稻属Oryza officinalis复合体基因组研究－兼论基因组原位杂交的原理和方法

稻属（Oryza L.）属于禾本科稻族（Oryzeae Dumortier）。本属包括AA，BB，BBCC，CC，CCDD，EE，FF，GG，HHJJ和HHKK十个基因组，二十余种。其中Oryza officinalis复合体包括BB，BBCC，CC，CCDD和EE五个基因组，九个种。众多的学者对该复合体进行了广泛深入的研究，为后续研究奠定了坚实的基础。然而，迄今为止，多倍体物种形成问题许多没有解决，基因组间的关系尚未完全阐明，甚至有些多倍体物种的基因组组成仍未确认。 本文评述了Oryza officinalis复合体中基因组研究的历史和现状，用基因组原位杂位（GISH）的方法，对该复合体四倍体物种的基因组组成作了验证;对B，C，D和E四个基因组间的关系进行了研究。同时对基因组原位杂交的方法，原位杂交鉴定多倍体基因组的组成以及研究基因组间关系的方法作了一些探讨。其主要研究结果如下： 一. 原杂交方法的研究：1）染色体制片：比较研究了不同的制片方法，发现压片法适用于大染色体的材料;将酶解/空气干燥法（Fukui et al., 1992）加以改进后，特别适宜于小染色体植物材料的制片。2）根尖储存时间和条件对原位杂交的影响：发现在-20 ℃的酒精（70%）中储存8个月以内的根尖材料，可用于原位杂交;而在-20 ℃的固定液中储藏18个月的根尖，DNA降解严重，不能用于GISH。3）探针标记：比较了随机引物法、缺口平移法和两步标记法（先用随机引物标记后，再用缺口平移法进行标记的方法）的优缺点。结果显示两步标记法是最佳标记方法。 二. GISH鉴定异源多倍体的方法：用两个异源四倍体Oryza minuta和Scilla sinensis (2n = 34)做染色体制片，进行原位杂交实验，结果表明：1）用二倍体亲本基因组之一做探针而不用封阻DNA， 可以鉴别Oryza minuta而不能鉴别Scilla sinensis中的基因组。2）用一个二倍体亲本做探针而用另一个做封阻，能够区分Scilla sinensis的两个基因组;但过量的封阻DNA将可以造成一些实验假象。3）同时用两个亲本的DNA做探针，不仅能够有效分辨不同的基因组，还能够根据交叉杂交程度推测基因组间的分化程度，是鉴别异源多倍体最有效的方法。 三. GISH鉴定稻属四倍体的基因组组成：1）Oryza minuta, O. punctata和O. malampuzhaensis的基因组的组成都为BBCC。2）Oryza minuta中B基因组和二倍体O. punctata中的B基因组之间存在着明显的基因组内分化。3）O. alta是一个异源多倍体，其基因组组成为CCDD。但C和D之间的分化不彻底，可以认为它不是一个严格意义上的异源多倍体。 四. GISH研究B，C，D和E基因组间的关系：1）B基因组和C基因组之间的关系最远;E和C之间的分化同E和B之间的分化程度接近，但E和C之间的分化比E和D之间的分化要小一些;C和D之间的分化不彻底，关系最近。

