Fractionation and analysis of Artemisia capillaris Thunb. by affinity chromatography with human serum albumin as stationary phase

A method for the screening and analysis of biologically active compounds in traditional Chinese medicine is proposed. Affinity chromatography using a human serum albumin (HSA) stationary phase was applied to separate and analyze the bioactive compounds from Artemisia capillaris Thunb. Five major peaks and several minor peaks were resolved based on their affinity to HSA, two of them were identified as scoparone (SCO, 6,7-dimethoxycoumarin) and capillarisin (CAP). CAP shows a much higher affinity to HSA than SCO. The effects of acetonitrile concentration, eluent pH, phosphate concentration and temperature on the retention behaviors of several major active components were also investigated, and it was found that hydrophobicity and eluent pH play major roles in changing retention values. The results demonstrate that the affinity chromatography with a HSA stationary phase is an effective way for analyzing and screening biologically active compounds in traditional Chinese medicine. (C) 2000 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

青蒿的遗传转化及青蒿素生物合成的调控

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1601，1000，1500，15834，A4，均成功地转化了中药青蒿(Artemisia annua L.)并且建立了pRi1601，pRi15834，pRiA4诱导的发根培养。pRi1601，pRi15834的发根诱导率比其它质粒高。太老或太幼的叶片不利子发根的诱导;发根主要从叶脉的伤口处萌发;带顶芽或带侧芽的叶片容易诱导根，但不一定是发根。光照有利于发根的诱导和发根的生长。以每个发根的“绝对生长速率”(Gtowth Ratio，GR)和绝对“侧根”数量(Number of Side Roots，NSR），通过大量的发根系的筛选，建立了8个发根系，1601-L-1, 1601-L-2, 1601-L-3, 1601-L-4, 15834-L-1, 1601-P-I, 16 01-P-2，15834-L-2。Southern分子检测表明，160l-1-1，1801-L-2, 1601-L-3，1601-L-4，1601-P-1，1601-P-2均为转化子。8个建立的发根系之间无论生长或者QHS的合成存在明显的差异。比较光／暗(16/8hrs)，25℃条件下培养的16 01-L-1，1601-L-2，1601-L-3，1601-L-4，1601-P-l，和1601-P-2，其中16 01-L-3的生长最快，160l-L-1的生长最慢;但是，1601-L-1的QHS的含量最高（可达1. 048%），1601-1-3的QHS的含量最低。160Z-L-3，15834 -L-1和2583:1-L-2的生长速率相差不大。用盛有l000mLMS液体培养基的3000mL的锥形瓶扩大培养1601-L -3，15834-L-1和15834-L-2，转速为ll0rlpm，培养过程中发根容易形成发根球（Hairy Root Balis，HRB），HRB的形成严重影响发根的生长和QHs的合成，HpLC分析表明扩大培养发根中QHS的含量比较低。 改变MS基本培养基中的无机离子的浓度，研究不同无机离子对发根生长和QHS的合成的影响。 l、KN03为18.79×10-3M时有利于1601- L-1生长，为14. 84×10-3M时有利于QHS的合成。NH-4N0-3浓度在10.93-12. 49×10—3M范围内有利于1601-L-1生长，在0-20.62×10-3M范围内对QHS的合成影响不大，大于20. 62×lO-3M不利QHS的合成。培养基中NH-4+／N0-3-比值为0. 37-0. 4-0.52:1时有利于发根的生长，比值为0.52 - 0.58:1时有利于QHS的合成。 