三叶木通花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物最关键的创新（innovation）性状。在被子植物的不同类群中，其形态多种多样，尤其以基部真双子叶植物的花形态最为丰富。大量的系统发育分析表明，在核心真双子叶植物起源之前，几个与花发育相关的MADS-box基因亚家族均发生了大尺度的基因重复事件。因此，在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，并且它们经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。基部真双子叶植物，作为基部被子植物和核心真双子叶植物之间的过渡类群，对于我们理解被子植物花的进化，揭示核心真双子叶植物花的起源以及基部真双子叶植物花多样性分化的分子机制非常重要。本文以基部真双子叶植物三叶木通为研究材料，着重进行了以下研究工作： 1. 花器官发生过程的观察。三叶木通的花为雌雄同序的单性花。而且，根据成熟花的形态，三叶木通的雌花和雄花都只有一轮花被器官，即三个花瓣状的萼片。扫描电镜的观察结果表明：1）在花器官的发生和发育过程中，在萼片和雄蕊原基之间，确实没有花瓣原基或另一轮萼片原基发生。2）雌花和雄花都是以两性花的方式发生发育的。3）单性花是由于在花发育的最后阶段，雌花中雄蕊或者雄花中心皮的退化而产生的。 2. 花发育相关基因的克隆。应用5’/3’ RACE的方法，我们从三叶木通不同发育阶段的混合花芽中共分离到九个与花发育相关的MADS-box基因： AktFL1、AktFL2、AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3、AktPI、AktAG1、AktAG2和AktSEP3。 3. A类MADS-box基因的进化。由于A类基因在进化过程中序列结构的改变，再加上取样的限制，使得A类基因间的进化历史一直不能被很好的理解。因此，本文对A类基因的研究从构建该基因亚家族的系统发育树开始。主要结果如下：1）通过扩大在基部真双子叶植物和被子植物其它重要类群的取样，我们的系统发育树基本上反映了现存被子植物的系统发育关系。2）核心真双子叶植物的A类基因由三个分支组成：euFUL、euAP1和AGL79，它们是通过发生在核心真双子叶植物起源之前的两次几乎同时的基因重复事件产生的。3）在基部真双子叶植物中，山龙眼目、毛茛目和黄杨科的A类基因各形成一支。而且，在这些类群内，发生了多次小尺度的独立的基因重复事件。4）来自单子叶植物的FUL-like基因明显地构成一个单系，并且包括三个分支：OsAMDS14、OsMADS15和OsMADS18。它们是由于两次不连续的基因重复事件产生的。5）不同类型的A类基因产物在C末端拥有不同的保守基元。6）从基因组结构上看，所有的A类基因都拥有八个外显子和七个内含子。7）通过对三叶木通中两个FUL-like型基因（AktFL1和AktFL2）表达式样的观察，我们发现它们在叶原基和发育早期的花原基以及发育着的花器官中都有表达。此外，A类基因表达式样的进化分析结果表明被子植物中该类基因的祖先可能具有广泛的功能，既在营养器官中表达又在生殖器官中表达 。 4. B类基因表达式样的保守性和多样性。通过对B类基因的系统发育和表达式样分析，得到以下结果：1）三叶木通中的三个paleoAP3基因是通过两次基因重复事件产生的。2）在木通科或木通属内，PI型基因并没有发生基因重复事件。3）RT-PCR结果表明，AktAP3_1在雌花中的表达量比雄花中高，而AktAP3_2则在雄花中的表达量比雌花中高。AktAP3_3和AktPI在雌花和雄花中的表达水平相似。4）原位杂交分析显示这些基因在发育着的雄蕊和心皮中表达。此外，AktAP3_3和AktPI还在萼片中表达，可能参与花瓣状萼片的发育。 5. 三叶木通C/D和E类基因的序列结构和表达分析。通过序列结构分析，我们发现，与其它被子植物AG同源基因编码的MADS-domain蛋白一样，AktAG1和AktAG2在MADS结构域的N末端都拥有一段氨基酸序列的延伸，AktAG1为20个氨基酸;AktAG2为7个氨基酸。原位杂交分析表明AktAG1和AktAG2主要在发育着的雄蕊和心皮中表达，说明它们具有决定生殖器官发育这一保守的功能。 AktSEP3属于AGL9型的E类基因。该基因在所有花器官中都有表达，说明和其它被子植物的E类基因一样，AktSEP3在三叶木通中对于所有花器官的发育都是必需的。 6. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用。在前面工作的基础上，我们首次对三叶木通中上述MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）AktSEP3的C末端具有转录激活功能。2）三个AktAP3蛋白与AktPI蛋白都能够形成异源二聚体，但是它们之间的作用能力并不相同。3）AktSEP3蛋白可以与AktFL1、AktPI、AktAG1和AktAG2形成异源二聚体，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性。4）AktFL1与AktPI、AktSEP3和AktAG2也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。 综合以上结果，我们探讨了三叶木通花发育的分子机制。在三叶木通的三轮花器官中，与拟南芥等模式植物相似的是：E类（AktSEP3）基因在每一轮花器官中都起作用;此外，A类（AktFL1）和B类（AktAP3_3和AktPI）基因在花瓣状的萼片中有不同程度的表达，类似于拟南芥的第二轮;B类（AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3和AktPI）和C/D类（AktAG1和AktAG2）基因在雄蕊的发育过程中起作用;C/D类（AktAG1和AktAG2）基因对心皮的发育起作用。与拟 南芥等模式植物不同的是：1）虽然原位杂交分析表明，AktFL1、AktAP3_3、AktPI和AktSEP3都在花瓣状的萼片中有 不同程度的表达，但是它们的蛋白质产物AktFL1与AktSEP3和AktAP3_3与AktPI都只能形成较弱的异源二聚体。而 且，根据我们的研究结果，在三叶木通中没有找到euAP1型的A类基因，只有两个FUL-like型的A类基因。它们的功能 与核心真双子叶植物中的euFUL型基因相似。因此，AktFL1很可能与其它调控因子共同作用负责花分生组织的形成;AktFL1/AktAG2则可能在花发育的后期起作用。那么，三叶木通花瓣状萼片的发育是否需要AktFL1/AktSEP3和 AktAP3_3/AktPI的参与，还是另有其它转录因子的参与，仍然需要更深入的研究。2）虽然在三叶木通中，雄蕊的发 育同样需要B、C/D和E类基因的参与，但是由于小尺度的基因重复事件，在该物种中只拥有三个paleoAP3型基因，而没有euAP3型基因。而且，由于复制拷贝间的亚功能化，AktAP3_1/AktPI主要参与雌花的发育过程;而AktAP3_2/AktPI主要参与雄花的发育过程。

