由农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

过氧化氢（Hydrogen peroxide,H2O2）是植物和病原微生物互作中快速合成的一种早期活性氧类（reactive oxygen species, ROS ），它在植物受到病原微生物侵染后引发的一系列防御反应中起着非常重要的作用，因此通过外源基因导入提高植物体内过氧化氢的含量，可以增强植物的广谱抗病性。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase, GO）可以催化β-D-葡萄糖氧化生成过氧化氢和葡萄糖酸，此酶已在数种细菌和真菌中检测到，但在植物和动物中仍未发现。为了尝试将此酶应用于水稻广谱抗病基因工程，本研究将葡萄糖氧化酶基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建为水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza sativa )品种日本晴(Nipponbare)成熟胚来源的愈伤组织和幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得到的潮霉素抗性植株的Southern杂交分析表明GO基因已整合到受体基因组,为单拷贝或双拷贝插入。利用过氧化氢与淀粉-碘化钾反应显蓝色的特性检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能，这是将GO基因转入单子叶植物的首例报道。 基于过氧化氢诱导的植物防御反应没有种属专一性的优点，可以预期所得转基因水稻植株很可能对水稻的多种病原菌具有良好的抗性。已完成的抗病性鉴定表明，所得转基因水稻植株对稻瘟病具有良好的抗性。

水稻OsRAA1基因的克隆与功能分析

FPF1（flowering promoting factor1）蛋白最早在白芥中研究发现是开花促进因子, 可能参与了赤霉素的信号传导途径。它可以和AP1和LFY蛋白协同作用，促进茎顶端分生组织向花分生组织转化。本论文将AtFPF1基因转化水稻，转基因水稻抽穗时间只有微弱的提前。然而异源表达AtFPF1却抑制了转基因水稻根的生长，促进了成苗根系的发达。这些表型类似于我们克隆的水稻OsRAA1 （Oryza sativa Root Architecture Associated 1）的功能。这是首次报道AtFPF1/OsRAA1在水稻中具有控制根系发育的功能 生物信息学分析表明水稻OsRAA1基因定位于水稻1号染色体，它编码的蛋白推测分子量为12kD和AtFPF1有58%的同源。通过RNA原位杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的模式，证实OsRAA1基因主要在根尖的顶端分生区和伸长区，根尖分支区和幼侧根的中柱，侧根的原基表达。同时在幼穗分支顶端，根茎结合区的边周维管束，稃片，花药与花丝的结合区也有表达。OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，部分植物形成不同程度螺旋状的初生根。这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似。OsRAA1组成型表达，在成苗阶段，特别是孕穗前，大大促进叶片伸长，并导致部分小花败育。光学镜检表明OsRAA1组成型表达的水稻的花丝伸长过快，部分小花花药萎缩败育。剑叶表面细胞电镜扫描表明，OsRAA1组成型表达的水稻剑叶的硅化细胞比对照植株要长。野生型水稻根系生长素处理的Northern杂交和OsRAA1基因启动子调控GUS基因表达的水稻生长素处理后GUS活性染色表明，OsRAA1基因的转录受生长素诱导。而且OsRAA1组成型表达的水稻根的向地性反应减缓。这些结果表明，OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。 与此同时，从基因序列数据库中，在很多植物中寻找到很多表达片段和FPF1/OsRAA1基因同源。从已有报道和我们的结果表明，在植物中可能普遍存在一个受赤霉素和生长素调控FPF1/OsRAA1基因家族，调控着植物各个器官的发育。

利用反义RNA技术进行木质素生物合成调控的研究

木质素是一类酚类次生代谢产物，在植物体内行使重要的生理功能，但它却是形成造纸污染的主要来源。利用基因工程手段，在分子水平调节木质素的生物合成，降低木质素的含量或改变组分以培育适合造纸的植物原料树种具有较大的应用价值和环保效益。本研究利用反义RNA技术，主要围绕木质素合成三种相关酶咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）、咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶(CCoAOMT)、4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL）的基因对植物木质素生物合成途径调节的研究，取得如下进展： 1.农杆菌介导法将COMT和CCoAOMT基因的单价和双价的反义表达载体导入烟草，比较了两个甲基化酶的功能。PCR-Southern和Northern点杂交结果表明反义基因已整合到烟草基因组DNA上，并在转录水平表达。两种反义基因对木质素生物合成调节的效果显示，CCoAOMT能更有效地调节木质素生物总量的合成，COMT仅特异调节S木质素的合成。表达反义CCoAOMT基因的转基因毛白杨，内源CCoAOMT基因的表达在转录和蛋白水平均受到抑制，最终引起转基因植株木质素含量普遍降低，最多降低达26.20%，筛选出木质素含量下降10%以上的转基因毛白杨株系8个，为源头治理造纸废水污染奠定了基础。 2． 对克隆的4CL基因进行了表达特性分析， RT-PCR分析表明，分离的毛白杨4CL基因主要在木质部丰富表达，叶中表达量较少，树皮中不表达。在毛白杨的一个生长季，该基因表达显示明显的双锋特征，该表达模式与木材早材和晚材的发育时期相吻合，表明分离的毛白杨4CL基因与木质素的生物合成密切相关。农杆菌介导法将反义4CL基因导入烟草和毛白杨，利用分子生物学检测手段对转化植株进行筛选，获得批量转基因植株。Klason木质素含量测定分析表明，抑制内源4CL基因表达，能有效降低转基因植物中的木质素含量，且不影响植株正常生长和发育以及碳水化合物的合成。转基因毛白杨的茎杆上一些区域呈红棕色，颜色的深度与转基因毛白杨木质素含量的下降幅度呈一定的正相关性，颜色变化可作为转基因植株筛选的一个辅助指标。现已获得木质素含量下降10%以上的转基因株系3个，最多下降达41.73%，可供中试与制浆实验，为培育低木质素环保型毛白杨提供理论与实践依据。 3.为了优化现有的表达框架，使目的基因更有效地调节木质素的生物合成，应用PCR技术从毛白杨基因组中分离得到C4H(肉桂酸4—羟基化酶)基因启动子片段（GenBank注册号：AY351673）。GUS荧光活性分析和组织化学染色显示，该启动子在一些木质化的组织和器官中特异表达，随着组织成熟度和木质化程度的增加，表达活性逐渐增强，并且该启动子受伤诱导。反义CCoAOMT基因在C4H启动子的调控下，会引起转基因烟草木质素均有不同程度的减少，但不影响碳向碳水化合物的转换合成，对植物的生长发育也无明显负效应。这些结果证明了从毛白杨中分离的C4H 启动子可以应用于造纸原料树种材性改良的遗传工程操作。 4．首次从水稻中华10号（Oryza sativa L. ssp. japonica）分离了CCoAOMT基因家族的三个成员，对其基因结构及表达特性的分析表明，该基因家族的三个成员与水稻的木质化进程关系密切，研究结果有助于了解单子叶植物中的甲基化途径发生机制，为高产水稻抗倒伏和茎杆饲料作物的遗传改良奠定了基础。

