影响圆叶牵牛(Ipomoea purpurea)花中花青素含量的因子研究

表型是基因型和环境共同作用的结果，环境对物种进化起到了至关重要的作用。虽然人们已经知道环境因子会影响植物花青素的最终含量，但这样的影响是如何在自然环境中进行的仍是未知。较之以前泛泛研究经济作物或模式植物的花青素总含量与人工环境变量的关系的工作，本文探讨环境变化对半野生的圆叶牵牛自然状态下不同基因型植株、不同花青素的影响。 65株取自全国各地包括3种颜色8种基因型的圆叶牵牛被分别种到了温室和室外，温室32株，室外35株，用高效液相 (HPLC) 的方法检测盛花期 (07年9月-10月) 圆叶牵牛花中花青素的含量，同时每天分早中晚采集3次温室和室外的环境数据-照度、紫外线强度、温度、湿度。记录每朵花着生高度、朝向、当天植株开花数、植株根茎、植株生长天数等个体信息。 通过保留时间、紫外-可见吸收光谱数据、质谱数据以及参考文献确定了圆叶牵牛花瓣中主要的5种花青素，包括三个矢车菊素 (CY) 和两个天竺葵素 (PG)，根据它们所含的咖啡酸和葡萄糖基的个数将它们简写成CY3C4G、CY2C4G、CY3C5G、PG2C4G、PG3C5G。CY2C4G和CY3C4G仅在蓝紫色花中大量存在，PG2C4G及PG3C5G仅在粉色花中大量存在，CY3C5G在两种颜色的圆叶牵牛花中均有存在。 温室和室外的四个环境因子有显著差异，平均照度室外为温室的3.06倍，平均紫外线强度为温室的5.39倍。Z 检验表明，蓝紫色花中的CY3C5G在温室内外没有显著差异 (P=0.3070)，而温室内的CY2C4G (P<0.0001) 和CY3C4G (P<0.0001) 含量明显的低于室外，粉花中CY3C5G和PG3C5G在温室 (P=0.4533) 和室外 (P=0.9577) 没有显著差异，PG2C4G在温室内含量明显 (P=0.0003) 低于室外。 通过Kruskal- Wallis 检验,不同基因型植株各种花青素的相对含量显著不同 (P<0.0001)。室外不同基因型植株的花青素绝对含量显著不同 (P<0.0001)。温室不同基因型植株中，CY2C4G (P=0.0224) 和CY3C4G (P=0.0017) 的绝对含量显著不同，显著性比室外的低些。CY3C5G不同基因型的绝对含量有差异，但是差异不显著 (P=0.0633)。基因型对植株中各个花青素相对含量的影响是尤其显著的，基因型对于花青素绝对含量的影响，可能是基因型直接作用和不同基因型对环境差异的不同响应两方面造成的，所以在环境变异稍大的条件下，基因型更加能显示出它对花青素的含量的影响。 植株的生长天数与粉色圆叶牵牛的PG2C4G、PG3C5G以及蓝紫色圆叶牵牛的三个花青素呈一定的正相关，当天开花数对粉色花的PG3C5G以及蓝紫色花的三个花青素呈负相关，花的朝向 (北-东-南-西-北 对应数值为0-90-180-90-0)，对粉花的PG2C4G以及蓝紫花的CY2C4G和CY3C4G 呈正相关，植株大小对粉花的PG2C4G、PG3C5G以及蓝紫花的CY3C5G呈负相关。花所着生的高度对两种颜色花的影响是不同的，与蓝紫花的三个花色素呈负相关，对于粉色的PG2C4G、CY3C5G呈正相关。

