扰后，无牧条件下植被盖度显著低于其它三个放牧（轻牧、中牧、重牧）条件下的植被盖度，而其它三个放牧条件之间的植被盖度差异不显著;无牧条件下羊草成为群落的优势种，轻牧和中牧条件下冷蒿依然是群落的优势种，这三种条件下寸草苔的种群盖度最大;重牧条件下优势种变为星毛委陵菜，并且其种群盖度最大;不同放牧退化阶段指示植物的种群盖度随放牧强度增大的变化趋势是：冷蒿为先增大后减小，而星毛委陵菜为先急剧增大，然后平缓增大，最后再急剧增大;植物多样性和均匀度指数在中牧条件下最大，在无牧条件下最小，说明中牧条件下群落的多样性最高，无牧条件下群落的多样性最小，而优势度指数的变化趋势和它们正相反。 （2）放牧对星毛委陵菜（或糙隐子草）种群空间格局有显著影响，即使在同一放牧强度下其种群在不同尺度上的空间格局存在显著差异。在小尺度上，植物种群主要呈现为集聚分布;同一放牧强度下随着尺度的增大，集聚分布趋向于随机和均匀分布;随着放牧强度的增大，物种的集聚分布消失的空间尺度缩短。 （3）不同放牧强度下，冷蒿和星毛委陵菜之间的空间关联存在显著的差异。在无牧和轻牧条件下，冷蒿和星毛委陵菜在小尺度（0-100cm）上主要呈负关联的空间关系，而在中牧和重牧条件下除了呈负关联的空间关系外，两个物种在空间上还是相互独立的。同时，放牧强度的增大缩小了负关联程度的峰值（最小值）。放牧强度越大，两物种之间的空间关系由负关联转变为相互独立的空间尺度越小（距离越短）。 （4）草原黄鼠鼠丘干扰显著降低了植物物种的丰富度（24种），同样，减少了不同功能组内的物种数，特别是多年生非禾本科草类减少的物种数最多;和周围的未受鼠丘干扰的植被比较，鼠丘上植物多样性减少了1.42，优势度减少了4.21，而均匀度增加了0.06;鼠丘上，多年生植物出现频率(0.37)大约是一年生植物出现频率(0.13)的四倍。具有高抗埋藏性的物种（寸草苔）和抗埋藏性的物种（冷蒿、冰草和糙隐子草）具有相对较高的出现频率。对于功能组来说，多年生非禾本科草类(PF, EF=0.51)具有最大的出现频率，接下来依次是多年生根茎禾草(PR, EF=0.46)、灌木和半灌木(SS, EF=0.32)、多年生丛生禾草(PB, EF=0.25)、一年生和两年生植物(AB, EF=0.13);鼠丘上，寸草苔的密度最大（244.43 个体/米2)。多年生非禾本科草类的密度(130.74个体/米2)远大于其他功能组的密度（PR，34.76个体/米2;PB，16.52个体/米2;AB，14.31个体/米2;SS，12.39个体/米2）;鼠丘上植被地上生物量(35.90克/米2)远远小于外围对照植被地上生物量(211.54克/米2)。冷蒿的地上生物量最大，其次是寸草苔。对于功能组，SS最大 (8.44克/米2) ，其次是PF (7.17克/米2)，这两个功能组的地上生物量远大于其他三个功能组的地上生物量（PR, PB和 AB分别是 3.23克/米2、1.40克/米2和2.49克/米2）。 （5）干扰产生空斑的拓殖受空斑大小和放牧历史的影响，植物拓殖空斑的方式随空斑形成后的时间而变化。空斑直径越大，其被拓殖的机会越大;具有高强度放牧历史群落中的空斑更易被植物拓殖;第一年对空斑的拓殖主要通过种子萌发;第二年，种子萌发方式（特别是一年生植物）拓殖空斑的比例有所降低，而通过地下根茎的克隆繁殖拓殖空斑的比例有所增加。

光系统II反应中心D1/D2/Cyt b559复合物的光谱特性及其光破坏作用的研究