一种小G蛋白TaRAN1在植物细胞周期和发育过程中的功能研究

　　小G蛋白作为信号转导中重要的分子开关， 进化相当保守，与许多不同的调控因子和效应器分子相互作用，产生细胞功能的多样性。近年来，人们不断发现植物中小G蛋白家族的新成员，也不断揭示小G蛋白的新功能，许多植物特有的信号途径和功能需要小G蛋白这个重要的分子开关来完成，使它越来越成为人们研究的热点问题。但是，有关植物中Ran GTPase及其编码基因的研究工作报道很少，对与之相互作用的调控蛋白研究进展也刚刚开始。 　　TaRAN1 (AF488730) 是小麦来源的Ran同源蛋白编码基因，全长1055 bp, 编码221个氨基酸，它在植物发育过程中的功能还没有任何报道。本论文在验证了它是小G蛋白Ran家族的成员后，从分子水平上还发现它在植物细胞周期调控、对生长素以及胁迫应答信号转导过程中都起着重要作用，这也说明了它可能作为信号转导过程中重要的转换因子，参与了很多细胞的基本生理过程。 　　利用原核表达系统及亲和色谱的方法纯化了TaRAN1融合蛋白，并用放射性标记的GTP和竞争实验证实了它具有特异的GTP结合活性。TaRAN1的转录产物在小麦幼茎和花芽等分生组织活动旺盛的器官表达较多，而在老叶中表达较少。利用洋葱表皮瞬时表达系统分析表现，TaRAN1蛋白主要定位于细胞核，但其没有典型的核定位信号。 　　细胞周期一直是生物学领域中的热门问题，人们虽然在动物细胞中取得了很大进展，但在植物细胞中的研究远落后于动物。裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是研究细胞形态和细胞周期的良好系统，利用此系统发现超表达TaRAN1的酵母细胞表现出许多新的细胞学表型，例如G2细胞周期延滞、染色体对紫外线敏感、细胞超长或多隔细胞的出现等;反义表达TaRAN1的酵母细胞呈近圆型、具有高度凝集的核并且生长速度缓慢、核质混合和无核细胞的数目明显增加。流式细胞仪检测实验也证实其细胞周期的异常。这些结果推测TaRAN1蛋白可能参与细胞周期的有丝分裂过程和发育的调控机制，并且在维持染色体结构稳定和完整性方面起着重要的作用。通过免疫荧光实验观察表明，超表达转基因酵母的微管多呈异常的狭小扇形结构，反义表达TaRAN1的酵母微管不能形成丝状结构，推测TaRAN1还可能参与微管（包括纺锤体）的结构形成过程。最后，我们用超表达TaRAN1的转基因拟南芥和水稻也证实了它的功能，其生长点表现出分生组织增多的原基、根生长点的有丝分裂指数有所改变、出现异常的细胞分裂时相等有关细胞周期异常的现象，更进一步说明了TaRAN1确实参与着细胞周期的调控过程，推测其与细胞周期从G2期进入M期的过程有关。 　　TaRAN1基因受IAA的诱导表达，且随着浓度的增加表达量增强。超表达的TaRAN1植株（包括拟南芥和水稻）的根表现出对外源生长素异常敏感，侧根显著变少，地上部分表现出生长素过量的表现型，顶端优势减弱，分蘖增多，生长周期延长等。HPLC测定转基因植物的IAA含量，明显高于对照。所以，TaRAN1可能还参与了复杂的生长素信号转导过程。TaRAN1基因还受各种胁迫处理的诱导表达，并且超表达植株对胁迫的忍受能力有明显提高，这说明TaRAN1还参与了胁迫信号应答的相应机制。Ran蛋白这些新功能目前还未见到其它报道。

植物络合素合酶基因的功能分析及其应用

植物络合素（phytochelatins，PCs）是含有γ-Glu-Cys重复结构的小分子多肽，其结构通式为：（γ-Glu-Cys）n-Gly（n=2-11）。植物络合素（PCs）由植物络合素合酶（PCS）催化谷胱甘肽（GSH）聚合而成，能够络合重金属离子而具有解毒功能，这是植物解毒重金属胁迫的重要机制之一。本文克隆了来源于重金属抗性植物绊根草（Cynodon dactylon cv Goldensun）的植物络合素合酶基因，通过基因工程手段使其在烟草中过量表达，得到了一些有望用于植物修复（phytoremediation）的工程植株。同时，在水稻（Oryza sativa）种子中利用RNAi技术抑制植物络合素合酶基因的表达，以降低重金属离子在人类最重要的粮食作物水稻的籽粒中的积累。 1. 通过RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）方法从抗性植物绊根草中克隆了植物络合素合酶基因CdPCS1，其1515 bp的读码框编码一个含505个氨基酸的蛋白质，蛋白质序列分析表明它具有植物络合素合酶的结构特征，同时还具有磷酸化位点和亮氨酸拉链结构。 2. CdPCS1基因可以互补对铜和镉离子敏感的酵母突变株ABDE-1（cup1Δ）中缺失的金属硫蛋白基因CUP1的功能，也可以互补对砷离子敏感的酵母突变体FD236-6A（acr-3Δ）中的离子外排载体基因ARC3的缺失。 3. 将CdPCS1转入烟草，共获得过表达CdPCS1的烟草44个株系，其中融合GFP的株系16个。对T0代的转基因植株的PCs含量以及重金属抗性和吸收能力进行了分析，其中抗性实验表明，在300μmol/L 的Cd2+离子胁迫11天之后，野生型植株的叶片出现斑点状坏死，而两个转基因烟草株系S6和K49的植株没有出现受伤害症状。在100μmol/L的CdSO4处理一周后，转基因植株中的PCs含量比对照有不同程度的提高，最多提高了2.88倍。当用300μmol/L Cd2+处理9天再用600μmol/L Cd2+处理2天后，Cd的积累量比野生型植株增加了2倍多;用50μmol/L As3+处理7天再用100μmol/L As3+处理2天后，转基因植株对As的积累量最多增加了3倍多。说明转入绊根草PC合酶基因的烟草增加了植物络合素的合成，并由此增加了对镉离子的抗性以及对镉离子和砷离子的积累。 4. 对转基因烟草中的CdPCS1进行了亚细胞定位研究。在激光共聚焦显微镜和荧光显微镜下分别用转基因烟草叶片组织和叶肉细胞原生质体观察融合GFP的CdPCS1，结果表明融合蛋白定位于细胞核中。 5. .利用RNAi技术抑制水稻种子中植物络合素合酶基因的表达，共获得39个转基因株系。其中35个株系为种子特异性ZMM1启动子驱动OsPCS1基因的RNAi，其余4个株系由组成型的Ubiquitin启动子驱动。RT-PCR的分析结果表明：一个由ZMM1启动子驱动的RNAi转基因水稻株系的种子中，OsPCS1的mRNA水平比对照中的下降了一半。