2、H-2P0-4-浓度为2.498×10-3M时有利于发根的生长在0-2. 498×l0-3M范围内，随着浓度的提高，促进发根的生长。培养基中的H2P4 -的浓度在0-1.249×lO-3M的范围内，随着浓度的提高，促进QHS的合成，为1.249×10-3M时QHS的含量最高。 3、培养基中最适16 01-L-1生长的Ca-2+浓度为0.198- 0.766×10-3M，大于或小于该浓度范围，显著地抑制发根的生长。但是，在0-3.695×10-3M范围内，随着培养基中Ca-2+浓度提高，促进QHS的合成，最适Ca-2+浓度为3.695×l0-3M。 4、培养基中不加Mg-2+时，完全抑制发根生长，在0. 142×10-3M-7.506×l0-3M浓度范围内，对发根生长影响没有明显的差别。但是，HPLC和UV分析发根中QHS含量，培养基中不加Mg-2+时，发根中QHS含量最高。 5、培养基中的Fe-2+浓度在0. 25 -1．0×10-3M范围内，同时有利于16 01- L-1的生长和QHS的形成。 6、培养基中最适合予16 01- L-3生长的KI浓度为2.5ppm，大于或小予该浓度均显著地抑制发根的生长，培养基中加入KI明显地降低发根中的QHS的含量。 7、H2BO3对l601-L-l生长影响不大，HPLC分析QHS的含量，培养基中的H3BO3浓度为100ppm和400ppm，QHS的含量分别为1.69mg/g和1.80mg/g(DW)。 8、Cu-2+对1601-L-3的生长影响显著，最适合1601-L-3生长的Cu-2+浓度为1.00ppm，在0 -1.00ppm的浓度范围内，随着培养基中的Cu+浓度的提高，发根的生物量不断增加。培养基中QHS合成的最适Cu2+浓度为0.05ppm，大于或小于该浓度均显著地抑制发根中QHS的合成。 比较光培养和暗培养对发根生长的影响，结果表明光照明显地促进1601-L-l的生长，暗培养明显不利于发根的生长。最适合于发根生长的温度为25℃，大于35℃显著地抑制发根的生长，影响发根的根尖细胞的正常分裂。 改变培养基中的蔗糖浓度和在发根培养的不同时期给培养基中添加蔗糖，试验结果表明蔗糖作为碳源对1601-L-3和1601-L-1的生长具有显著的影响。 (1)培养基中缺少蔗糖显著地抑制发根的生长。 (2)发根培养的前5天时间内，蔗糖浓度为30- 60glL昀培养基最有利于发根的生长，50glL的培养基中的发根生长最快，培养基中的蔗糖浓度大于60g/L小于30g／L时，发根的生物量增加较少。 (3)发根培养至第15天时，蔗糖浓度为60g/L的培养基最有利予发根的生物量的增加。发根培养至30天时，蔗糖浓度为60-90g/L的培养基，发根的生物量的增加相差不大，但是为蔗糖浓度为30-40g/L的培养基中的发根生物量一倍。 (4)发根培养过程中，分别于第5和15天给蔗糖浓度为30g/L的培养基中添加一次或二次蔗糖，使培养基中的蔗糖终浓度相当于60g/L或90g/L，培养至30天时，添加蔗糖的培养基中的发根的干重生物量相当于不添加蔗糖培养基中的发根生物量一倍，相当于初始蔗糖浓度为60g/L和90g/L培养基中发根的生物量。 (5)随着培养基中蔗糖浓度的提高，发根干重/鲜重比显著增加。培养基中的蔗糖的消耗量与发根生物量的增加呈正相关，蔗糖消耗越多，发根生物量的增加越大。 比较pH值对发根生长和QHS合成的影响表明，灭菌前pH值在5.O-6.5范围内的培养基适合予1601-L-1的生长，小于5.O不利于发根的生长，pH5.8有利于1601-1-1生长和QHS的生物合成。发根收获时培养基中的pH值一般为4.5-5.2. pH7.O抑制发根的生长，pHl0.O对发根具有强烈的致死作用。发根在培养过程中，对培养基中的pH值具有显著的调节作用，发根能在很短的时间内(24- 48hrs)使pl:l值为5.8、6.4、7.0培养基降低到pH4. 5-5.2，pH为5.8的培养基有利于QHS合成。 比较不同基本培养基对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明N6、DCR、Litvay培养基有利于1601-L-1的生长，WS、White、B5培养基不利于发根的生长。DCR培养基中的QHS含量最高。 根据三水平试验选用三水平正交表来安排试验的原则，选用三水平正交表L7(3-)，研究多因子效应对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明，Mg2+，Fe2+，Mn-2+，NH4NO3，KN03 ,KI,Ca-2+为发根生长的主要因子，NH4N03，KNOs，Mg2+，Ca2+，肌醇为QHS合成的主要因子。 通过TLC分析发根中QHS和其它化学成分，同时比较发根和无菌苗及野生植株的化学成分，发根和无菌苗均能合成包括QHS在内的野生青蒿叶片中的大部分非挥发性的化台 物。 研究青蒿植株在发育过程中QHS的含量的变化以及发根、无菌苗和野生青蒿中QHS的合成，HP分析结果表明，l、不同的单株青蒿之间的QHS量相差很大。2、同一植株幼 叶的QHS含量比老叶的QHS含量高。3、不同单株青蒿之间达到最高QHS含量的时间不一样，开花期或开花之前。4、无菌苗（带根）或者不带根丛生芽均能合成QHS，但是带根的无菌蕾的QHS量比丛生芽中的QIS的含量高。5、不同发根农杆菌转化的发根系1601-L-1和15834-L-1都能合成ＱＨＳ。