采用柱层析法从菠菜叶绿体中分离纯化得到高等植物光系统Ⅱ(PSⅡ)反应中心色素蛋白复合体Dl/D2/Cyt b559，并对其性质，特别是光破坏作用的分子机理进行了研究。主要结果如下： 1、PSⅡ反应中心复合物所含的色素比大约为Chla／2 Pheo a=6.0。其四阶导数光谱在红区有两个峰，表明该反应中心至少存在两种结合状态的Chla。 2、Dl/D2/Cyt b559复合物的荧光相对产率及发射光谱的谱带位置与样品的浓度直接相关。只有当样品的浓度达到足够稀的程度(Chla和Pheo a总浓度小于1μg／ml)，才能得到较真实的荧光光谱，其峰位在681nm处。 3、Dl/D2/Cyt b559复合物的CD光谱在红区（Qy带）有一对反向谱带，正蜂为680nm,负峰为660nm，而在β-胡萝卜素的吸收区没有明显的CD信号。当该反应中心复合物受光破坏后，CD信号明显下降，而且当正峰完全消失后，负峰仍然存在，说明负峰不仅包含P680 的信号，也包含其它色素分子的信号，很可能有部分来源于Pheo a。 4、Dl/D2/Cyt b559复合物在488nm处激发的共振拉曼光谱显示四个主要谱带，其峰位分别在1532(ν1)、1165(ν2)、1010(ν3)和970cm-1（ν4）处，表明PSⅡ反应中心结合的B-胡萝卜素分子是全反式构型。Dl/D2/Cyt b559复合物的色素抽提液的拉曼光谱也显示四个主要的拉曼峰，其中ν4谱带的强度急剧下降，说明PSⅡ反应中心内部结合的β-胡萝卜素分子与抽提液中自由的β-胡萝卜素分子的构象不同，而与光合细菌反应中心内部的类胡萝卜素分子的构象相似，其共轭多烯链的平面也处于扭曲状态。 5、光照使PSⅡ反应中心的原初电子供体P680受到破坏，在光照后的暗放置过程中P680分子继续受到破坏，表明在光照过程中很可能有一个相对稳定的反应中间体产生，以至于光照后暗放置过程中Dl/D2/Cyt b559复合物的光谱特性继续发生变化。也就是说，PSⅡ反应中心Dl/D2/Cyt b559复合物的光破坏不是一步反应，而是一个多步反应或多条途径。 6、光照使Dl/D2/Cyt b559复合物中的组氨酸(His)残基受到很大程度的破坏，甲硫氨酸(Met）残基的含量也略有下降，而其它氨基酸的含量基本保持不变。His残基的破坏很可能与光照后暗放置过程中Dl/D2/Cyt b559复合物的光谱特性变化相关。我们认为His残基的光照破坏很可能是Dl/D2/Cyt b559复合物受光照破坏的另一分子机理。 7、人工电子受体癸基质体醌(DPQ)可以与Dl/D2/Cyt b559复合物进行重组。Dl/D2/Cyt b559复合物的荧光衰减分析表明，在DPQ重组之后，两个长寿命荧光组分（24ns和73ns）的寿命减小，而且占整个荧光的分数也下降，表明这两个长寿命荧光衰减组分均来源于电荷重组过程。同时，β-胡萝卜素分子在DPQ重组之后更易于被光照破坏，这个过程可能与β-胡萝卜素分子的生理功能相关。 8、在没有外加人工电子受体的情况下，光照使DDl/D2/Cyt b559 复合物的多肽组成发生一定变化。SDS-PAGE图谱中出现一个约40KDa的新谱带，同时Dl���D2多肽的表观分子量增加，谱带染色强度下降。 9、本文根据以上实验结果，着重对Dl/D2/Cyt b559复合物光破坏的分子机理进行了分析和讨论，并在D1蛋白裂解的两种可能途经中又增加了一个新的可能导致Dl���白裂解的途径，即：His残基的光照破坏可以作为Dl/D2/Cyt b559复合物光破坏及Dl���白裂解的又一分子机理，这为深入研究PSⅡ反应中心的光破坏提供了新的线索，也为今后研究活体内光抑制现象的分子机制打下了良好的基础