缺失nifZ的棕色固氮菌突变株DJ194的钼铁蛋白研究—纯化、结晶及金属簇的组成与分布

从棕色固氮菌DJ194菌株得到的固氮酶粗提液经DEAE－52、Sephacryl S－200及Q－Sepharose等柱厌氧层析，分离纯化得到nifZ基因缺失的固氮酶MoFe蛋白（ΔnifZ Av1）制备物。通过天然电泳和SDS变性电泳发现早期纯化所得的ΔnifZ Av1制备物中残存相当比例的三个主要污染蛋白：属于热激蛋白60家族（Hsp 60 family）成员的分子伴侣GroEL、糖酵解过程的一个多功能酶——6-磷酸葡萄糖异构酶（6-Phosphate Glucose Isomerase，PGI）及棕色固氮菌细菌铁蛋白（Bacterioferritin，Bfr）。初步鉴定表明，它们分别为由约55kD亚基组成的14聚合体，62kD亚基组成的10聚体和20kD亚基组成的24聚体。首次发现PGI有如此高的聚合体。虽然GroEL和PGI在天然电泳中的迁移率小于ΔnifZ Av1蛋白，但它们的亚基在SDS变性电泳中与ΔnifZ Av1亚基具有相似的迁移率，互相重叠，从而使变性电泳比天然电泳显出更高的ΔnifZ Av1纯度;而细菌铁蛋白虽然不会在变性电泳中污染ΔnifZ Av1，但往往会在ΔnifZ Av1制备物的结晶中优先或较多地结晶出来,从而给它的晶体生长和解析研究带来干扰（Zhao等，2004）。 通过Sephacryl S－200柱洗脱峰收集精度的调整及Q－Sepharose柱的NaCl浓度梯度洗脱，得到了纯度大于90%的ΔnifZ Av1制备物。它的厌氧天然电泳及其免疫印渍（Western blotting），以及SDS-变性凝胶电泳显出，ΔnifZ Av1的电泳迁移率、分子量和亚基组成等均与野生种钼铁蛋白（OP Av1）相似，表明nifZ基因缺失并未改变ΔnifZ Av1的α2β2四聚体构成。ΔnifZ Av1的Mo含量、EPR信号（g≈4.3, 3.65和2.01）和520-660 nm附近的圆二色摩尔消光系数（Δε）也都与OP Av1较相似，从而表明ΔnifZ Av1含有与OP Av1数量相当的具有3/2自旋态的还原FeMoco。然而，ΔnifZ Av1的Fe含量和对底物（C2H2、H+和N2）的还原活性都较低, 分别约为OP Av1的74%和46-50%;而反映P-cluster状况的450nm附近的Δε也明显低于OP Av1。此外，与OP Av1相同的ΔnifZ Av1在g≈2.01的EPR信号却与推测含由双[4Fe-4S]簇组成的P-cluster前体的His-tagged ΔnifZ Av1（Hu等，2004）的信号明显不同。这就表明，ΔnifZ Av1与OP Av1的差别不在于FeMoco的结构、含量和氧还状态，也不在于P-cluster的结构和氧还状态，而仅在于ΔnifZ Av1中P-cluster数目的减少（约一半）。据此推测出与国外提出的His-tagged ΔnifZ Av1模型不同的ΔnifZ Av1(DJ194)的如下结构模型。一个αβ亚基对含有一个FeMoco和一个P-cluster，而另一个αβ亚基对只含FeMoco，其P-cluster区域则是空的。由于nifZ基因的缺失只造成了钼铁蛋白中两个P-cluster中的一个不能组装，因此推测P-cluster的组装可能不是受单一基因产物的影响。根据Lee等（1998）对nifZ产物（NifZ）和nifW产物（NifW）可以形成[NifWx-NifZy]多聚体，并可能是通过同一途径来影响固氮酶的合成的研究，提出NifZ的如下的可能作用机理。[NifWx-NifZy]多聚体影响与P-cluster合成相关的金属簇(如[4Fe-4S])的进入和P-cluster的最终合成，而其中的一个αβ对上的P-cluster的形成可能较多的受到NifZ的影响;nifZ的某些突变或缺失虽然不影响[NifWx-NifZy]多聚体的形成，但对于更依赖于NifZ的那个αβ对上的P-cluster的合成可能会产生不同的影响。 对这一高纯度的ΔnifZ Av1制备物结晶的研究表明，使用Tris缓冲系统的25%PEG 6K/MgCl2晶体培养液可以在较短的晶体培养时间内得到较大的晶体;在一定条件下，pH为7.5和8.3的培养液对出晶数和晶体大小的影响不明显;PEG 6K的浓度与MgCl2的浓度对出晶大小的影响有一定的相关性，即较低的PEG浓度在较低的MgCl2浓度下和较高的PEG浓度搭配较高的MgCl2浓度较易长出较大的晶体。虽然ΔnifZ Av1制备物的纯度达到90%以上，并且在染铁实验中表明其基本不含细菌铁蛋白，但我们在对得到的晶体进行电泳鉴定中仍然发现了一种与以前报导的砖红色晶体不同的深棕红色的细菌铁蛋白晶体，之所以颜色不同可能和所含的铁元素的氧化状态有关。不过在所鉴定的5支结晶管中只在一个管内发现了与固氮酶晶体同时存在的这种细菌铁蛋白晶体，说明通过蛋白纯度的提高减少细菌铁蛋白的含量以及晶体培养条件的优化，细菌铁蛋白晶体形成的几率就可大大降低。