青蒿异源基因的遗传转化及青蒿生物合成相关基因的克隆

本论文由三部分内容组成，一、药用青蒿的遗传转化，即根癌农杆菌和发 根农杆菌介导的转化系统的建立及其影响参数的研究。二、青蒿素生物合成的 分子调控。三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。 一、药用青蒿的遗传转化。建立了Ri质粒介导和Ti质粒介导的两种转基因系统， 其中Ri质粒介导青蒿转基因系统的建立是国际上首次报道;以GFP基因为报 告基因，首次获得高效表达的青蒿转绿色荧光蛋白基因的丛生芽，并对GFP基 因的表达进行了组织和细胞水平的定位。此外，对影响两种转基因系统的主要 参数进行了较为详细的研究。上述研究为青蒿素生物合成的分子调控奠定了坚 实的基础。 二、青蒿素生物合成的分子调控。为探索提高青蒿植株或组织和器官中的青蒿 素含量，首次以棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷酸合成酶的 cDNA 为 目的基因导入青蒿，对青蒿中青蒿素的生物合成进行了分子调控研究的尝试。 通过已建立的两种转基因系统，将从棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷 酸合成酶的 cDNA 导入青蒿，获得转基因发根和转基因植株。结果表明，外源 基因的表达能够影响青蒿素的生物合成，其中法呢基焦磷酸合成酶基因的过量 表达能够促进青蒿素的生物合成，提高转基因发根和植株中的青蒿素的含量。 转基因发根F-26系中青蒿素含量最高达3.01 mg/g.DW，与对照相比青蒿素含量 提高3～4倍;转基因植株的青蒿素含量最高达10.08 mg/g.DW，与对照相比， 转基因植株的青蒿素产物提高2～3倍。此外，研究还表明，在转基因的发根C -37株系中，外源杜松烯合成酶基因的导入和表达可能相应地促进青蒿转基因 发根自身的法昵基焦磷酸基因的表达。 三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。采用 RT-PCR 技术，从马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 幼叶中克隆了 HMGRII 亚基因家族的一个新的成员 HMGR-c2（GenBank accession No．AF 096838Southem）;杂交分析表明，该基因至少以 两个拷贝以上形式存在于马铃薯基因组中;RT-PCR分析表明，HMGR -c2的 表达在幼苗期无组织特异性，广泛地存在于根、茎、叶等组织中。以青蒿001 株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期的λgtll cDNA文库，以PCR筛库方 法从青蒿中克隆一个法呢基焦磷酸合成酶cDNA (Artfps2 GenBank accession No． AF136602)和一个HMGR cDNA(GenBank accession No．AF142473);以青蒿 025株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期部分质粒文库以 PCR 筛库方法从 青蒿中克隆一个法昵基焦磷酸合成酶 cDNA (Artfpsl GenBank accession No.AF112881);此外，还从青蒿中克隆了倍半萜合成酶的 cDNA 片段(GenBank accession No.AF156854)。其中青蒿倍半萜合成酶基因的克隆是目前国际上本研 究领域最受关注的焦点和难点之一。至此，本研究已将与青蒿素生物合成相关 的三个重要的关键酶基因基本克隆，这无疑将加速青蒿素生物合成的基础和应 用研究的进程。

真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性研究

本论文主要包括以下两部分内容： 一、真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响 用3种真菌诱导子[大丽花轮枝孢（Verticillium dahliae Kleb.）、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer (Ehrenb. ex Fr.) Vuill)和束状刺盘孢(Colleto trichumdematium (Pers.) Grove)]分别处理青蒿(Ar temisia annuaL．)的发根，这3种真菌诱导子均能促进发根中青蒿素的合成，其中以大丽花轮枝孢的诱导效果最好;对细胞生长均没有明显影响。经大丽花轮枝孢处理的发根中青蒿素含量达1. 12 mg/gDW，比对照(0. 77 mg/g DW)提高45%。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及发根的生长状态有关。对大丽花轮枝孢来说，诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖0.4 mg;发根在指数生长末期对诱导作用最敏感：在加入诱导子4d后收获发根，发根中的青蒿素含量最高。 二、早花基因FPF1、co对青蒿开花时间的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性 1．将来源于拟南芥的早花基因Flowering Promoting Factorl (FPFl)插入到植物表达载体pBI121中，构建CaMV 35S启动子控制下含FPFl基因的植物表达载体pBI121FPF/，用含有pBI121FPF/质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404感染青蒿(Artemisia annua L.)叶片并诱导丛生芽，经卡那霉素筛选，获得转基因抗性植株。PCR、 PCR-Southem blot及Southern blot检测表明，外源基因FPFI已整合到青蒿基因组中：RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，FPF1转基因植株的开花时间较对照提前20天左右，但提早开花的转基因植株与未开花的对照其青蒿素含量无明显差异，即提早开花并不能使开花植株的青蒿素含量有所提高，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。 2．将拟南芥的早花基因CONSTANS (CO)置于CaMV 35S启动子之下，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导转入青蒿(Artemisia annuaL．)，使之在青蒿中表达，并得到了抗性植株。PCR、PCR-Southem blot及Southemblot检测表明，外源基因co已整合到青蒿基因组中;RT-PCR及RT-PCR Southemblot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，co转基因植株的开花时间较对照提前2周左右，但提早开花的转基因植株的青蒿素含量与未丌花的对照无明显差异，即植株开花前青蒿素含量的提高并不是由于开花本身引起的，再次证明，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。

青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究-金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析