OsRMC基因调控水稻根生长发育的机理研究

实验室前期工作证明OsRAA1在玉米泛素启动子驱动下组成型表达，可以抑制水稻初生根的生长，促进不定根的形成，形成不同程度螺旋状的初生根，根的向地性反应减缓，这些表型和野生型水稻用生长素处理的表型类似，而且OsRAA1基因的转录受生长素诱导，这些结果表明OsRAA1可能参与了生长素的信号转导途径。但这些表型产生的机理还不是很清楚。在水稻中，茉莉酸在根发育过程中的作用多为生理实验的报道;拟南芥中的研究表明生长素信号转导和茉莉酸信号转导可能都受26S蛋白酶体的调控。由此我们推测茉莉酸在根的发育过程中可能也起着同样的促进作用。本论文在超表达OsRAA1水稻基础上旨在克隆新基因，并对新基因功能进行研究，以探讨茉莉酸在水稻根发育过程中的分子机理，并对生长素和茉莉酸信号转导的关系进行探讨。 　　首先运用双向电泳技术结合质谱分析技术，在超表达OsRAA1水稻背景下发现了受体激酶家族DUF26的一个成员明显下调，我们命名为OsRMC（Oryza sativa Root Meander and Curling，AAL87185），Western杂交进一步证明了这个结果。 　　OsRMC位于4号染色体，信息学分析表明只有一个拷贝，没有内含子，ORF阅读框为777bp，编码的蛋白分子量为27.9 kDa，等电点（pI）为5.01。对该蛋白进行同源性比较发现，其含有2个C-X8-C-X2-C基序（Cys-rich repeat, CRR）即半胱氨酸富集区，其中第四个半胱氨酸残基不保守，该基序会形成二硫键，编码两个未知功能的DUF26（Domain Unknown Function 26）结构域。OsRMC由一个信号肽和两个CRR区组成，但没有跨膜区和激酶区。RT-PCR显示OsRMC可能是组成型表达的基因;亚细胞实验表明OsRMC是膜定位的蛋白。Western blot显示OsRMC受茉莉酸诱导表达，受生长素的抑制。 　　RNAiOsRMC转基因水稻在暗处培养时，抑制了初生根的生长，使侧根数目减少，但促进了不定根的生长和数目的增加;第二叶鞘变短，这些表型和前人报道的外源茉莉酸处理野生型的表型一致。转基因对生长素信号转导和合成没有影响，但初生根和第二叶鞘对外源茉莉酸更加敏感，说明RNAiOsRMC转基因水稻可能增强了茉莉酸信号转导途径。分析转基因水稻的茉莉酸信号转导途径部分相关基因的表达变化，根中受茉莉酸信号转导特异诱导的病原相关基因RSOsPR10的表达明显增多，而JAmyb和OsNDPK1的表达没有变化，证实转基因增强了茉莉酸信号转导其中的一个路径;进一步分析茉莉酸合成途径12-OXO-PDA（12-氧代-顺，顺-10，15-植物二烯酸）还原酶基因OsOPR的表达发现与野生型没有明显差别，说明转基因可能没有影响体内的茉莉酸合成途径。RNAiOsRMC转基因水稻的初生根比野生型的更容易发生弯曲，实验表明培养过程中茉莉酸和背触反应（negative thigmotropism）共同作用使转基因的初生根更容易发生卷曲，而光信号会增强卷曲程度。但RNAiOsRMC转基因水稻并没有影响根的向地性，暗示RNAiOsRMC转基因可能增强了根的回旋运动或（和）背触反应，从而促进了根的弯曲和卷曲。这些结果证明OsRMC参与的茉莉酸信号转导过程在水稻根的发育、弯曲和卷曲过程中起着重要的促进作用。通过对超表达OsRAA1和RNAiOsRMC转基因水稻的分析，说明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径。 　　综合以上实验结果认为，OsRAA1调控了受体激酶家族DUF26的一个成员OsRMC，使其表达量降低，该过程增强了茉莉酸信号转导途径;确认了受体激酶家族DUF26的基因具有重要的生物学功能，证实了OsRMC调控的茉莉酸信号转导在水稻根系发育、根弯曲和卷曲过程中具有重要的促进作用;证明水稻中存在着生长素信号转导促进茉莉酸信号转导的途径，为完善各种植物激素调控水稻根系发育的网络提供了新的实验证据。 　　 　　