松属植物rRNA基因的变异模式及其进化生物学意义

被子植物的rRNA基因已经得到深入研究。二倍体被子植物一般拥有1-4对18S-5.8S-26S rDNA位点和1-2对5S rDNA位点。作为特殊的多基因家族成员，rDNA会受均一化力 (homogenizing forces) 的作用，通过基因转换、不等交换等机制，形成基因的致同进化 (concerted evolution)。长期以来，我们一直认为动植物rDNA致同进化水平很高，各种拷贝的序列几乎完全一致，因此可以直接应用PCR测序的方法进行分子系统学研究。但是在裸子植物中由于研究资料的匮乏，使我们对裸子植物rDNA的变异模式了解甚少。松属植物作为裸子植物的最大类群，它的rDNA变异和进化有何特点、与被子植物是否相同，是这个重要类群的进化研究中目前尚未解决的问题。本文的研究内容从三个方面进行： (1)rDNA的染色体定位 目前，松属的18S-5.8S-26S rDNA的染色体定位研究只包括5种植物，其中的3种同时涉及到5S rDNA定位。这些研究结果表明，不同种存在相异的rDNA位点数目，甚至不同的个体的rDNA位点均有变化。其共同点是，18S-5.8S-26S rDNA位点数平均较被子植物多，5S rDNA除Pinus radiata外，在其它种里则与被子植物相似。这种现象是松属或裸子植物的共同特征，亦或是特例呢？有限的研究限制了对裸子植物rDNA的了解。本研究的目的之一就是研究松属植物rDNA的染色体空间分布特征，希望借此了解松属植物间的关系，比较裸子植物和被子植物rDNA在染色体组水平的差异。 (2)5S rDNA的分子进化 5S rDNA的序列水平的进化研究在松属中尚属空白。5S rDNA在染色体数目上没有显示裸子植物与被子植物的差异，是否意味着松属乃至裸子植物的5S rDNA也同被子植物一样——致同进化完全，序列高度一致呢？利用克隆测序方法对松属植物5S rDNA的研究无疑是有开创性的工作，可以探讨裸子植物的5S rDNA的进化机制和种间关系。 (3)杂种基因组研究 杂交物种的起源演化是当前生物学研究的热点，通过杂种基因组的研究，可以了解杂种的的基因组构成，组织方式和进化历史，探讨杂交事件对成种过程的影响及意义。这项研究涉及到高山松、云南松和油松。之所以采用这三种植物，因为等位酶、cpDNA和mtDNA证据证明高山松为油松和云南松的自然杂交种。但这些证据不足以反映杂种核基因组的重组特征和构成及其进化规律。我们利用rDNA-FISH、5S rDNA和基因组原位杂交分析三种松树间的基因组关系，为揭示高山松的进化机制和历史提供新的依据。 本项研究得到以下结果： 一. rDNA荧光原位杂交 (FISH) 通过对华山松和白皮松两种单维管束亚属植物及油松、云南松、高山松、马尾松和南亚松等五种双维管束亚属植物的18S rDNA与5S rDNA的荧光原位杂交，结果表明： ⑴ 裸子植物的18S rDNA位点数目明显多于二倍体被子植物。其中主要位点数目，油松有7对，高山松5对，云南松8对，马尾松10对，南亚松6对，白皮松3对，华山松10对，平均在7对;另外，部分松树还存在弱位点。无论强弱位点都有部分存在于染色体的着丝粒区，除了赤松 (Pinus densiflora)，在其它松科植物中并没有发现这种现象。究竟是基因转移的结果或该位点是18S rDNA的原始起源位置还有待确证。 ⑵ 5S rDNA位点相对变异较小，与被子植物相当。除了华山松5S rDNA有4对位点，马尾松只有1对位点外，其它松树的5S rDNA位点数目均为2对，并且在双维管束亚属植物中有一对属于弱位点。 ⑶ 两种rDNA存在不同连锁模式。双维管束亚属植物中，5S与18S rDNA连锁在同一染色体的同一臂或两条臂上。在同一染色体臂时，18S rDNA在臂的远端。单维管束亚属植物的5S与18S rDNA或连锁于同一染色体的同一臂上，或分别处于不同染色体。前一情况，5S rDNA位于臂的远端。据此可以说明两个亚属的rDNA结构在染色体组水平的很大分化。 ⑷ 松属植物的关系及高山松核型特征。由于5S与18S rDNA连锁关系的不同，可以将单维管束亚属和双维管束亚属分开。各亚属的不同物种可以依据杂交位点的多少、位置、信号强弱构成的核型图加以区分，并且构成一定的系统关系。杂交起源的高山松在染色体组上，表现出对油松和云南松两亲本不同染色体特征的分别继承与重组，并产生独有的特征。其II同源染色体之一18S rDNA位点的缺失，可能是染色体重组的痕迹。 二. 5S rDNA的序列变异与分子进化 利用分子克隆和DNA测序分析了油松、云南松、马尾松、白皮松和不同遗传背景的高山松居群的5S rRNA基因序列变异及基因进化规律，得到以下主要结果： ⑴ 5S rDNA的结构特征。双维管束亚属植物长度在658-728 bp，白皮松则为499-521 bp。长度差异体现在基因间隔区，而基因区极端保守，基本为120 bp。基因转录区内部存在着转录控制区，决定了5S rRNA的转录起始与转录效率。5S rRNA基因能够折叠成正常的二级结构，其中，相对于干区来说，环区要保守，但环E却表现出异乎寻常的变异，转换/颠换比值高达7.1，这种突变可能是假基因的产物。基因间隔区存在一定的保守单元，其中一些与转录的起始和终止调控相关，有些是裸子植物未知功能的特异保守区。 ⑵ 松属植物5S rDNA存在着基因组内与种间的异质性。基因组内的各个克隆中有超过80%的特异的，彼此不相同。整个5S rDNA分化距离为0.042 - 0.051，其中，间隔区的分化比基因区高，其速度约是基因区的3-7倍。比较种间5S rDNA序列发现：在122个克隆中，基因区只有50个特异的序列。基因组间的序列变异度与基因组内 (个体内) 没有明显差别。白皮松的间隔区与双维管束亚属松树的5S rDNA间隔区差异极大，几乎不能排序，而四种双维管束亚属植物的5S rDNA间隔区种间种内差异不大。 ⑶ 松属植物5S rDNA进化。PAUP分析建立的5S rRNA基因树显示，5S rRNA基因在基因组内是多系的 (polyphyletic)，表明成种事件以前，祖先种就已经存在序列的分化。观测到的5S rRNA基因序列变异状况，并非完全是致同进化或独立进化的单一因素造成的，而是二者的相互作用的结果。致同进化确实存在，只是速度较慢而已。 ⑷ 高山松5S rDNA 组成。高山松拥有最高的基因组内的序列多样性，高山松的5S rDNA拷贝既有亲本类型，又有重组类型，并且不同地理及遗传来源的高山松显示一定的分化趋势，有更多的拷贝来自母系亲本。 三. 基因组原位杂交 以油松和云南松总DNA作为探针，相互进行基因组原位杂交，结果显示云南松和油松的染色体组可以完全被对方探针标记，在现有基因组原位杂交的分辨率下不能将两个基因组区分开。说明云南松和油松基因组之间存在高比例的同源序列，两种松树的基因组组成十分相似。利用油松和云南松总DNA作为探针，对高山松的染色体组进行双探针基因组原位杂交。结果表明，高山松全部基因组都能与两亲本探针完全杂交，说明三者间有着异乎寻常的亲缘关系。但在PH失调影响下，高山松只有部分基因组被杂交，并且两种探针的杂交信号有轻微差异。这可能是高度重复序列优先杂交的结果。这些情况表明，高山松虽然在基因组构成上与两个亲本基本一致，但基因在染色体组的空间排布上是存在差异的，这一点可以从rDNA-FISH中证明。