第一部分：青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究 青蒿素是从中药青蒿中分离出的倍半萜内酯化合物，目前是世界上唯一有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿植株中青蒿素含量在开花期最高，但是目前尚不清楚开花与青蒿素生物合成的关系。为此，我们用光周期（短日照）诱导青蒿提前开花，不仅同时获得了开花与不开花的青蒿植株，而且还成功地在同一植株上诱导部分分枝开花，另一部分分枝保持营养生长状态。这一实验体系为研究青蒿开花与青蒿素生物合成的相关性奠定了基础。实验结果表明，开花与不开花青蒿植株青蒿素含量有明显差异。开花植株的青蒿素含量在前2周内逐渐提高，第三周（开花期）达到最高，并保持一周左右，在随后的2周内下降。青蒿植株开花后，叶片便开始老化变黄，逐渐死亡。未开花青蒿植株的青蒿素含量动态在前三周内与开花植株类似，但是这种高青蒿素含量状态能保持较长时间，至少在随后的2周内没有下降。未开花植株的叶片依然保持绿色。这一结果表明，开花不是导致青蒿素含量提高的直接原因。 扫描电镜观察结果表明，幼嫩叶片上的毛状腺体( trichrome)结构是完整的，而在老化的叶片上，则观察到了相当比例(40-50%)破损的腺体。这可能是导致青蒿素含量下降的直接原因。 不同生态型青蒿对光周期的反应是不同的。在北京地区，本地青蒿在8月初便开始开花，而来自四川武陵的青蒿则要到9月份才能开花。根据这一特性，采用“南蒿北栽”的方法，能够使青蒿保持较长时间的营养生长状态，延长适于采收的时间。 第二部分：金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析 植物次生代谢物山屯酮( Xanthones)仅存在于龙胆科和藤黄科植物中。它们具有抑制单胺氧化酶，细胞毒素及抗肿瘤活性。 含有1 3个碳原子的二苯甲酮是山屯酮生物合成的中间产物，是由二苯甲酮合酶催化合成的，这一反应是山屯酮生物合成的关键步骤。二苯甲酮合酶已经在金丝桃和百金花细胞悬浮培养系统中检测到，并进行了细致的生化水平上的研究。本研究是在上述研究的基础上，进一步克隆该酶的基因，并进行异源表达及功能分析工作，以便更好地了解和调控山屯酮的生物合成。 用PCR和RT-PCR技术，从金丝桃cDNA文库和逆转录产物中分别克隆到一个基因HBPS1和HBPS2，从百金花cDNA文库中克隆到一个基因CBPS1。HBPS1含有1402个碱基，其开放阅读框架编码390个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为6.55。HBPS2含有1398个碱基，其开放阅读框架编码395个氨基酸，分子量为42.8 kDa，等电点为5.78。CBPS1含有1383个碱基，其开放阅读框架编码389个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为7.88。与GenBank中序列同源性比较结果表明：在氨基酸水平上，HBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性高达92%，HBPS2与萝卜（Raphanus sativus）查尔酮合酶的同源性为64%，CBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性为71%。HBPS1与HBPS2的同源性仅为62%。 将三个新克隆的基因的ORF整合到载体pGEX-G上的谷胱甘肽还原酶S基因下游，构建成转化质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，这三个基因的ORF片段均能被表达成约68 kDa的产物，这与期望的结果一致。 活性检测结果表明，HBPS1是查尔酮合成酶，其底物为香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：香豆酰辅酶A 2.8μM，丙二酸单酰辅酶A，11.2μM。最适反应条件是350C，pH7.0，DTT浓度10 μM。 HBPS2是二苯甲酮合酶，其底物是苯甲丙氨酰辅酶A，和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：苯甲丙氨酰辅酶A 2.4 μM，丙二酸单酰辅酶A 9.6μM。最适反应条件是350C，pH 6.5，DTT浓度50 μM。而CBPS1则没有检测到任何活性。从同一种植物中同时获得了查尔酮合酶和二苯甲酮合酶，对研究这两种十分相近的酶的差异表达，酶促反应机制等问题将非常有利。