水稻中一个编码富含脯氨酸蛋白基因家族的表达和功能研究

OsPRP1是水稻中特有的，编码一类富含脯氨酸蛋白（proline-rich protein, PRP）的基因家族，该家族有4个成员。在GenBank中，仅找到了一个结构相对接近的玉米PRP蛋白，但是对它的研究仅限于序列上的某些描述，而且在序列上，仍然与这4个OsPRP1蛋白有明显的差别。OsPRP1蛋白明显有别于前人（1999）所描述的4类PRP蛋白。它们是植物中一类新的小分子量的PRP蛋白，仅有一个保守结构域而属于DUF1210蛋白超家族的成员。 四个OsPRP1基因在基因组中紧密串联排列，而且编码区高度保守，基因结构也高度一致，证明它们来源于同一个祖先基因，是通过基因复制的方式产生的。PAML分析也证明它们在进化时间上的相互距离并不远。而在进化过程中由于执行生理功能上的某种重要性，在编码区表现出很的保守性，因而很难在RNA水平和蛋白水平上研究四个OsPRP1基因的表达差异。但是它们在表达调节区（如启动子区）显示出明显的差异。在克隆启动子的基础上，用GUS报告基因的策略，没有检测到它们在拟南芥中的表达活性，说明它们具有一定的种属特异性。而在水稻中，这四个基因的表达显示出了明显的时序和空间差异，既表现出在组织器官及其发育阶段上的特异性和变化，又在一定程度上表现出交叉，出现了功能上的分化和重叠。根据启动子区上的顺式元件，检测了这些基因对6种植物生长调节物质和3种非生物胁迫因子的应答反应，证明它们的表达调节也表现出显著的差异和分化。因此，四个基因的进化出现了功能退化、亚功能化和产生新功能等多种命运，比理论模型预期的要复杂得多，可能在执行生理功能和对环境反应上具有各自的生物学意义。 植物细胞壁是多种碳水化合物和蛋白质相互交织在一起的亲水性网络。在保护和支撑原生质、细胞通信、细胞分化、细胞对生物的和非生物胁迫的抗性等方面发挥着重要作用。目前已知的大多数植物PRP蛋白被描述成细胞壁结构性蛋白。OsPRP1基因家族编码的蛋白质都有一个N-端信号肽，暗示它们可能是一类分泌蛋白。我们用OsPRP1.1::GFP融合蛋白进行了亚细胞定位，证明了OsPRP1蛋白的确也是细胞壁相关蛋白。用原核表达体系表达了GST-融合蛋白，制备抗体，通过免疫印迹证明这些蛋白不溶于温和的提取缓冲溶液中，但可以被高盐和强碱溶液溶解，且分子量增加了三倍。证明在体内可能出现修饰、与细胞壁其它组分相交联的现象。 在这四个基因中，只有OsPRP1.2能够在水稻根中特异表达。根的原位杂交实验证明，OsPRP1在分化成熟程度低的细胞中大量表达，而在分化成熟程度高的细胞中几乎不表达。GUS染色的结果同样发现，基因在维管柱特别是中柱鞘附近的薄壁细胞的表达比别的细胞要强得多，而且在根的生长方向上表现出与发育相关的表达特征。说明OsPRP1基因可能参与了这些细胞的分化、发育过程。而基因表达的组织器官特异性的差异和对不同刺激因素的不同反应意味着它们可能参与了多种生理过程。为此构建了一个RNAi的表达载体，转化水稻，Southern杂交实验得到9个单位点插入的T2代独立株系，其中有6个株系与野生型对照相比，主根的早期伸长受到显著抑制，主根的一级侧根地数量减少，根尖分生区的细胞在轴向上的伸长受到了抑制。结合表达定位和原位杂交的结果，我们对它们在植物生长发育中的功能进行了深入探讨。

水稻RAD21/REC8家族基因的分离与功能分析

染色体黏着是有丝分裂和减数分裂的关键事件，是保证姊妹（或同源）染色体正确分离并分配到子细胞中的关键调控环节之一，它建立于细胞分裂前的S期将新复制的姊妹染色体紧密联系在一起。来自酵母的研究结果已经证明姊妹染色体之间的黏着是由多亚基的蛋白质复合体－黏着素所介导的。在芽殖酵母有丝分裂中，黏着素由Scc1，Scc3，Smc1和Smc3四个亚基组成。减数分裂黏着素的组成与有丝分裂中的相似，只是Scc1被其减数分裂特异的Rec8变体所替换。目前，已经从高等真核生物线虫，果蝇，人，鼠以及拟南芥中分离到了黏着素相关的基因，但是对于这些基因在高等真核生物特别是植物细胞分裂中的功能还知之甚少。即使在酵母中人们对于减数分裂和有丝分裂过程中有关染色体黏着与分离的许多基本问题仍然不清楚，而且许多现象表明减数分裂的详细机制在各种生物中存在重大差异。 我们通过同源克隆的方法证明水稻（和拟南芥）基因组编码4个RAD21/REC8-like基因。这4个基因均以单拷贝存在，在核苷酸水平上没有相似性。它们所编码的蛋白质的相似性主要局限于其N-末端结构域和C-末端结构域。这4个蛋白质的中间区域没有（或者仅有极低的）相似性，但是中间区域都含有潜在的核定位信号，PEST序列，分离酶的识别序列以及多个磷酸化位点。 半定量RT-PCR，原位杂交以及Western杂交结果显示这4个基因都在生殖器官中优势表达，但是它们在花发育过程中的表达动态是不同的。OsRAD21-1和OsRAD21-3都在减数分裂时期的颖花中表达量最高，但是OsRAD21-3还在成熟花粉中高表达;OsRAD21-4在减数分裂前的颖花中表达量最高;OsRAD21-2则在雌雄蕊形成时期表达最强，之后逐渐降低。这些结果暗示这4个基因的功能可能是不同的。 免疫荧光定位分析表明，OsRad21-1和OsRad21-3 特异地定位于有丝分裂的染色体上，其分布动态表明这两个蛋白可能都参与了有丝分裂姊妹染色体之间的黏着。由于水稻四个RAD21/REC8类基因中，只有OsRAD21-3在花粉发育过程中表达，同时水稻花粉的发育成熟要经过两次有丝分裂，推测OsRad21-3蛋白可能参与这两次有丝分裂过程姊妹染色体之间的黏着。OsRad21-4则特异地定位于减数分裂前间期到中期Ⅰ的染色体上，说明它可能特异地介导减数分裂过程姊妹染色体之间的黏着。与其它已知的Rad21/Rec8-like蛋白不同，不论在有丝分裂还是在减数分裂过程中，OsRad21-2蛋白都不定位于染色体上而是特异地定位在核仁中，并且它的动态变化与核仁重建和解体的动态规律在时间上也是相一致的，这说明OsRad21-2是一种新的核仁蛋白质而与染色体的黏着无关。 OsRAD21-4 RNAi转基因水稻植株的花粉活性受到严重影响，种子结实率降低。雄性减数分裂过程中染色体出现多种异常行为：前期Ⅰ染色体异常凝集;同源染色体提早分离;染色体出现片断化。进一步的FISH实验结果证明RNAi株系中同源染色体配对和姊妹染色体臂的黏着均发生异常。因此，OsRad21-4是酵母Rec8的同源蛋白，是正确的减数分裂所必需的。 与表达分析和功能分析所得的结果相一致，进化树分析可以将Rad21/Rec8-like蛋白质分为三个亚家族：（1）Rad21亚家族，参与有丝分裂姊妹染色体黏着;（2）Rec8亚家族，参与减数分裂染色体黏着;（3）Rno亚家族，目前仅发现于高等植物中，是一种核仁蛋白质而与其它的Rad21/Rec8-like蛋白的功能不同，可能不参与染色体之间的黏着。