大叶石上莲（苦苣苔科，马铃苣苔属）花对称性基因的表达模式和进化研究

模式植物金鱼草的花对称性分子发育及遗传学研究揭示了花对称性的相关调控基因在花发育过程种的表达模式和功能以及它们的相互作用机制。然而，被子植物的花对称性丰富多样，远非模式植物的模式所能概括。根据目前的研究我们选择苦苣苔科马铃苣苔属作为研究对象，选取其中具有代表性的种大叶石上莲开展控制花对称性的几个关键基因的进化发育生物学研究，初步探讨这些基因的表达模式和功能以及它们与花对称性进化的联系。 RT-PCR实验结果显示，在大叶石上莲中花对称性基因ObCYC, ObRAD, ObDIV与它们的同源基因CYC, RAD, DIV在金鱼草中的表达模式有着明显的差异，这也意味着这些基因的功能及相互作用也有所不同。首先，大叶石上莲的ObCYC1C基因的表达与金鱼草的CYC基因相似，结合花形态比较认为ObCYC1C基因在花器官近轴区域的表达抑制了背部花器官的发育，在构建大叶石上莲微弱的两侧对称花过程中起到了主导的作用; 其它的几个ObCYC基因有着完全不同于CYC的表达模式，ObCYC1D的表达延伸到了花腹部区域而ObCYC2A在花发育中期和晚期没有表达，这意味着它们可能具有除控制花对称性之外的功能; 另一个特殊的现象是ObCYC2B因为在可读框架中一个终止子的提前出现而失去了功能。其次，ObRAD, ObDIV的表达与RAD, DIV的表达差异也极为明显，通过系统树和氨基酸序列比对分析发现ObRAD, ObDIV与RAD, DIV的保守功能区序列存在明显的不同，而ObRAD, ObDIV与BlRAD, BlDIV的保守区很相似，这与它们的花对称性以及基因的表达模式相对映，同时也说明了保守功能区具有极重要的作用。本研究显示了大叶石上莲中的花对称性基因的表达模式和功能与模式植物金鱼草存在显著的差异，在此基础上开展更深入的进化发育生物学研究将有助于揭示花对称性基因的分子进化及其与花对称性表型进化的关系。

玄参科毛泡桐花对称性基因的分离和表达研究

花两侧对称性的获得是由多次独立的进化事件而完成。在被子植物进化过程中，花两侧对称性在植物的适应辐射过程中有重要意义。在模式植物金鱼草中，CYCLOIDEA（CYC）是控制花对称性的关键基因。近年来，CYC 基因的同源基因已经在多个类群中被分离出来，并开展了CYC 类基因的分子进化及其与花对称性表型进化相关关系的研究。 泡桐属是模式植物金鱼草的一个近缘类群，我们从泡桐属的毛泡桐中分离出了CYC基因的两个同源基因，分别命名为PtCYC1 和PtCYC2 。组织特异性RT-PCR显示他们的表达模式发生了明显的分化。 毛泡桐中PtCYC1 基因的表达模式与 CYC 基因在金鱼草中和 McCYC 基因在M. confertiflora 中的表达模式存在明显的差异但是和RgCYC 在地黄（Rehmannia）中的表达模式十分相似。PtCYC1 基因在近轴区域的强烈表达可能与毛泡桐近轴雄蕊的缺失有关。 尽管PtCYC1和M. confertiflora 中的McCYC 基因均从近轴雄蕊延伸到了两侧雄蕊，但PtCYC1 基因的后期表达较弱。因此，毛泡桐中的两侧雄蕊的发育并没有像M. confertiflora 中的两侧雄蕊受到强烈的抑制而成为退化雄蕊，仅仅使得两侧雄蕊短于两个远轴雄蕊从而在毛泡桐中形成二强雄蕊。地黄属和泡桐属两侧对称花的显著特征是缺乏近轴雄蕊。PtCYC1 和RgCYC基因的表达模式的高度一致显示出近轴雄蕊的缺失可能和CYC类基因的强烈表达有关。十分有趣的是毛泡桐中PtCYC2 基因在各个区域均没有表达。对于PtCYC2 基因是否还有其他方面的功能还有待于进一步探讨。