青蒿素含量影响因子分析及青蒿生殖结构的研究

由于青蒿中青蒿素含量很低，造成生产上成本过高，限制了青蒿素的应用。因此找到青蒿素含量的影响因子，并利用这些因子提高青蒿素含量是十分必要的。 研究青蒿有性生殖过程和生殖结构能够为青蒿遗传育种方面的研究提供理论依据。 利用青蒿高产株系001的茎段作为外植体，通过诱导丛生芽的方法得到无性克隆系s．，利用s．进行了青蒿素含量影响因子的研究。发现在Hoagland培养液中添加0. 44mg/L浓度的ZriS04.7H20,5.72 mg/L的HB03,0.32 mg/L的CuS04.5H20或者5uLmol／L的茉莉酸甲酯时能够明显提高青蒿素含量。 一些试验结果表明青蒿素含量不但受到培养条件的影响，而且和青蒿自身的生长发育有很大的关系。青蒿素含量在营养生长阶段随着青蒿的生长而逐步提高，当每天日照长度短于临界日长一16.5小时，青蒿进入生殖生长阶段，青蒿素含量短日照处理的第9-18天最高，而这一阶段也恰好是青蒿花蕾出现和发育的时期，此后青蒿素含量持续变低。青蒿素在青蒿植株不同器官中含量不同，其中叶片青蒿素含量最高，花蕾中也较高，但茎中含量极低。在不同部位的叶片中含量由高到低的顺序为中部叶片》下部叶片》上部叶片。青蒿植株不同部位器官中青蒿素含量的差异可能和这些部位腺毛数量的差异有关。 遗传差异是导致青蒿各个植株间青蒿素含量差异的主要原因。对青蒿素低产（02卜1，021-5）高产02卜18, 02卜19, 021-20）的五个青蒿株系进行了RAPD研究，以中间型产量02卜g和02卜d两个株系作对照。用OPRON公司的A，B，c，D，K五组100条随机引物进行PCR扩增。发现OPA15 (5' TTCCGAACCC 3')能在所有高产株系中扩增到一条lOOObp的条带，而在低产株系中则扩增不到这条带。这个条带很可能是高产青蒿株系特有的条带( OPA151000)，并有可能作为高产株系的分子标记。 利用整体透明和石蜡切片技术对青蒿的生殖结构进行了研究，研究表明青蒿的头状花序球形，直径大约2—3mm。两性花10-30朵，单层花冠合生，开放时顶端5裂，内有5枚聚合雄蕊。一枚雌蕊，柱头两裂。单性雌花10-18朵，花冠舌状，雄蕊退化。两种花都是子房下位，单室倒生型胚珠。 雌配子体的的发育过程，大孢子母细胞经过减数分裂形成二分体和四分体，四分体中合点端的一个发育成具功能的大孢子，其它三个分解掉，胚囊发育成单核胚囊。然后通过三次有丝分裂经过二核胚囊、四核胚囊阶段发育到八核胚囊，最后形成七细胞、八核胚囊。卵细胞和两个助细胞组成卵器分布在珠孔端，而三个反足细胞分布在合点端。 小孢子母细胞经过两次减数分裂形成二分体和四分体，四分体中的小孢子释放出来后发育成单核花粉，单核花粉经过有丝分裂发育成二核花粉和三核花粉。

青蒿反义鲨烯合酶基因对烟草的转化

利用反义技术研究生物代谢途径以及对其生物合成进行调控成为植物次生代谢研究领域内一个重要手段之一，并与新兴的RNAi技术一起成为本领域内重要的研究热点。在植物类异戊二烯代谢途径中存在着羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）等几种关键的分支酶，他们被认为在异戊二烯类的生物合成中发挥着关键的调节作用。其中，鲨烯合酶处于HMGR和FPS的下游，并与倍半萜合酶等利用共同的前体－法呢基二磷酸（FPP），以FPP起始合成一系列的下游产物。因此，FPP成为类异戊二烯途径中的关键调节点之一。本论文基于此目的，利用反义技术研究了FPP合成鲨烯这一途径受到抑制对其他以FPP为生物合成前体的代谢支路的影响。 利用植物双元转化载体pBI121，将青蒿中鲨烯合酶基因的cDNA（约1.5kb）序列插入到pBI121中，取代原有的GUS序列，构建成植物转化载体pBIASS。以根癌农杆菌为介导，将青蒿鲨烯合酶反义基因序列导入到烟草，整合到其基因组中 ，成功获得转基因植株。对转基因烟草进行分子检测表明，外源鲨烯合酶基因的序列已经稳定整合到烟草基因组中，并对内源的烟草鲨烯合酶基因表达产生影响。转基因烟草中检测到内源鲨烯合酶基因的mRNA的水平降低。对鲨烯合酶下游产物之一的胆固醇的含量分析显示，活性减低的鲨烯合酶使胆固醇的生物合成下降约40％左右。同时，另一条以FPP为共同前体的二萜代谢途径产物之一GA3的含量得到了提高，比对照提高约30％。

水稻GA3应答基因表达谱微阵列分析与OsGAS1功能初步研究

利用反义技术研究生物代谢途径以及对其生物合成进行调控成为植物次生代谢研究领域内一个重要手段之一，并与新兴的RNAi技术一起成为本领域内重要的研究热点。在植物类异戊二烯代谢途径中存在着羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)、法呢基焦磷酸合酶（FPS）和鲨烯合酶（SQS）等几种关键的分支酶，他们被认为在异戊二烯类的生物合成中发挥着关键的调节作用。其中，鲨烯合酶处于HMGR和FPS的下游，并与倍半萜合酶等利用共同的前体－法呢基二磷酸（FPP），以FPP起始合成一系列的下游产物。因此，FPP成为类异戊二烯途径中的关键调节点之一。本论文基于此目的，利用反义技术研究了FPP合成鲨烯这一途径受到抑制对其他以FPP为生物合成前体的代谢支路的影响。 利用植物双元转化载体pBI121，将青蒿中鲨烯合酶基因的cDNA（约1.5kb）序列插入到pBI121中，取代原有的GUS序列，构建成植物转化载体pBIASS。以根癌农杆菌为介导，将青蒿鲨烯合酶反义基因序列导入到烟草，整合到其基因组中 ，成功获得转基因植株。对转基因烟草进行分子检测表明，外源鲨烯合酶基因的序列已经稳定整合到烟草基因组中，并对内源的烟草鲨烯合酶基因表达产生影响。转基因烟草中检测到内源鲨烯合酶基因的mRNA的水平降低。对鲨烯合酶下游产物之一的胆固醇的含量分析显示，活性减低的鲨烯合酶使胆固醇的生物合成下降约40％左右。同时，另一条以FPP为共同前体的二萜代谢途径产物之一GA3的含量得到了提高，比对照提高约30％。