OsLIC1基因参与水稻株型调控的功能研究

CCCH型锌指蛋白是进化上比较保守的一类锌指蛋白家族，其典型的氨基酸的基序为C-X7-8-C-X5-C-X3-H，其中X为任意氨基酸，这类锌指基序一般以重复的双拷贝形式存在。本论文克隆并鉴定了一个全新的、只含有一个CCCH型锌指基序的基因，利用反义RNA策略研究该基因功能，结果发现该基因的反义转基因植株表现出叶夹角增大的表型，因此我们将该基因命名为OsLIC1（Oryza sativa Lamina Increased Leaf Angle Control 1）。生物信息学分析发现该基因定位于水稻6号染色体近端粒的一端，位于BAC克隆AP004324中。OsLIC1与通常的CCCH型锌指蛋白含有多个重复的CCCH锌指基序不同，它只含有一个CCCH型锌指基序。除了CCCH锌指结构域以外，该蛋白在靠近C-端的位置还有一段丝氨酸（Ser）富集的区域，在此区域之前，还有一个在真核生物中相对保守的，以EELR为核心基序的结构域。采用基因枪将含OsLIC1-GFP融合构建的瞬时表达载体轰击入洋葱内表皮细胞，激光共聚焦显微镜观察发现OsLIC1-GFP可以定位到细胞核中。利用酵母转录激活系统发现以EELR为核心基序的结构域具有转录激活的功能。体外核酸结合活性分析显示OsLIC1蛋白可以结合双链DNA，这些结果证明OsLIC1是一个转录因子，这也是在植物中首次发现CCCH型锌指蛋白可以作为转录因子的方式调节基因的表达。 用玉米泛素启动子（Maize Ubiquitin promoter）驱动OsLIC1基因的反义表达载体转化水稻，获得的内源OsLIC1基因表达量下降的转基因植株表现出三个明显的表型：转基因植株的叶夹角增大;转基因的株高低于对照以及转基因植株的穗粒数减少。扫描电镜观察发现转基因植株叶夹角增大是由于近轴面细胞排列发生了改变以及维管束发育受阻引起的。转基因植株的Southern Blot和RT-PCR分析，结合Western Blot分析证明了转基因植株的表型与转基因事件之间的直接联系，并证明了转基因植株中内源OsLIC1在蛋白水平的确受到了抑制。采用RT-PCR技术、Promoter：：GUS和RNA in situ杂交三种方法相结合研究OsLIC1基因的表达模式，结果表明OsLIC1基因主要在叶颈、节以及分蘖原基中表达，这与转基因植株的表型相吻合，进一步证明了转基因植株的表型与基因功能之间的关系。Affymetrix 水稻全基因组芯片分析结果显示许多受油菜素内酯诱导表达的基因在转基因植株的叶颈材料中表达量上调，RT-PCR进一步验证了这一结果。由于在转基因植株中出现的叶夹角增大的表型和水稻油菜素内酯的作用相似，而基因芯片的结果又从分子水平提供了证据和线索。进一步采用RT-PCR和Promoter：：GUS相结合的方法研究OsLIC1基因对油菜素内酯的响应，结果发现OsLIC1基因可以被油菜素内酯诱导表达。而且，OsLIC1基因的反义转基因植株与野生型相比，表现出对油菜素内酯信号更敏感的响应。根据以上结果，推测OsLIC1可能是水稻油菜素内酯信号转导途径的负调控因子。水稻油菜素内酯合成和信号转导的突变体d2-1和d61-1具有直立的叶片的特征。用反义OsLIC1转基因植株以及野生型水稻与d2-1和d61-1突变体分别进行遗传杂交，结果发现在反义OsLIC1转基因植株与d2-1和d61-1突变体的杂交F1代中，都表现出叶夹角增大的表型。但是，在F2代中，在d2-1和d61-1纯合背景下，分别表现出叶夹角增大和叶片直立的表型，说明OsLIC1上位于d2-1，而d61-1则上位于OsLIC1。这一结果进一步证明了OsLIC1是通过参与水稻油菜素内酯信号调节而发挥对水稻叶夹角的调控作用。

水稻减数分裂基因OsDMC1的功能研究

减数分裂是有性生殖物种世代交替的转折点;减数分裂不仅维持了基因组的稳定性，而且通过重组创造了遗传多样性。在减数分裂过程中，DNA复制一次后进行两次连续的细胞分裂。第二次减数分裂与有丝分裂类似，涉及到姊妹染色单体的分离;而第一次减数分裂是独一无二的，在这次分裂中同源染色体分离。为保证同源染色体的准确分离，同源染色体在减数分裂前期I通过一系列复杂的过程结合在一起形成稳定的二价体。这些复杂的前期I事件包括同源配对、联会和重组。分子遗传学、细胞学和生物化学研究已经表明酵母DMC1基因在减数分裂重组、配对和联会过程中起了重要作用。OsDMC1基因是酵母DMC1基因在水稻中的同源基因。本课题应用RNA干扰技术分析了该基因在水稻生长发育过程中的功能。利用本实验室设计的RNAi工具载体pWTC605构建OsDMC1-RNAi载体;并通过农杆菌介导的水稻愈伤组织转化法获得了转基因株系;进而通过PCR和Southern杂交鉴定筛选出阳性的OsDMC1-RNAi株系。OsDMC1-RNAi株系的营养生长正常，但结实率显著降低;成熟花粉的Alexander染色显示这些OsDMC1-RNAi株系的花粉是败育的。通过内源OsDMC1基因表达量的半定量RT-PCR、Western杂交分析以及OsDMC1特异性small RNA的Northern杂交鉴定，证实OsDMC1-RNAi株系的不育表型与RNA干扰介导的内源OsDMC1 mRNA和蛋白水平的降低是相关的。进一步深入的细胞学观察显示，OsDMC1基因的knockdown导致OsDMC1-RNAi株系的雄性减数分裂异常，表现为二价体形成缺陷、染色体不等分分离和异常四分体的产生;OsDMC1基因的knockdown同时还诱导了雄性减数分裂进程的改变。荧光原位杂交实验揭示OsDMC1-RNAi株系的减数分裂同源配对过程是缺陷的。这些研究结果表明OsDMC1基因是水稻减数分裂的必需基因，该基因在减数分裂同源配对过程中起了重要作用。

