利用海带配子体营养增殖体系实现外源基因表达

1993年以来，本实验室在借鉴高等植物基因工程原理和方法的基础上，利用海带世代交替生活史，建立了海带遗传转化体系,并申请国家专利PCT/CN03/00534（Trends in Biotechnology, 2005, 23,264-268.）。海带遗传转化体系是建立在基因枪转化海带配子体，经孤雌或受精途径再生幼孢子体后用氯霉素筛选以及海上安全栽培等一系列技术平台上的新型体系。目前该体系已经成功实现报告基因（β-半乳糖甘酶基因，LacZ）和目的基因（乙肝表面抗原基因，HBsAg）在孢子体阶段的稳定表达。由于应用该体系表达目的基因须经过孢子体再生以及海上栽培等阶段，周期较长，因此本论文拟通过以下5方面工作初步建立以配子体营养增殖为基础的新型海带表达体系，并尝试在配子体阶段实现转化、筛选、增殖及产物检测等操作。1)确立针对配子体的选择标记。2)利用光生物反应器增殖配子体。3)拓展新的报告基因种类。4)克隆内源高效启动子。5)利用该体系表达rt-PA基因（编码价格昂贵的特效溶栓药，瑞替普酶）。本论文研究结果为1)升高温度能够显著增强草丁膦的筛选效果，根据敏感性实验统计结果确定了草丁膦作为海带配子体遗传转化选择压力的筛选方案为40mg/l连续处理7d×3次。2)利用室内光生物反应器营养增殖海带配子体技术，经草丁膦筛选，实现了SV40启动子驱动草丁膦抗性基因bar在配子体细胞中的稳定表达。3)采用调整配子体营养生长状态的方法减低背景荧光，从而首次观察到增强型绿色荧光蛋白基因（egfp）在海带配子体细胞中的瞬间表达。4)克隆了海带肌动蛋白基因（actin）的基因组序列，这是褐藻肌动蛋白基因组序列克隆的首次报道，通过染色体步移获得海带actin基因上游约450bp的片段。5)在上述工作基础上，与中国药科大学合作构建了瑞替普酶基因（rt-PA）的海带表达载体，并实现该基因在海带配子体细胞中的稳定表达，产物具有正确的生物学活性，平均表达量达到0.159μg/mg可溶蛋白。这是该基因在植物中表达的首次报道。研究结果提示在光生物反应器营养增殖体系基础上构建海带配子体表达系统的方案是可行的。

青海家牦牛HIF-1α基因组织特异性表达

[目的]探究青海家牦牛HIF-1α基因组织的特异性表达。[方法]应用半定量反转录PCR和实时定量反转录PCR（SYBRGreen）技术对青海家牦牛HIF-1α基因的组织特异性表达进行检测。通过提取不同组织总RNA，经DNase I消化后，用随机引物进行反转录合成cDNA，采用特异性引物分别对HIF-1α和β-actin基因进行RT-PCR和Real Time RT-PCR扩增。[结果]结果表明，HIF-1α基因在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、睾丸组织中均有表达，其中以睾丸和脾中HIF-1α基因表达量最高，肌肉的表达量最低。[结论]该研究为进一步揭示HIF-1α在高原土著动物低氧适应过程中的分子机制有着重要的意义。

高原鼠兔ob基因的组织表达特征

ob基因编码的leptin蛋白在调节生物体能量平衡中起到重要作用。本研究应用Taqman探针real time PCR技术对高原鼠兔ob基因的组织分布进行检测。通过提取不同组织总RNA，经DNase I消化后，用随机引物进行反转录合成cDNA，采用特异性Taqman探针和引物分别对ob基因及β-actin基因进行实时定量PCR扩增，对不同组织中ob基因和β-actin基因的初始拷贝数之比进行比较。结果表明ob基因在脑、心脏、肺、肝脏、脾脏、肾脏、骨骼肌、脂肪组织中均有表达，其中以白色脂肪组织中ob基因表达量最高，其次为心脏和肺，表达量最低的是肝脏和肾脏。