转Rubisco 活化酶大型同工酶基因(rca)水稻的光合作用特性研究

Rubisco 是催化光合暗反应第一步反应的酶，是唯一能将CO2 转变成碳水化合物的酶，由它固定和最后转化成的碳水化合物提供了植物、动物和微生物的食物和能量。但是，Rubisco 催化该反应的效率十分低，使之成为光合作用的限速步骤。由于Rubisco 的合成和催化过程十分复杂，人们很难通过直接改造Rubisco 提高植物固定CO2 的能力。而Rubisco 活化酶能活化Rubisco，使植物在生理CO2 浓度下具有最大的CO2 同化速率，因此研究活化酶有重要意义。水稻活化酶有2 个同工酶，大型同工酶比小型同工酶C 端多37 个氨基酸，其中包括两个Cys 残基。这两个Cys 残基的存在使活化酶大型同工酶对ADP 的存在更加敏感，其活性在硫氧还蛋白的介导下能被基质中氧化还原状态的变化所调节。由于活化酶大型同工酶对调节Rubisco 的活性具有的这种特殊作用，在本研究中，将活化酶大型同工酶rca基因用正义和反义引入水稻基因组，获得了过量表达活化酶大型同工酶基因和反义抑制活化酶基因表达的转基因植株，对其光合作用进行了生理和生化分析。 本研究的主要结果如下： Rubisco 活化酶大型同工酶基因的克隆：从水稻镇恢249 中克隆了1525 bp 的活化酶大型同工酶cDNA 序列。经过测序，它与报道的粳稻品种活化酶大型同工酶cDNA 序列（rca）完全相同。 构建了4 个植物表达载体：3 个为过量表达rca的载体，分别是pCBUbirca，pCBSrca 和 pCBSUbirca ，其中rca分别在水稻中高效表达的玉米Ubiquitin 启动子、受光调控的Rubisco 小亚基基因启动子和由这两个启动子构成的双启动子控制下表达; 1 个在Ubiquitin 启动子控制的反义rca载体，即 pCBUbi-antirca。 获得了转化rca的水稻再生植株：用日本晴，台北309，武育梗7 号和籼稻品种培矮64S 水稻成熟种子诱导愈伤组织。用改良的农杆菌浸染法将rca基因转化这些愈伤组织，在潮霉素筛选压力下获得抗性愈伤组织，经过2 天的干燥处理后，转入到含山梨醇的高渗分化培养基上培养，能迅速获得大量的芽和转化体再生植株。 获得了转rca基因的水稻植株：抗性愈伤组织和再生水稻幼苗的叶片经GUS 染色呈蓝黑色。PCR 扩增转基因水稻基因组内的潮霉素基因和rca，大部分转基因水稻中含有841 bp 的潮霉素基因片段和1525 bp 长的rca cDNA 片段。251 粒T1 代转基因水稻种子中189粒呈现潮霉素抗性，抗性种子/非抗性种子的比率约为3：1，接近孟德尔分离规律。Southern杂交表明rca序列已整合到水稻基因组，一般含1－2个拷贝。Western 杂交显示Rubisco 活化酶含量在转pCBUbi －antirca 的水稻中和对照比，几乎看不出，被反义抑制;转pCBUbirca 的水稻与对照含量相差无几;转pCBSUbirca，pCBSrca 载体的水稻中活化酶的含量比对照有极显著的增加。 T1 代转rca水稻的光合作用发生显著变化：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻在饱和光强下的Rubisco 初始活性、羧化效率、光合速率都明显高于对照，但是表观量子效率、色素含量和Rubisco 总活性与对照相似。两者相比，前者比后者更高;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻饱和光强下的光合速率、表观量子效率、羧化效率、Rubisco 初始活性明显降低，色素含量和Rubisco 总活性基本不变;转pCBUbirca 的水稻中，光合作用的各项参数与对照基本相似。 T1 代转rca水稻的叶绿素荧光明显改变：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻ΦPSII 的值明显高于对照，而且前者qP 的值明显高于对照。两者相比，前者的ΦPSII 和qP 的值比后者高;转反义rca的水稻ΦPSII，F′v/F′m，qP 值和对照比都明显降低，但qN 的值升高;转pCBUbirca 载体的水稻中，叶绿素荧光的各项参数与对照基本相似。 转rca基因的水稻生长发育的变化：转pCBUbirca 载体的水稻整个生长发育过程与对照相似;转化pCBSrca 和pCBSUbirca 载体的水稻和对照比，植株高大，生长发育速度加快，抽穗、开花和结籽的时间提前。两者本身相比，前者比后者明显;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻生长发育延迟，植株矮小，种子败育。 由上可见，Rubisco 活化酶大型同工酶rca基因在Rubisco 小亚基基因启动子、Ubiquitin 基因启动子和Rubisco 小亚基基因启动子共同控制下正义转入水稻的转基因植物光合作用的参数最好，光合效率提高，植物表型最好，生长发育加快，提前开花结籽。这一研究可能为获得高光合效率和高产量的水稻奠定了基础。