水稻AP2/EREBP转录因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析

AP2是一个大的转录因子家族，因其成员含有一个60-70 个氨基酸残基的保守结构域即AP2结构域而得名，它们的功能涉及植物花的发育以及植物对生物或非生物逆境的应答反应。根据它们所含的AP2 结构域的数目，这个家族可分为AP2亚家族和EREBP 亚家族。 AP2亚家族成员含两个AP2结构域，EREBP 亚家族成员含一个AP2结构域。一般来说，AP2 亚家族的成员主要参与植物发育过程的调控;EREBP 亚家族成员则主要参与对逆境的应答反应。按照它们响应外界刺激的类型和AP2结构域中结合顺式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亚家族又可分为ERF和CBF/DREB两大类群，ERF 类主要响应生物类逆境的诱导，CBF/DREB类则响应干旱、低温等非生物胁迫的刺激。 根据AP2保守结构域搜索，水稻基因组中一共有147个AP2/EREBP成员，但其中功能得到证实的还非常有限。为了解更多AP2基因在植物生长发育过程中的功能，我们先从水稻基因组数据库中搜索到含有AP2/EREBP 结构域的推测基因序列，选择其中40个扩增并成功扩增出31个，将这些DNA片段点在尼龙膜上，然后用水稻叶片cDNA 作模板标记探针，与固定在膜上的推测基因杂交。杂交结果作为选择基因进行功能分析的重要依据。 OsDRE就是我们选择进行研究的一个表达较强的基因。首先，通过RACE 克隆得到OsDRE 的cDNA全长 1589bp，它编码318个氨基酸。Blast 搜索和保守结构域序列比对分析以及进化树分析显示它是一个新的ERF 基因。RT-PCR分析表明该基因在水稻各种组织中表达量比较一致，而且，OsDRE 既不对植物生长物质如乙烯，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯（MJ），脱落酸（ABA），赤霉素（GA3），油菜素内酯（BR）的诱导起反应，同样也不响应环境因子如低温、干旱条件的处理。这些结果说明OsDRE是一个不响应胁迫相关因素的诱导的、组成型表达的水稻基因。用OsDRE的非保守区域构建的RNAi 载体转入水稻后未能使转基因水稻产生异常表型，然而，OsDRE在水稻和拟南芥中的过量表达都导致转基因植物出现植株矮小、开花延迟、生长周期延长以及育性降低等表型，说明OsDRE对生长和发育的影响在水稻和拟南芥中是一致的。 基于以上原因，我们选择在遗传分析方面有明显优势的拟南芥作为材料，对OsDRE基因功能进行研究并得出以下结论：（1）瞬时表达和随后的过量表达证明OsDRE定位于细胞核中，过量表达OsDRE引起转基因植株的生长周期变长、抽苔时间延迟和抽苔时莲座叶的数量增多;（2）过量表达OsDRE通过一种不影响细胞数量的方式抑制了细胞的膨胀从而导致植物器官以致整个植株变小，而且，在此过程中部分器官的形态也受到了影响;（3）OsDRE过量表达能激活已知位于乙烯信号途径下游的基因表达并且转基因植株幼苗在黑暗中出现下胚轴及根缩短变粗的现象，提示OsDRE 可能部分参与了乙烯信号途径下游的反应。 除此之外，我们还初步分析了另一个EREBP基因，并将其命名为OsRAF。氨基酸序列分析表明该基因与大麦的RAF 基因在蛋白水平上相似性最高。Northern 杂交结果进一步显示，与RAF 一样，OsRAF 也是根中优势表达的基因，并且它的表达量在乙烯或低温的诱导下增加。对转基因植株的观察和瞬时表达表明OsRAF 定位于细胞核中。 综上所述，对水稻基因OsDRE 和OsRAF的分析表明， OsDRE是一个新的ERF基因，它不受乙烯等因素的诱导并且过量表达该基因导致转基因植株出现细胞膨胀受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中优势表达并受乙烯和低温的诱导，目前，与之相关的功能研究正在进行。

水稻RAD21/REC8家族基因OsRAD21-3的功能研究

有丝分裂和减数分裂包含一系列协同作用的事件，姊妹染色体的黏着是其中非常重要的一个环节。通过对芽殖酵母的研究发现姊妹染色体的黏着是由一个多亚基的蛋白复合体——黏着素介导的，在有丝分裂过程中，黏着素由Scc1（裂殖酵母中为Rad21）、Scc3、Smc1和Smc3四个亚基组成，而在减数分裂中Scc1被其同源蛋白Rec8所取代。通过对其它真核生物包括线虫、果蝇、爪蟾、鼠、人以及拟南芥等进行的研究显示，黏着素介导的姊妹染色体黏着的基本机制在真核生物中具有保守性，但在不同的物种中，其具体的分子机制还存在着差异。开花植物的有性生殖过程包含了一个非常特殊的花粉发育阶段，其间发生了两次花粉的有丝分裂，对其我们还知之甚少。Rad21/Rec8作为黏着素的重要组分，对水稻中它的同源蛋白进行深入研究可以帮助我们对植物有丝分裂和减数分裂的染色体黏着机制有进一步的了解。 我们发现在水稻基因组中存在4个编码Rad21/Rec8家族蛋白的基因，其中OsRAD21-3位于水稻第8号染色体上，其编码的蛋白与其它的Rad21/Rec8家族蛋白一样，具有保守的N-和C-末端结构域。序列比对和进化分析的结果表明OsRad21-3蛋白属于Rad21亚家族，而免疫荧光定位分析显示OsRad21-3可以特异地定位于有丝分裂的染色体上，由此说明OsRAD21-3应当是酵母RAD21的直系同源基因。对OsRAD21-3进行半定量RT-PCR，Western杂交以及原位杂交的结果显示它在生殖器官花中优势表达，在营养器官中也能检测到表达。在花中它在从雌雄蕊形成期到成熟花粉期都有表达，其表达的位置主要位于减数分裂时期的小孢子母细胞以及减数分裂后的小孢子和花粉中。在水稻四个RAD21/REC8基因中，OsRAD21-3是唯一一个在花粉发育过程中表达的基因，说明它可能在减数分裂后的雄配子体发育过程中发挥了功能。 采用RNAi手段对OsRAD21-3的功能进行研究发现OsRAD21-3 RNAi转基因水稻植株的育性显著下降，进一步的分析表明其花粉活性受到严重影响。对OsRAD21-3i株系的雄性减数分裂过程及减数分裂后的小孢子和花粉发育过程进行观察发现，减数分裂过程中有少量细胞存在染色体的异常行为，但总体上没有对雄性减数分裂造成严重影响，而减数分裂后的小孢子和花粉发育过程则出现了显著异常，表现为花粉有丝分裂的停滞或有丝分裂染色体分离的扰乱，因此，OsRAD21-3应当主要是通过在花粉的有丝分裂过程中发挥功能而参与减数分裂后的雄配子体发育过程，而它在雄性减数分裂过程中可能也有一定作用。 利用原位杂交技术分析了水稻另外三个RAD21/REC8基因的表达特性，结果表明OsRAD21-1、OsRAD21-2和OsRAD21-4都在减数分裂前及减数分裂期的小孢子母细胞中表达，但在减数分裂后较晚时期的小孢子中则没有检测到表达。OsRAD21-4在小孢子母细胞中的表达为其参与减数分裂过程染色体的黏着提供了证据，而OsRAD21-1和OsRAD21-2在此过程中的功能还有待进一步研究。此外，OsRAD21-1和OsRAD21-2还在营养器官有丝分裂旺盛的区域表达，OsRAD21-1作为RAD21的同源基因可能与OsRAD21-3在参与有丝分裂染色体黏着方面存在功能上的冗余性，但OsRAD21-3参与花粉的发育过程则是其所特有的，这可能也在一定程度上说明了为什么水稻中会存在4个RAD21/REC8基因，并帮助我们更好地了解了它们在功能上的分化。