金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物区别于其它植物大类群的最重要的特征，其形态多种多样。花的发育取决于一个复杂的涉及到多个基因和过程的调控体系，因此花的起源和多样化过程实际上可以理解为这个调控体系的进化过程。在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，且经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。相对于核心真双子叶植物相对稳定的花形态结构而言，基部被子植物的花具有丰富的多样性。因此，对基部被子植物花发育相关基因的研究对于我们理解被子植物花的进化非常重要。 金粟兰科（Chloranthaceae）是基部被子植物的代表类群之一。与研究得比较深入的模式植物相比，花被、雄蕊或雌蕊的缺失，使得该科植物的花比较简单。因此对该科植物中花发育基因的研究不仅有助于揭示花的起源以及花多样性分化的分子机制，还将为认识花部构造简单化的机制提供资料。本文以金粟兰（Chloranthus spicatus）为实验材料，取得了以下研究结果： 1.花发育相关基因的克隆 应用5’/3’RACE的方法，我们从金粟兰不同发育阶段的混合花芽中克隆到了与花发育相关的MADS-box基因：CsPI、CsAG1和CsAG2。 2. 两个A类MADS-box基因表达式样的对比分析 在营养分生组织向生殖分生组织的转变中，花原基的形成，以及随后雄蕊、心皮、花粉、胚珠和胚囊的发育中，CsAP1-1和 CsAP1-2基因均表达。唯一不同之处在于，在花发育成熟期，CsAP1-1在外珠被也有表达，而CsAP1-2在外珠被处没有表达，而只在内珠被处表达。这一结果反映了基因重复事件发生后，两个基因在功能上也有了一些分化。 3. B类基因功能的保守性和多样性 通过转基因实验和蛋白质相互作用研究对B类基因的功能和作用方式进行了研究，得到以下结果：1）金粟兰CsAP3基因的C末端的点突变所造成的paleoAP3基元的部分缺失对该基因的功能没有决定性的影响;2）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3所编码蛋白的C末端以及paleoAP3基元，与拟南芥euAP3型基因AtAP3所编码蛋白的C末端以及euAP3基元没有功能上的不同;3）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3与拟南芥euAP3型基因AtAP3 的主要功能存在一定差异，前者主要参与雄蕊形成，而后者既参与雄蕊的形成也参与花瓣的形成; 4）CsPI基因所编码的蛋白可以与AP3类蛋白相互作用进而影响花瓣的形成，因此该基因在功能上是保守的。 4. 金粟兰CsAG1基因的序列结构和功能分析 通过序列结构分析发现，CsAG1属于C类基因，具有保守的AG I基元和AG II基元。过量表达实验分析表明CsAG1的功能与A类基因的功能是相拮抗的。 5. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用 在前面工作的基础上，我们首次对金粟兰中各类MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）C末端的完整性对于MADS-domain蛋白二聚体的形成没有影响; 2）去掉M区的CsAP3蛋白与CsPI蛋白都能够形成异源二聚体，同时它们又可以各自形成同源二聚体; 3）E类蛋白既可以和A类或C类基因产物相互作用，也可以同AP3和PI型蛋白相互作用，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性; 4）金粟兰中，FUL-like型基因所编码的蛋白CsAP1-1与CsSEP3和CsAG1也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。然而，金粟兰CsAP1-1蛋白不能形成同源二聚体。 综合以上结果发现，在无花被的金粟兰中，仍然存在着A、B、C/D、E类花发育相关的基因。这些基因的功能与核心真双子叶植物中同类基因的相比，有些是保守的，比如CsPI基因可以参与花被的形成;但也有一些是不同的，比如CsAP3基因主要参与雄蕊形成而非花被形成过程。由此可以看出被子植物花器官的发育是一个非常复杂的调控过程，不同植物中的调控机理及进化历程可能是不同的。