青蒿素生物合成调控的研究章焰生

青蒿 (Artemisia annua) 是目前唯一用来生产抗疟药剂青蒿素的一种药用植物，由于青蒿植株中青蒿素的含量过低，使得青蒿素的生产不能满足市场的需要，提高青蒿植株中青蒿素的含量显得尤为重要，本论文围绕着调控青蒿素的生物合成作出了以下一些研究： 一、紫穗槐二烯合酶基因启动子的克隆 　紫穗槐二烯合酶是参与青蒿素生物合成的一个关键酶，以法呢基焦磷酸为底物，催化形成青蒿素分子所具有的杜松烯环状结构, 此酶被认为是青蒿素分支途径中的第一个关键限速酶，因此它的表达水平高低关系着流向青蒿素生物合成的碳流量。为了了解紫穗槐二烯合酶的表达模式，用Tail-PCR的方法我们从青蒿高产株系001中克隆得到紫穗槐二烯合酶基因的两个启动子，分别命名为AMSP1与AMSP2，序列比较分析可看出两启动子有三处大的差异片段，由此推测紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中可能是一个多拷贝形式存在，Southern杂交验证了这一点，结果表明，紫穗槐二烯合酶基因在青蒿基因组中至少存在三个copy;利用PLACE数据库对克隆的启动子的顺式作用元件进行分析，发现其中有光、茉莉酸甲酯等调控元件。5'RACE分析确定了紫穗槐二烯合酶基因的转录起始位点位于翻译起始位点上游44bp处。通过PCR的方法，我们对启动子AMSP2进行5′端缺失，缺失的5个启动子片段克隆进报告基因GUS的上游，以进行下一步启动子的特性分析。 二、紫穗槐二烯合酶的表达特性分析 　　RT-PCR半定量分析表明：光正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，黑暗培养条件下，青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录水平较低，一旦进行光照培养，紫穗槐二烯合酶的转录水平显著上升;茉莉酸甲酯对青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的表达调控具有光依赖性，在连续黑暗条件下，茉莉酸甲酯对紫穗槐二烯合酶的转录水平并无影响，而在正常光照与黑暗循环培养条件下，茉莉酸甲酯明显诱导了青蒿植株中紫穗槐二烯合酶的转录表达。鉴于在正常的培养条件下，茉莉酸甲酯正调控于紫穗槐二烯合酶的转录表达，我们研究了茉莉酸甲酯对青蒿植株中青蒿素生物合成的影响，结果表明，茉莉酸甲酯并未促进青蒿素的生物合成，却诱导了青蒿素生物合成的前体青蒿酸的生物合成。 三、真空介导农杆菌转化青蒿植株瞬时表达系统的建立 　　探讨了真空强度、青蒿苗龄、农杆菌的浓度、共培养方式、共培养时间以及光对青蒿植株瞬时表达的影响，结果表明真空强度70－80mbar、30天的青蒿苗龄以及侵染农杆菌浓度OD600为2.0时有利于青蒿植株的瞬时表达;液体共培养极大地抑制了外源基因在青蒿植株的瞬时表达，固体共培养与滤纸共培养适合于青蒿植株的瞬时表达系统，二者之间无明显差异;共培养时间也是影响基因瞬时表达的关键因素，结果表明，3天或4天较2天共培养有利于外源基因在青蒿植株的瞬时表达;光对青蒿植株的瞬时表达有极大地抑制作用，而黑暗条件适合于青蒿植株的瞬时表达;此系统可用于不同基因型的青蒿植株。 四、青蒿过氧化物酶基因的克隆及功能分析 　　利用RACE方法，从青蒿高产株系001中克隆了一个第三大类植物过氧化物酶的cDNA。克隆的青蒿过氧化物酶氨基酸序列与白羽扇豆、辣根菜、小麦、烟草、蕃茄的过氧化物酶的同源性分别为42.0%、36.2%、38.9%、33.6%和32.8%。青蒿过氧化物酶的编码区被克隆进原核表达载体PET-30a，并在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达，过量表达产物主要以包涵体形式存在，但也有相当一部分可溶性蛋白出现。表达的蛋白具有明显催化抗坏血酸、愈创木酚的过氧化物酶活性，催化愈创木酚活性大约是催化抗坏血酸的1.8倍。氨基酸同源性分析与过氧化反应表明克隆的过氧化物酶属于植物第三大类过氧化物酶。青蒿过氧化物酶间接促进了青蒿细胞提取液中青蒿酸向青蒿素的生物转化，但不能直接以青蒿酸作为催化底物。 五、外源赤霉素处理与开花对青蒿素、青蒿酸生物合成的影响 　　研究结果发现在青蒿的营养生长期喷施外源赤霉素明显促进了青蒿素的生物合成，同时青蒿酸含量呈下降趋势;从营养期至生殖期，青蒿酸的含量逐渐下降，至开化前期青蒿酸含量下降到最低，从开化前期至开花后期，青蒿酸的含量无多大变化，随着青蒿的发育，从营养生长期至开花期，青蒿素的含量呈上升趋势，至开化盛期时青蒿素含量达到最高。外源赤霉素处理与开花打破了青蒿素生物合成的瓶颈，诱导了青蒿酸向青蒿素的生物转化。