水稻中OsERD2和OsRAA1基因的功能分析

内质网中一些可溶性蛋白含有Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）基序作为内质网滞留的信号，这些内质网滞留蛋白可以离开内质网进入高尔基体进行糖基化修饰。目前的研究表明，KDEL基序可以被滞留蛋白受体识别，通过反向运输途径将其运回内质网。ERD2是第一个在酵母中被鉴定的内质网滞留蛋白受体。在人、拟南芥、弓形虫等生物中也鉴定出类似的内质网滞留蛋白受体。ERD2在拟南芥中的同源基因aERD2受内质网胁迫信号的诱导，在水稻中还未见该类受体的报道。 本工作从水稻中克隆到ERD2的同源基因OsERD2。OsERD2的cDNA全长为1081bp，编码一含215个氨基酸的蛋白。OsERD2与酵母、拟南芥、人中的内质网滞留蛋白受体的同源性分别为43.38%、72.56%、54.42%。疏水性分析显示该蛋白具有7个跨膜区；OsERD2呈组成型表达模式；亚细胞定位显示OsERD2主要分布于高尔基体中；利用酵母互补实验证明OsERD2可以恢复酵母erd2缺失突变体的表型。这些结果表明，OsERD2是水稻中的内质网滞留蛋白受体。 借助农杆菌介导的转化将OsERD2在水稻中超表达，分析转基因水稻对二硫苏糖醇（DTT）处理的响应。结果显示DTT处理抑制水稻幼苗生长，超表达OsERD2株系受抑制程度更为明显。表明OsERD2转基因水稻对内质网胁迫更加敏感。因此，OsERD2可能参与了水稻中的未折叠蛋白响应。 本论文还比较分析了OsRAA1/AtFPF1的一些新功能。OsRAA1（Oryza sativa root architecture associated 1）是拟南芥AtFPF1在水稻中的同源基因，参与水稻根发育的调控。我们将OsRAA1在拟南芥中异源超表达，发现OsRAA1的积累使转基因拟南芥的开花时间提前，同时发现在白光条件下转基因拟南芥的下胚轴长度增加。进一步分析表明，在蓝光、远红光和黑暗条件下转OsRAA1拟南芥下胚轴长度和野生型没有明显区别，但在红光条件下，转基因拟南芥的下胚轴长度是野生型的两倍。AtFPF1转基因拟南芥也表现出类似的表型，说明RAA1/FPF1蛋白不但可以调控拟南芥开花时间而且参与红光对下胚轴生长的光抑制过程，它们在进化过程中保留了这两个方面的功能。

水稻OsMYB3R-2 基因对逆境响应的功能研究

低温威胁水稻的生产，其中苗期和生殖阶段对寒害是最敏感的时期。在苗期，阶段性冷害使水稻幼苗生长延迟，甚至造成烂秧现象；在生殖阶段，无法预测的突然降温会导致水稻花粉不育，并致使水稻大幅减产。因此，对水稻逆境胁迫调控的分子机制的深入研究在理论和实践上具有重要的意义。本研究从东乡野生稻、栽培稻及其杂交后代的低温芯片中筛选对低温响应基因的分析着手，对其中一个受低温诱导上调的基因OsMYB3R-2 作进一步研究。生物信息学的分析表明OsMYB3R-2 编码一个R1R2R3 MYB 蛋白，利用基因枪瞬时转化法、酵母GAL4 系统和电泳迁移率变动分析发现OsMYB3R-2 蛋白能够定位在细胞核中、具有转录激活和DNA 结合特性，表现为MYB 转录因子的典型特征。 超表达OsMYB3R-2 的转基因水稻呈现幼苗的矮化和生长相对滞后的表型，对低温胁迫具有耐受性。盐抑制水稻种子的萌发，与野生型和反义的株系相比，OsMYB3R-2 超表达株系的萌发对盐敏感，表现为萌发过程及萌发之后幼苗的生长更加滞后。而OsMYB3R-2 转基因株系对干旱处理敏感。为了进一步寻找OsMYB3R-2 蛋白的靶序列及其调控的靶基因，我们利用电泳迁移率变动分析发现OsMYB3R-2 能够与有丝分裂特异的激活子（mitosis-specific activator）元件特异结合。在低温条件下，OsMYB3R-2 超表达能够激活水稻G2/M 期特异基因的表达，主要包括OsCycB1;1、OsCycB2;1、OsCycB2;2 和OsCDC20.1 等。另一方面，OsMYB3R-2 超表达能够增加根尖细胞的有丝分裂指数，这进一步说明OsMYB3R-2 参与了水稻细胞周期调控。EMSA、RT-PCR 和流式细胞仪分析的结果表明OsMYB3R-2 通过激活其靶基因OsCycB1;1 的表达参与水稻对低温胁迫的调控，该过程由细胞周期介导。 为了研究OsMYB3R-2 与水稻DREB/CBF 途径的关系，我们分析了转基因水稻中DREB/CBF 类基因及其可能调控的下游基因与OsMYB3R-2 的关系，RT-PCR 的结果表明超表达转基因植物中DREB 表达未见明显变化，而其下游基因OsCPT1 在低温条件下被激活表达。同时，转基因植物在低温条件下脯氨酸水平显著提高。这说明OsMYB3R-2 可能在水稻DREB/CBF 途径的下游参与调控。 总之，OsMYB3R-2 基因的超表达赋予转基因水稻在苗期对低温胁迫具有耐受性，并呈现矮化和生长滞后的表型。OsMYB3R-2 蛋白行使R1R2R3 MYB 转录因子的功能，在体外能够结合OsCycB1;1 和OsKNOLLE2 基因启动子中有丝分裂特异的激活子元件，在低温条件下激活了G2/M 期特异基因的表达，这些基因包括OsCycB1;1、OsCycB2;1、OsCycB2;2 和OsCDC20.1。低温条件下，在OsMYB3R-2 转基因超表达株系中OsCPT1 基因的转录被激活，细胞的游离脯氨酸的含量也显著增高。这些结果都表明OsMYB3R-2 基因在水稻的冷胁迫信号途径中起重要的作用，该过程受细胞周期及DREB/CBF 途径介导。 我们的实验结果暗示水稻对低温的耐受是通过分生组织细胞周期调控完成的，这个过程由OsMYB3R-2 等关键基因控制。