南海北部区域表层水微生物多样性及其分布特点研究

海洋中的微生物多样性是十分丰富的。南海北部区域表层水的微生物群落结构及物种多样性情况仍不十分清楚。本研究，采用构建基因克隆文库的方法，对该区域内表层水中的微生物多样性及分布特点进行研究。获得了8000多个细菌16S rDNA基因、真核微生物ITS 区基因及光合微型生物 psbA 基因单克隆。本研究结果表明：在南海北部区域表层水中存在两种不同微生物类群，即近海岸带海洋微生物类群和开阔海域海洋微生物类群。 16S rDNA基因克隆文库中，确定了507个OTUs。93.7% 的16S rDNA 序列定义在同一种水平上，1.4 %的16S rDNA序列定义在同一属的水平上，2.7%的16S rDNA序列定义在同一纲的水平上，1.2%的16S rDNA序列定义在同一门的水平上。值得一提的是有0.7%的南海表层水样品的16S rDNA 序列，属于目前数据库中的未知序列。系统育树分析表明这类序列可归属于4个不同的分枝群。与Venter’s Sorcerer II 海洋科考（马尾岛海域）的结果不同，南海北部区域表层水中，并没有发现SAR11分支细菌、丝状杆菌（Fibrobacter）和Rheinheimera细菌序列，但南海北部区域却发现了马尾岛海域未检测到的物种，如酸杆菌门、恐球菌-栖热菌门、厚壁菌门，硝化螺旋菌门，浮霉菌门以及疣微菌类细菌。除疣微菌外，其他5种细菌都是海洋环境样品中较为常见的细菌。变形菌门、蓝细菌及厚壁菌门细菌序列是南海北部表层样品16S rDNA基因克隆文库中的主要类群。 真核生物如浮游植物和海洋真菌是海洋表面生物质的主要组成部分之一。现有的研究多集中在环境样品的原核微生物的群落结构研究上，很少关注海洋微型真核生物的多样性及群落结构分布。本研究通过构建ITS基因克隆文库的方法，得到了3044条ITS序列，最终定义了1288个OTUs。其中，329个OTUs序列定义在同一种水平上，310个OTUs序列定义在同一属或纲的水平上，123个OTUs序列定义在同一门的水平上。值得注意的是有339个OTUs的序列，属于目前数据库中的未知序列。系统发育树分析表明它们分别归属于4个不同的分枝群。这表明以往对海洋真核微型生物的多样性仍知之甚少。盘菌亚门、体腔动物门和担子菌纲是南海北部表层样品ITS基因克隆文库中的主要类群。此外，在南海北部区域还发现了少数归属于绿藻、链形植物、定鞭金藻类、放射虫类、Stramenopiles、Typhlocoela、壶菌类、多孢囊霉目、子囊菌门、地位未定的物种、 酵母、领鞭毛虫门、不可培养的后生动物和海绵动物的ITS序列。 海洋初级生产力主要是依靠光合微型浮游生物进行光合作用完成的。利用新设计的psbA通用引物，对南海北部33个表层水样滤膜进行基因克隆文库建库分析，最终获得了南海北部区域表层水微生物多样性及其分布特点研究3062条部分psbA基因序列，并将其划分为957个 OTUs。其中蓝细菌和未培养的病毒序列在psbA基因库中的数量最多。本研究还发现了南海北部区域存在11个独立分支的新型psbA类群。研究证实psbA基因可以作为一种研究海洋光合微型浮游生物群落结构的指示基因。 克隆文库相似性分析发现，在所有的16S rDNA克隆文库中没有任意两个站点的克隆文库相似性超过50%。虽然N401和N420站点的16S rDNA克隆文库相似性最大，但它们在地理位置上并不接近。一些地理位置接近的站点，其16S rDNA克隆文库之间相似性比较接近。比如，海南岛区域的克隆文库之间就比较相似，且在同一分支。大多数地理环境相似的站点的16S rDNA克隆文库都聚在同一大分支上。例如，来自于珠江口区域站点的克隆文库之间的相似性比较接近，而且分布在一个大分支中；开阔海洋区域的16S rDNA克隆文库，也大多聚类在同一分支中。但也有例外的情况：比如 N107 和N400 站点的16S rDNA克隆文库，就聚类到一起，分析发现这两个文库中所处的环境都是甲烷产生区，其中都含有相似的与甲烷代谢相关的菌群。不过从整体来看，整个南海北部的细菌群落，大致分为两大类：中国大陆近海岸微生物群落和开阔海域微生物群落。33个ITS克隆文库的相似性分析发现：相似性在10%以下的类群，可以分成两大分支，而且该分类，比细菌群落的分布情况更接近南海北部的地理环境特征。对psbA基因克隆文库的相似性分析也验证了在南海北部区域表层水中存在两种不同微生物生态系统。 此外，本研究针对分子生态专业软件DOTUR程序在处理大量克隆文库数据时所遇到的

Saccharibacillus kuerlensis sp nov., isolated from a desert soil

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Fragmentation effects on diversity of wasp community and its impact on fig/fig wasp interaction in Ficus racemosa L.

Habitat fragmentation usually results in alteration of species composition or biological communities. However, little is known about the effect of habitat fragmentation on the fig/fig wasp system. In this study, we compared the structure of a fig wasp community and the interaction between figs and fig wasps of Ficus racemosa L. in a primary forest, a locally fragmented forest and a highly fragmented forest. Our results show that, in the highly fragmented forest, the proportion of pollinator wasps is lower and the proportion of non-pollinator wasps is higher compared with the primary forest and locally fragmented forest. The proportion of fruits without pollinator wasps in mature fruits is also greatly increased in the highly fragmented forest. The proportion of galls in all female flowers increases in the highly fragmented forest, whereas the proportion of viable seeds does not change considerably. The disruption of groups of fig trees results in a decrease in pollinator wasps and even might result in the extinction of pollinator wasps in some extreme cases, which may transform the reciprocal interaction between figs and fig wasps into a parasite/host system. Such an effect may lead to the local extinction of this keystone plant resource of rain forests in the process of evolution, and thereby, may change the structure and function of the tropical rain forest.

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