青蒿高效遗传转化体系的建立与青蒿素生物合成的分子调控

青蒿素是从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药。青蒿素在国际市场上供不应求，而青蒿植株中青蒿素的含量很低，因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。通过基因工程获得转基因青蒿高产株系是提高青蒿素产量的最有潜力的途径之一。 对不同基因型青蒿进行不同的激素浓度配比的比较研究，得到丛生芽诱导率较高、生根诱导率较高的激素配比，从而建立了青蒿高效再生体系。然后系统地分析了青蒿丛生芽诱导、丛生芽生长、丛生芽生根诱导对Kan的敏感性。对影响根癌农杆菌介导青蒿转化的转化效率的两个主要因素，即农杆菌类型和青蒿基因型，以及其它影响因素，即预培养时间、侵染液的组成、共培养的方式和时间进行比较研究，建立了根癌农杆菌介导的青蒿高效转化体系。本高效转化和再生体系的转基因植株的得率为4%至10%，而且转基因植株再生周期短，再生能力强。 通过基因工程，在青蒿高产株系中过量表达本实验室从青蒿中克隆的FPS基因，结果转基因青蒿中FPS的酶活性是非转基因青蒿的2-3倍;转基因青蒿的青蒿素含量最高可达0.9%（DW），是非转基因青蒿中青蒿素含量的1.34倍。这些结果进一步论证了FPS在青蒿素生物合成代谢中的调控作用。

反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响

青蒿素是从中药青蒿中提取的新型抗疟药物，然而，青蒿素在青蒿中的含量非常低。近年来，随着青蒿素生物合成途径相关酶基因的克隆，基因工程成为提高青蒿素含量的有效途径之一。在对青蒿进行遗传转化过程中，高效稳定的丛生芽诱导体系是青蒿转化成功的关键。然而，随着继代次数的增多，青蒿丛生芽诱导能力存在退化现象。本文首先研究了滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响和在遗传转化中的应用，进而研究了反义鲨烯合酶基因表达对青蒿素生物合成的影响。主要结果如下： 研究了在丛生芽诱导培养基上加铺滤纸对青蒿丛生芽诱导的影响，结果发现，加铺滤纸后青蒿丛生芽诱导率显著提高，丛生芽诱导率能够达到97%左右。在此高效丛生芽诱导体系的基础上，我们进一步探讨了滤纸在青蒿遗传转化中的应用。结果表明，在筛选培养基上加铺一层滤纸，青蒿的抗性丛生芽诱导率能够达到59.7%，其中在12.5%的抗性丛生芽中能够得到抗性生根植株，生根植株PCR检测均为阳性，在部分PCR检测阳性的植株中检测到了GUS的稳定表达。 利用上述改进的青蒿遗传转化体系，我们得到了反义鲨烯合酶基因的青蒿转化植株。PCR检测和Southern杂交检测结果证明了反义鲨烯合酶基因已经整合到青蒿基因组中。RT-PCR检测发现，在转基因株系ASQ3和ASQ5中鲨烯合酶基因在mRNA水平上得到部分抑制，鲨烯含量比对照降低了20%左右;青蒿素的含量分别提高了23.2%和21.5%，结果表明抑制鲨烯合酶表达能够有效促进青蒿中青蒿素的生物合成。