五数苣苔(Bournea leiophylla)次生辐射对称花形成的分子机制和进化发育生物学研究

被子植物中，花对称性进化的一个重要方面就是从两侧对称向次生辐射对称的演化。唇形目是被子植物中以两侧对称花为主的类群，次生辐射对称花频繁发生。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草(Antirrhinum majus)和少数其他种外，从两侧对称花向次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳川鱼(Linaria vulgaris)中，腹部化反常整齐花的形成各自是由于CYC和LCYC的沉默所引起，这些基因沉默分别是由于转座子插入和DNA广泛甲基化所导致。在豆科(legumes)中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在所有五个花瓣均有表达，这相似于金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花。然而，自然界中起源于不同的两侧对称花支系的许多次生辐射对称花好像并不是因为简单的花对称性基因功能丢失或者获得。因此，以模式植物突变体表型特征的分子机制作为研究出发点，通过对自然发生的次生辐射对称花进行详细研究探讨，有可能揭示两侧对称花向次生辐射对称花转变的新的演化途径，包括花对称性发育过程中不同基因的参与以及他们的表达在时间上的变化等。 苦苣苔科(Gesneriaceae)是唇形目(Lamiales sensu lato)其他类群的姊妹群, 以较弱的两侧对称花为特征，并拥有相当数量的次生辐射对称花种类;该科所拥有的辐射对称花属在唇形目所有科中占的比例最大。在苦苣苔科中，五数苣苔(Bournea leiophylla)是次生辐射对称花类群中具有两侧对称痕迹的代表类群，其花的发育过程显示出五数苣苔花经历了由花器官发育早期的两侧对称向成熟时期辐射对称的形态转变。这种发育模式暗示着五数苣苔的花可能起源于一个两侧对称花祖先;五数苣苔中控制花背腹非对称性的CYC类基因应该是有功能的，至少在花发育的早期是这样的。由于苦苣苔科和婆婆纳科(Veronicaceae)(金鱼草属于婆婆纳科)亲缘关系较近，而且CYC类基因的基本功能之一是导致背部雄蕊退化;因此五数苣苔中辐射对称花的形成很可能既不是由于CYC类基因失去，也不是因为CYC-类基因功能获得延伸或加强所致。在五数苣苔花发育过程中，从早期的两侧对称到成熟花的辐射对称的发育转变可能牵涉到TCP和MYB基因家族成员相互调节作用在时间和空间上的改变。因此，五数苣苔是探讨被子植物中次生辐射对称花新的进化途径的一个理想的候选材料。针对解决这一问题，我们对五数苣苔花进行了以下实验研究： 1 花器官发生过程的观察 成熟的五数苣苔花是辐射对称花，但是对花发育过程中花原基电镜扫描结果表明：在花器官起始和发育的早期，五数苣苔花是显著的两侧对称;但是随着进一步发育，这种两侧对称性逐步减弱，最后形成具有微弱两侧对称性痕迹的辐射对称花。 2 花对称性基因的克隆 我们应用RACE技术克隆得到了五数苣苔花对称性同源基因：BlDIV1、BlDIV2和BlRAD的翻译区全序列及其上下游非翻译区，得到了BlCYC1的3‘端翻译区和非翻译区序列。为了确定这些基因内含子的有无和位置，我们也从DNA中得到了相应同源基因的DNA序列，并且补全了BlCYC1的5‘端序列。同时也克隆到了一个没有在mRNA中得到的CYC同源基因BlCYC2。在该实验中我们第一次在金鱼草以外的类群中克隆得到了DIV和RAD的同源基因。 3 序列比较和分子系统发育分析 运用不同的比较软件和分子系统发育分析工具对五数苣苔的花对称性基因进行了比较和分析。结果表明：五数苣苔各种类型的花对称性基因和金鱼草的花对称基因在序列上是高度同源的，在分子系统发育上是非常近缘的。暗示着五数苣苔花对称性基因和金鱼草花对称性基因功能上的同源性。 4 花对称称性基因表达模式的分析 我们第一次运用组织原位杂交和RT-PCR技术对在金鱼草以外类群中所有已知类型花对称性同源基因的表达模式进行了实验研究。结果表明：五数苣苔花对称性基因的表达模式在花发育的早期类似于金鱼草;但是早期以后，BlCYC1和BlRAD被负调节，BlDIV的表达特异地在每个花瓣侧部边缘表达;这种表达结果和花的形态发生过程有很好的吻合。 上述研究表明：和金鱼草花对称基因的表达模式相比，五数苣苔三种类型花对称性基因在花发育过程中的时间和空间表达模式发生了改变;并且这种表达模式变化和五数苣苔花对称性由发育起始时期的两侧对称向成熟时期的辐射对称的转变是相互关联的。五数苣苔具有两侧对称性痕迹的辐射对称花和其他类群辐射对称花的比较显示：在五数苣苔中发育早期的两侧对称性应该是两侧对称性的遗迹;这是由于BlCYC1和BlRAD基因早期表达的保守性造成的。我们的结果揭示了一个新的花对称性演化路径：在花发育过程中，被CYC-like基因推动的RAD和DIV同源基因之间相互调节作用在时间和空间上的变化是花对称性从两侧对称向辐射对称转变或演化的基础;我们的发现还预示着：在一个调节网络的动态变化过程中，一个预先存在的两侧对称发育程序的修饰调节可能在被子植物次生辐射对称花多样性的形成中扮演重要角色。