水稻灌浆期籽粒与 胚乳发育的蛋白质组学分析

籽粒的灌浆是将光合器官合成的有机物贮存在籽粒中的过程。这一过程直接决定了籽粒的产量及品质。先前研究表明灌浆籽粒中贮存物质的累积是各种代谢活动和细胞学过程协同作用的结果，但灌浆的分子机制目前还不是非常清楚。水稻是研究籽粒灌浆的优良模式材料，不仅因为它是世界上最重要的淀粉食物来源，更重要的是其全基因组的测序完成为分子机制的研究带来极大的便利。我们对发育水稻籽粒的观察表明在开花后6 天，籽粒就已完成了胚的分化和胚乳的细胞化；此后籽粒经历了一个显著的细胞增大过程，并在开花后12 天左右达到成熟籽粒的大小；而籽粒的灌浆过程起始于开花后6 天，这个过程一直持续到开花后20 天。因此，我们将开花后6 天到20 天的籽粒分为8 个连续的发育阶段进行动态的蛋白质组分析，396个蛋白点的表达在灌浆过程中发生了两倍以上变化。质谱鉴定得到的345 个差异表达的蛋白划分为10 个不同的功能类别。其中新陈代谢类（45%）和蛋白合成/终点（destination）类（20%）两个功能类别中就包括了大多数的差异表达蛋白，预示着这两类蛋白在籽粒发育中的重要性。蛋白功能群的表达分析显示与淀粉合成和乙醇发酵相关的蛋白在发育过程中大幅度的上调，而与碳代谢中心过程（糖酵解和三羧酸循环）相关蛋白呈现明显的下调趋势。大多数的功能类或（亚类）也呈现出下调的表达趋势，如细胞生长/分裂类，蛋白合成类，水解类，信号传导类和转录类。蛋白表达分析的结果表明蛋白的表达随籽粒的发育发生了显著的变化，这些变化与籽粒在不同阶段的发育和代谢过程密切相关并协调一致，是细胞从生长分裂过渡到以淀粉合成为中心的物质基础。同时也说明代谢重点由中心碳代谢向乙醇发酵的转变对于籽粒的发育和淀粉的合成与累积具有重要意义。 籽粒发育的研究表明在长到成熟籽粒大小后（开花后12 天），籽粒的代谢集中到淀粉累积途径上，一直持续到进入脱水期（18 天），绝大多数淀粉合成相关蛋白在这期间到达表达的顶点。为了解淀粉累积关键时期淀粉合成关键部位（胚乳）的发育规律，我们进一步应用DIGE 技术对这一淀粉累积关键时期（灌浆中后期，开花后12 到18 天）的蛋白表达特性进行分析。细胞学的观察发现胚乳在灌浆后期先后经历了过氧化氢的爆发、半透明胚乳的形成以及胚乳细胞死亡事件。相应的DIGE 分析显示有321 个蛋白点在胚乳的后期发育中发生了显著的表达变化。细胞学的观察结合DIGE 分析显示胚乳的后期发育是一个典型的衰老过程：细胞结构的崩溃；氧化自由基的爆发；脱水干燥；蛋白、脂类和DNA 由同化作用向异化作用的代谢转化。与代谢转化相伴随的细胞营养的重新分配是胚乳后期发育的一个显著过程。DIGE分析全面展示了参与营养重新分配相关蛋白在后期发育中的表达变化，为细胞学中观察到的有机物向淀粉的转化提供了清晰的蛋白水平的证据支持。在鉴定的差异表达蛋白中有2/3 的蛋白是已知的对氧化电位变化敏感的蛋白，表明由H2O2 爆发形成的氧化压力将引起氧化还原调控从而对胚乳的后期发育进行全面的影响。而其中与碳元素代谢相关的代谢途径中尤其富含氧化还原电位敏感的蛋白，表明后期的营养重新分配以及淀粉的累积受到氧化还原电位的紧密调控。另一方面，H2O2 的爆发激发了胚乳中的抗氧化体系。由抗氧化蛋白（如thioredoxin、抗坏血酸和超氧化物歧化酶等）、氧化还原敏感蛋白、代谢中间产物以及glyoxalase 构成的抗氧化体系在胚乳后期发育中协同作用调节氧化还原电位的变化，从而控制胚乳细胞衰老的节奏。另外，我们发现与RraA 相关的转录本的调控在胚乳发育末期急剧上调，在调控的代谢途径、调控时间以及调控的部位与氧化还原调控相重叠，并且支持RraA 活动有利于胚乳细胞对氧化压力的适应。所有这些结果表明内生的过氧化氢（或氧化自由基）在胚乳的后期发育和淀粉累积中起到核心的调控作用。