A COMPARATIVE-STUDY OF KARYOTYPES OF MUNTJACS BY CHROMOSOME PAINTING

We have used a combination of chromosome sorting, degenerate oligonucleotide-primed polymerase chain reaction (DOP-PCR), chromosome painting and digital image capturing and processing techniques for comparative chromosome analysis of members of the genus Muntiacus. Chromosome-specific ''paints'' from a female Indian muntjac were hybridised to the metaphase chromosomes of the Gongshan, Black, and Chinese muntjac by both single and three colour chromosome painting. Karyotypes and idiograms for the Indian, Gongshan, Black and Chinese muntjac were constructed, based on enhanced 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) banding patterns. The hybridisation signal for each paint was assigned to specific bands or chromosomes for all of the above muntjac species. The interspecific chromosomal homology was demonstrated by the use of both enhanced DAPI banding and comparative chromosome painting. These results provide direct molecular cytogenetic evidence for the tandem fusion theory of the chromosome evolution of muntjac species.

Evolution of the black muntjac (Muntiacus crinifrons) karyotype revealed by comparative chromosome painting

The black muntjac (Muntiacus crinifrons) has an unusual karyotype of 2n = 8 in females and 2n = 9 in males. We have studied the evolution of this karyotype by hybridising chromosome-specific paints derived from flow-sorted chromosomes of the Chinese muntjac (M. reevesi, 2n = 46) to chromosomes of the black muntjac. The hybridisation pattern allowed us to infer chromosomal homologies between these two species. Tandem and centromeric fusions, reciprocal translocations, and insertions are involved in the reduction of the diploid number from 2n = 46 to 2n = 8, 9. The painting patterns further show complex chromosomal rearrangements in the male black muntjac which involve more than half the karyotype, including both sex chromosomes. Since early meiosis is reported to be normal without any visible inversion loops of the synaptonemal complex, the observed chromosomal rearrangements would lead to heterosynapsis and, therefore, leave a large fraction of the male black muntjac karyotype balanced between the two sexes.

Comparative molecular cytogenetic studies in the order Carnivora: mapping chromosomal rearrangements onto the phylogenetic tree

We have made a set of chromosome-specific painting probes for the American mink by degenerate oligonucleotide primed-PCR (DOP-PCR) amplification of flow-sorted chromosomes. The painting probes were used to delimit homologous chromosomal segments among human, red fox, dog, cat and eight species of the family Mustelidae, including the European mink, steppe and forest polecats, least weasel, mountain weasel, Japanese sable, striped polecat, and badger. Based on the results of chromosome painting and G-banding, comparative maps between these species have been established. The integrated map demonstrates a high level of karyotype conservation among mustelid species. Comparative analysis of the conserved chromosomal segments among mustelids and outgroup species revealed 18 putative ancestral autosomal segments that probably represent the ancestral chromosomes, or chromosome arms, in the karyotype of the most recent ancestor of the family Mustelidae. The proposed 2n = 38 ancestral Mustelidae karyotype appears to have been retained in some modern mustelids, e.g., Martes, Lutra, ktonyx, and Vormela. The derivation of the mustelid karyotypes from the putative ancestral state resulted from centric fusions, fissions, the addition of heterochromatic arms, and occasional pericentric inversions. Our results confirm many of the evolutionary conclusions suggested by other data and strengthen the topology of the carnivore phylogenetic tree through the inclusion of genome-wide chromosome rearrangements. Copyright (C) 2002 S. KargerAG, Basel.

Comparative map between the domestic pig and dog

Cross-species chromosome painting with probes derived from flow-sorted dog and human chromosomes was used to construct a high-resolution comparative map for the pig. In total 98 conserved autosomal segments between pig and dog were detected by probes specific for the 38 autosomes and X Chromosome of the dog. Further integration of our results with the published human-dog and cat-dog comparative maps, and with data from comparative gene mapping, increases the resolution of the current pig-human comparative map. It allows for the conserved syntenies detected in the pig, human, and cat to be aligned against the putative ancestral karyotype of eutherian mammals and for the history of karyotype evolution of the pig lineage to be reconstructed. Fifteen fusions, 17 fissions, and 23 inversions are required to convert the ancestral mammalian karyotype into the extant karyotype of the pig.