基于TCP和MYB基因的表达模式，试探四数苣苔（Bournea sinensis）(苦苣苔科)中次生辐射对称花形成的进化发育途径

花对称性，作为花器官的一个基本而又非常重要的特征，它的进化发育过程，越来越吸引着科学家们的注意力。次生辐射对称花的形成也越来越受到关注。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草（Antirrhinum majus）和少数其他种外，次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳穿鱼（Linaria vulgaris）中，腹部化反常整齐花的形成各自是由CYC和LCYC基因沉默所致，二者基因沉默分别是由于转座子的插入和DNA广泛甲基化所导致;而在豆科（legumes）中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在五个花瓣上都有表达，这种情况和金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花相似。然而，自然起源的两侧对称花支系中的次生辐射对称花的形成似乎并不是简单的花对称性基因功能丢失或获得。自然形成的次生辐射对称花究竟可能经历了怎样的进化途径？对此，我们选择了广义唇形目（Lamiales sensu lato）中苦苣苔科（Gesneriaceae）植物——四数苣苔（Bouenea sinensis）作为研究对象，通过和模式植物金鱼草的突变体中花对称性基因表达特征比较，结合其近缘种——五数苣苔（Bournea leiophylla）中DIVARICATA在时间和空间上的表达特征，试图揭示苦苣苔科中可能的两侧对称向次生辐射对称花转变的新的演化途径，以及在这种进化过程中所产生的可能的器官丢失或融合现象。 四数苣苔和五数苣苔同属于苦苣苔亚科（Cyrtandroideae）苦苣苔族（Trib.Ramondeae Eritsch）中的四数苣苔属（Bournea Oliv）。该属仅仅有两个种——四数苣苔和五数苣苔，它们都是次生辐射对称花类群中的典型代表，而且两者花发育过程都显示出了由腹部向背部顺序发生和生长的特征。然而和五数苣苔相比，四数苣苔花瓣和雄蕊数目分别少了一枚，拥有四枚花瓣（背部花瓣两枚、两侧花瓣两枚）和四枚雄蕊（背部雄蕊一枚、两侧雄蕊两枚、腹部雄蕊一枚）。从形态特征比较来看，很有可能是四数苣苔在次生辐射对称花形成的过程中，发生了腹部花瓣的丢失和两枚腹部雄蕊愈合成了一枚较大的腹部雄蕊。那么，我们推测在四数苣苔次生辐射对称花形成过程中，花对称性基因即CYC类和DIV类基因在分子水平上发生了变化，这种变化和四数苣苔中次生辐射对称花的形成有关。 基于上述考虑，我们开展了对四数苣苔中花对称性基因——BsCYCLOIDEA、BsDIVARICATA、BsRADALIS以及BsCYCLIND3四个基因共9个拷贝进行了在花组织中表达模式研究。我们在四数苣苔中共分离到了五个拷贝的CYC类基因，分别命名为BsCYC1C-1、BsCYC1C-2、BsCYC1D、BsCYC2A、BsCYC2B。这五个拷贝在保守的TCP区和R区保持了高度的同源性。BsDIV的两个拷贝BsDIV1、BsDIV2也是如此，在保守的两个区domain I、domain II，尤其是在那些螺旋和环结构处，保守性相当高。组织原位杂交结果显示，BsDIV在四数苣苔中的表达非常特别，在金鱼草和五数苣苔中该类基因的表达分两个不同时期，即早期表达和晚期特异性表达，BsDIV在四数苣苔中似乎没有早期表达模式或者在很早期就已经进入到了晚期的表达模式。它在四个花瓣的两侧边缘和四个雄蕊上均等表达，而且这种表达持续时间相对比较长。组织原位杂交结果也得到了RT-PCR结果的支持。有趣的是BsRAD的RT-PCR结果显示，BsRAD在晚期花瓣上只在背部表达，但是在雄蕊上的表达却和金鱼草中AmRAD在背部区域表达不同，它的表达从背部延伸到了两侧和腹部。BsRAD在花器官的第二轮和第三轮的表达显然发生了分化。这种现象可能暗示着BsRAD功能发生了分化。BsRAD和BsDIV在腹部雄蕊上精细的时间空间调控关系可能正是导致腹部雄蕊愈合的原因。RT-PCR结果并没有检测到BsCYC2在晚期花上的表达。原位杂交结果显示BsCYC2在第8期以后表达就基本消失了，从而验证了RT-PCR结果。BsCYC2在早期花原基和早期花器官上都是均匀表达，但在表达消失之前，它在花瓣裂片和花冠筒的分界处则有表达信号，BsCYC2可能和调控花冠筒高度有关。根据Almeida 和 Galego（2002）所说，花冠筒高度的改变依赖于CYC 、DIV基因和其它非主动生长决定因子之间的相互作用。BsCYC1C晚期的RT-PCR结果显示它在背部花瓣、背部雄蕊和两侧雄蕊上均有表达信号，但在腹部花瓣和雄蕊上则没有表达信号，这似乎和四数苣苔由腹部向背部顺序发育的形态特征相符合，说明BsCYC1C可能起到了抑制背部花瓣和背部雄蕊生长的作用。

烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）两侧对称花的进化发育途径

被子植物菊亚纲原始类群的花为辐射对称花，伴随着适应性进化和传粉者的专性化，两侧对称花随之出现并快速进化和多样化。与花对称性相关的基因首先在模式植物金鱼草中被分离出来，它们包括TCP 基因家族的两个基因Cycloidea（CYC）和Dichotama（DICH），MYB 基因家族的两个基因Radialis（RAD）和Divaricata（DIV）。模式植物金鱼草的分子发育与遗传学研究初步揭示出在花对称性形成过程中相关调控基因的功能、表达模式及其相互作用机制。研究表明，金鱼草花中CYC 和DICH 基因只在背部表达，控制背部属性。DIV基因早期在所有部位表达，但只影响腹部属性。CYC 和DICH 通过激活与DIV具有颉抗作用的RAD 基因在背部的表达来抑制DIV 基因在背部的作用从而构建了金鱼草的两侧对称花。但是，被子植物繁杂多样的花对称性远非一种模式植物所能概括。此外，被子植物花对称性的演化也是一个悬而未决的问题。要全面了解被子植物花对称性的起源、多样化及其背后的决定机制，有必要进一步研究不同类群中花对称性相关基因的功能变化和进化式样。 苦苣苔科（Gesneriaceae）与金鱼草所属的车前科（Plantaginaceae）同属于菊亚纲的广义唇形目。研究表明广义唇形目的祖先已经具有了两侧对称花，苦苣苔科是广义唇形目的基部类群，具有与唇形目两侧对称花早期分化相关的各种两侧对称花类型。因此，在苦苣苔科选择两侧对称花代表类群开展花对称性的进化发育生物学研究十分有助于探讨苦苣苔科花对称性基因在两侧对称花类群的调控进化，从而揭示广义唇形目基部类群花对称性的进化发育模式。我们选择苦苣苔科两侧对称花类群烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）为主要研究材料。烟叶唇柱苣苔是苦苣苔科两侧对称性比较强烈的类群，主要体现在其只有腹部两枚雄蕊能育，背部和侧部雄蕊均败育，与金鱼草的近亲沙漠幽灵花（Mohaveae confertiflora）的形态类似。在沙漠幽灵花中CYC 类基因的表达从背部延伸到了侧部，但是在烟叶唇柱苣苔中是否遵循同一模式还是存在其他途径这是我们的主要研究目的。此外，我们发现在烟叶唇柱苣苔花序的顶花中偶尔会发生腹部化的辐射对称突变花。在金鱼草和柳穿鱼中，CYC 类基因的失活导致了辐射对称突变花的产生，而在豆科植物Cadia purpurea 中，CYC 类基因的活性从背部延伸到了侧部和腹部，导致了辐射对称花的形成。烟叶唇柱苣苔中的情形则值得我们关注。再者，革叶粗筒苣苔（Briggisia mihieri）是烟叶唇柱苣苔的近缘类群，但它具有四枚能育雄蕊（侧部和腹部各两枚）。苦苣苔科两能育雄蕊类群被认为起源于四能育雄蕊类群。我们在烟叶唇柱苣苔野生型两侧对称花和辐射对称突变花中开展花对称性基因的表达模式研究，结合在革叶粗筒苣苔中的研究，试图揭示烟叶唇柱苣苔两雄蕊类两侧对称花形成的分子机制和进化发育途径。 本研究从烟叶唇柱苣苔中分离到4 个CYC 类基因（ChCYC1C，ChCYC1D，ChCYC2A，ChCYC2B），2 个DIV 类基因（ChDIV1，ChDIV2）和2 个RAD 类基因（ChRAD1，ChRAD2）。从革叶粗筒苣苔中分离到4 个CYC 类基因（BmCYC1C，BmCYC1D，BmCYC2A，BmCYC2B），2 个DIV 类基因（BmDIV1，BmDIV2）和1 个RAD 类基因（BmRAD1）。序列和系统发育分析结果显示它们均为花对称性基因。进一步的表达分析显示结果表明：（1）不同拷贝CYC 类基因的表达存在着分化，与其氨基酸序列的分化一致；烟叶唇柱苣苔的CYC 类基因表达从背部延伸到了侧部而革叶粗筒苣苔的CYC 类基因仅在背部表达，与它们的形态分化密切相关。（2）DIV 类基因在种内两个拷贝以及种间的表达无明显的分化，在花的各个部位都有表达。（3）烟叶唇柱苣苔两个拷贝的RAD 类基因的表达存在分化；两个种的同类RAD 类基因的表达也存在分化。这些花对称性基因的表达模式分析揭示了它们在烟叶唇柱苣苔和革叶粗筒苣苔两侧对称花形态建成以及二者花形态的演化中具有重要作用。 同时，我们对烟叶唇柱苣苔的辐射对称突变花进行了自交和F1 代培育，但是F1 代没有出现稳定的辐射对称突变株。我们从辐射对称突变花中分离到的CYC 类、DIV 类和RAD 类基因的核苷酸序列与野生型的完全一致。说明突变体的产生与序列变异无关。RT-PCR 分析表明突变花中CYC 类基因全部失活，而DIV 类基因和在腹部表达的RAD 类基因的表达信号有所增强，这与其腹部化辐射对称的形态相一致。这进一步证实了花对称性基因在烟叶唇柱苣苔花形态建成中的作用。

诱导风信子（Hyacinthus orientalis L.）同一花被外植体不同部位细胞分化花芽的研究--外源激素的作用及内源激素的变化

诱导风信子（Hyacnthus orientalis L．）同一花被外植体上不同部位细胞分化花芽，从外源激素的作用和内探激素的变化探讨细胞脱分化启动的原因，研究了不同外源激素的组合下同一花被不同部位花芽分化的诱导频率：测定了花被上、中，下三部位切块离体培养前后的内源IAA和Z+ZR的含量;在此之前研究了GC-MS．MIM内标法测定微量植物材料内源IAA含量的可行性． GC-MS．MIM内标法是测定微量（0.5-1g）植物材料内源IAA含量的一种比较理想的方法，所需材料量一般为0.58．这一方法的材料前处理采用粗提液用C18Sep-pak柱初步分离纯化．HPLC进一步纯化，能获得纯度高的样品，且操作简便，省时省力． 风信子同一花被不同部位细胞均能分化花芽．当培养基中附加2.0mg/l Zeatin或2.0mg/16-BAP时，随着外探IAA浓度从0升高到10.0mg/l．捆胞分化花芽的部位从花被下部向上部移动。 离体培养前后同一花被上、中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量测定结果表明．风信子同一花被内源IAA含量是上部最高，下部次之，中部最低，而内源Z+ZR含量从上向下依次增加;在附加不同外源激素的MS培养基上培养3天后，同一花被上，中、下三部位内源IAA和Z+ZR含量部有一定的变化。

小麦春化相关基因的克隆及其功能分析

一． 小麦相关基因ver203F cDNA全序列克隆与功能分析 　　根据本实验室通过差异筛选技术克隆到的与春化相关的基因cDNA verc203的序列，设计PCR 5’端PCR引物，利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）克隆策略，得到春化相关基因ver203基因的同源基因ver203F cDNA的3’端序列，长度为1,197bp。Northern分析表明ver203F全长约为1.5 kb，且其表达具有春化处理的特异性。根据3’RACE克隆的ver203F 3 ’端核苷酸序列设计了3’端PCR引物，利用5’RACE克隆到该基因的5’端片段，经DNASIS核酸分析软件分析将5’45RACE和3’RACE DNA序列拼接合并，得到ver203F全长cDNA，从TdT加尾5’末端到poly A全长为1,561 bp，5’端起始密码子ATG上游非编码区－1～－192共了192bp，终止密码子TGA到poly A的非编码区有253bp，cDNA编码区全长1,119 bp，推测编码373氨基酸残基。国际基因序列数据库检索表明该基因序列（GenBank/EMBL/DDBJ：AB012013）与大麦茉莉酸诱导基因有部分同源性。因上推测该基因在调控开花过程中可能参与茉莉酸介导的信号传导途径，ver203F作用的发挥可能需要其它蛋白的参与，或ver203F本身就是一个受体蛋白。 　　为了研究ver203F基因的功能，将通过3’RACE克隆到的ver203F 3’端序到分别构建正义和反义植物表达载体，通过花粉管通道法、农杆菌介导的叶圆片法以及农杆菌介导的真空转化法分别转化小麦、烟草和拟南芥菜。获得转基因植株后，PCR、DNA Dob Blot、Southern Blot分析以及GUS活性检测证明外源基因已整合到转基因植株中，并得到表达。在获得的小麦、烟草和拟南芥菜转基因植株中，它们开花时间都相应地推迟，表明正常植物体内该基因在控制营养生长向生殖生长的转变中起作用。ver203F可以影响小麦和拟南茶菜花序的发育，首先无论正义还是反义都使得花序的发育受到抑制，在小麦中表现为顶部小穗退化，在拟南芥菜中表现为顶花。其次在转化正义基因的转基因拟南芥菜中，观察到产生的顶花为对称的两朵或以对称的两朵顶花基部为生长点长出丛生花，这种对称花的麦型小麦小穗中小花的表型相类似，说明ver203F基因可能在小麦小花的发育过程中也起着重要作用。 二． 春化相关基因ver17在开花过程中功能的分析 以春化处理冬小麦（京冬1号）幼苗cDNA为材料，通过减法杂交与差异筛选得到春化相关cDNA克隆verc17。为了研究该基因的功能，以包含CaMV 35S启动子的pBI221为载体，将ver17cDNA片段分别从两个方向插入pBI221的BamH I－Sma I, Xba I－BamH I间，构建正义和反义表达质粒：p17S和p17X，通过花粉管通道法转化小麦。对T0和T1两代转基因小麦的观察发现，在转化反义基因p17X的转基因小麦首先表现为抽穗推迟，其次穗的顶部和基部小穗严重退化，另外还发现转化反义基因的小麦败育现象严重（主要是花粉败育），因此推测ver17基困能可具有以下几方面的特点：a．春化诱导型表达;b．促进植物开花;c．促进穗顶端和基部花的发育，减少其退化;d．影响雄蕊的发育。

生长素水平以及光敏色素基因表达与水稻生殖生长的关系

第一部分 光敏核不育水稻农垦58S花药IAA的免疫组织化学分析 光周期敏感核不育水稻农垦58S是研究光周期调节花发育作用机理的好材料。在此方面已取得很大进展。有关植物激素的研究已发现长日照诱导农垦58S不育的信号传导环节之一是IAA的亏缺。本文首次应用免疫组织化学分析方法对长日和短日处理后的农垦58S和对照农垦58花药中的IAA进行了定位研究和相对水平的比较。结果表明此方法可反映游离态IAA在花药中的分布及其相对水平的变化。从雌雄蕊原基形成期至单核晚期的五个时期中，经长日照处理的农垦58S花药中的IAA水平都低于短日照处理的农垦58S及在不同光周期处理下的家垦58花药。对花药中生长素的亏缺与育性的关系以及IAA亏缺的原因也进行了讨论。 第二部分 不同水稻品种成花诱导阶段光周期敏感性及光敏色素mRNA丰度的比较 对光敏核不育水稻十多年的研究表明，光敏色素是感受光周期信号调节水稻成花诱导和育性转换的主要光受体。同时还发现光敏核不育基因导入不同遗传背景后，其基因表达条件，如临界光长、光敏温度范围、光温互补作用强弱等都表现明显差异。为了进一步探讨水稻光周期反应的作用机理，了解不同品种遗传背景对光周期信号感受的特点，我们选取籼稻、粳稻、早熟、晚熟共11个品种，比较光照阶段在长同、短同条件下叶片光敏色素B mRNA含量的差异。初步结果表明，光敏色素B的转录不受光调控，在长日、短日处理条件下没有明显差别。在多数品种间光敏色素B表达没有明显差异，说明其与品种感光性、籼粳性无明显相关。只有早熟粳稻铁粳23的光敏色素B mRNA含量较高，是一个例外。实验结果尚需进一步重复。这方面的工作可以为水稻发育光温互作本质的研究积累一些初步资料。

水稻花发育相关基因RA68和OsUBP1的分离与功能分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　第一部分 利用减法杂交和RACEs从水稻中克隆了一个编码含有脯氨酸和苏氨酸丰富结构域多肽的cDNA,其相应的基因被命名为RA68。RA68由3个外显子和2个内含子组成，编码的蛋白由219个氨基酸残基组成。该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽，一个亲水性的N－端结构域和一个疏水性的C－端结构域组成。 N端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。 Southern杂交和序列分析结果表明RA68在水稻基因组中以单拷贝存在，定位于第2号染色体。Northern杂交结果表明RA68在幼芽和花中表达量较高，在根和叶中不表达。原位杂交分析结果表明：在幼苗期RA68 主要在幼芽胚芽鞘的内外层细胞和幼叶原基的表层细胞中表达;转入生殖生长期后，在花序分生组织、枝梗原基顶端、花器官原基、大孢子囊和花粉粒中表达。用GFP作报告基因，用洋葱表皮细胞进行的瞬间表达测试结果显示RA68蛋白定位于细胞核中。转反义RA68水稻植株抽穗期比对照野生型延迟30天左右。这些结果表明RA68可能是水稻花分生组织特征基因，在成花转变过程中起作用。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第二部分 通过RACE和RT-PCR方法分离了水稻OsUBP1基因，其推测编码蛋白含有UBP结构域（Cys Box和His Box）和TopⅥA结构域。RT-PCR分析结果表明OsUBP1在转录过程中通过可变剪接产生多个不同的转录本，这些转录本在叶、根、颖花和幼芽中存在着时空调节表达模式，每种组织中的转录本是不一样的。这些转录本内含子剪切位点除了经典的GT-AG外，还有GC-AG、CT-AC、TT-GA、GT-GA和CT-GA。由于发生了GC-AG的可变剪切产生了OsUBP1的重要功能结构域Cys Box。水稻OsUBP1基因和OsSPO11-1基因位于11号染色体的同一基因座位上。原位杂交分析表明，在花中OsUBP1 mRNA 主要在药壁绒毡层、花粉粒、大孢子囊和颖花底部维管束中表达。转反义OsUBP1植株大多不能正常结实，这说明OsUBP1可能参与水稻的育性调节。 关键词

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

抗氧化剂对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达率的影响

大豆是我国最重要的油料作物之一，在我国的农业乃至幽民经济中占有重要地位。但是，由于我国人豆品质较差、产量较低，严重地影响着我国的大豆牛产及其在国际市场上的竞争力。农杆菌介导的转基因方法是大豆改良的最简便和最经济的方法之一，然而大豆基因转化效率低一直是大豆基因工程的主要限制因素。本研究以含有GUS报告基因和NPT II筛选基因的农杆菌1301侵染大豆子叶节和下胚轴，并用组织化学定位法测定GUS基因在叶节和下胚轴上瞬时表达，研究了抗氧化剂对提高大豆基因转化效率的影响，为建立大豆高效基因转化体系奠定基础。 以子叶节为外植体，用农杆菌侵染和共培养后进行GUS染色，观察其瞬时表达情况。在培养基中不含抗氧化剂的情况下，子叶节上未发现染色点，仅在下胚轴侧面有极少染色点。而在培养基巾含有抗氧化剂的情况下，外植体上产生了人量GUS染色点，其中大部分位于下胚轴处，子叶节部位几乎很少被染色。这说明下胚轴比f叶节更容易接受外源基因。本论文分别以子叶节和下胚轴为外植体进行研究。 以子叶节为外植体，在抗氧化剂作用下用农杆菌侵染，诱导丛生芽，在含有潮霉素的筛选培养基上培养，以筛选抗性苗。实验只得到一株抗性幼苗。 为了进一步研究抗氧化剂对GUS暴凶在下胚轴中瞬时表达的影响，我们特别以下胚轴为外植体，测定了多种条件下的瞬时表达率情况。 我们研究了共培养时间对大豆下胚轴基因瞬时表达率的影响，通过确定合适的共培养时间以获得最佳转化率。在共培养2天后，GUS基因的表达率是8%，但是在3天后，GUS基因瞬时表达率大幅度上升，达到23.4%。随后两天GUS基因瞬时表达率没有太大变化，因此，大豆下胚轴的GUS基因瞬时表达的最适共培养时间为3天。 农杆菌再悬浮液稀释浓度对大豆下胚轴GUS基因瞬时表达也有较大影响：再悬浮培养基与农杆菌菌液等体积时，GUS基因瞬时表达率最高，随稀释浓度提高，转化效率降低。这说明随农杆菌菌液浓度提高，侵染几率增加，从而提高了GUS基因的瞬时表达率。 很多研究表明大豆基因转化存在很大的品种问差异，我们选择了四种基因型差异较大的品种在上述最佳条件下分别测定了GUS基因瞬时表达率，但没有发现品种之间存在显著差异，说明抗氧化剂在大豆下胚轴基因转化中具有品种普遍适用性。 上述研究结果表明抗氧化剂能够大大促进GUS基因在下胚轴的瞬时表达，这对于今后开展大豆基因组研究和品质改良工作具有一定意义。

黄檗花的形态发育及胚胎学研究

黄檗(Phellodendron amurense Rupr.)为雌雄异株，雌花中有退化的雄蕊，雄花中有退化的心皮。花部器官分化顺序为花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊群。雌花的雄蕊退化前形成1-3个导管分子。雄花的心皮发生对折，但始终不闭合，也不产生胎座原基，后期心皮退化变小。 黄檗花药壁发育为基本型。腺质绒毡层，发育后期为双核或多核。小孢子母细胞减数分裂为同时型。小孢子四分体为四面体型排列，偶见左右对称型排列。成熟花粉为3-细胞型。子房5室，具中轴胎座、倒生胚珠、珠柄珠孔塞、双珠被、厚珠心、和多孢原细胞。大孢子四分体为直线型、少数为T型，有的减数分裂后四个核位于一个细胞内。直线型四分体中合点端一个为功能性大孢子。蓼型胚囊、双受精属于有丝分裂前配子融合类型。胚的发育为藜型、核型胚乳。后期胚乳组织外围形成“次生外围胚乳”，内层胚乳细胞逐渐退化解体。黄檗的渐危原因除了自然因素外，更主要的是由于人为过份采伐利用。对此本文提出了一些保护对策。