青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

青蒿素生物合成相关基因对烟草遗传转化的研究

　　青蒿素是存在于中药青蒿(Artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物，是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂，较传统抗疟药很少或无毒副作用，因此青蒿素的生产备受人们关注。目前，青蒿素的生产主要以植物提取为主，但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低（约占干重的0.01%～0.8%），从而导致青蒿素价格昂贵，使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治，故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源，降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。　　 　　本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的，开展了以下两方面的工作： 一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究 　　紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）是青蒿素生物合成的关键酶之一，为了能在烟草中合成青蒿素的前体，本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV 35S启动子控制下，通过根癌农杆菌介导转入烟草（Nicotiana tobacum L.），并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明，ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT-PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析，进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明，利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物，转基因植物中能够合成青蒿素的前体，这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。 二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究 　　鲨烯合酶（squalene synthase, SQS）是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一，利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5/端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列，借助中间克隆载体，经过三次亚克隆，最后形成含ASQS－RNAi表达盒的双元表达载体pART27－ASQS，并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法，共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR-Southern blotting 检测，证实外源ASQS基因已经导入烟草中，并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT-PCR分析说明，转基因烟草中SQS基因的表达已被成功抑制，部分转基因植株中内源SQS的干扰效果高达90％以上。对SQS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示，转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿，抑制青蒿中ASQS基因的表达，从而提高青蒿素的含量提供了可能。

中药青蒿萜类代谢物谱分析及青蒿素生物合成的研究

青蒿素是从中药青蒿，学名黄花蒿（Artemisia annua L.）植物地上部分分离出的抗疟疾有效单体，为一种倍半萜内酯类化合物，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。青蒿素生物合成途径及其调控机制仍不完全清楚，本论文采用GC-MS 和GC×GC-TOFMS 方法对青蒿萜类代谢物谱进行检测，用多维统计学方法对检测结果进行整理和比较分析，研究青蒿素生物合成及其与青蒿中其他萜类代谢的关系，取得了以下结果： 一、通过GC×GC-TOFMS 方法对青蒿挥发油成分进行分析，共鉴定出303 种组分。其中挥发油中相对百分含量大于1%的10 种组分中有9 种为萜类化合物，含量接近总挥发油的50%。在相对百分含量大于0.1%的49 种成分中，有30 种萜类化合物。有27 种相对百分含量大于0.1%的成分首次在青蒿挥发油中报道，其中包括10 种萜类化合物。 二、利用GC-MS 方法分析了青蒿001 和SP18 两个青蒿素高产株系不同生长时期萜类代谢物谱，结果表明：青蒿中萜类化合物在不同时期合成和积累是动态变化的，萜类化合物的种类和数量在营养生长期随生长时间的延长而提高，在营养生长后期和现蕾前期达到最高水平，进入生殖生长后随生长时间的延长而迅速降低。通过多维统计PLS-DA（Partial Leasted Square Discriminant Analysis） 分析，确定001 中有17 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中15 个为萜类化合物。SP18 中有18 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中16 个为萜类化合物。青蒿素，青蒿酸，二氢青蒿酸，青蒿素B 都是含量变化明显的标记物。其中青蒿酸和二氢青蒿酸含量在营养生长后期达到最高水平，进入生殖生长后迅速下降，而青蒿素和青蒿素B 在整个检测时期含量变化相对较小，在营养生长时期含量已经较高，在现蕾前期含量稍有上升，进入现蕾期后有所下降，本研究确定现蕾前期为代谢物谱分析最佳取样时期，并为药材采收提供指导。 三、不同基因型青蒿代谢物谱研究表明，青蒿素高产株系SP18 和001 代谢物表现出一定的差异，通过多维统计PLS-DA 分析，共找出了22 种在两种基因型中差异明显的化合物，其中包括倍半萜化合物12 种，单萜化合物3 种，三萜化合物4 种。SP18 特征化合物为樟脑和两个未鉴定倍半萜化合物，而001 特征化合物是龙脑和β-法呢烯。另外两种基因型中青蒿素及相关前体化合物的积累模式差异明显，SP18 中二氢青蒿酸和青蒿素含量高，而青蒿酸和青蒿素B 含量极低；001 中二氢青蒿酸和青蒿素含量相对SP18 要低，但青蒿素B 和青蒿酸含量比SP18 要高。该结果表明在青蒿素高产株系中，青蒿素含量与二氢青蒿酸的含量呈正相关，结合Brown 等的活体标记研究结果分析，从二氢青蒿酸到青蒿素的转化可能是青蒿素合成的限速步骤。 四、利用GC×GC-TOFMS 方法对转基因青蒿萜类代谢物谱进行了分析，共对200 个左右化合物峰进行PLS-DA 和OSC-PLS (Orthogonal Signal Correction–Partial leasted Square)多维统计分析，结果表明：青蒿萜类代谢物谱在外源基因转入后发生显著变化，与对照株系相比均呈现显著差异。其中过量表达Amorpha-4,11-diene 合酶基因（ads）株系中青蒿素及相关化合物变化最明显，而过量表达FPP 合酶基因（fps）株系中青蒿素及相关化合物变化相对较小，在受到调控而成为差异标记物的化合物中，70%是倍半萜类化合物。 五、考察了外源茉莉酸甲酯对青蒿素生物合成的影响，结果表明：300 μM 外源茉莉酸甲酯能提高青蒿素含量，在处理后第8 天青蒿素含量提高38%。青蒿萜类代谢物谱研究表明，茉莉酸甲酯不仅可以诱导青蒿中青蒿素的合成，还能诱导很多化合物，特别是倍半萜和三萜类的合成。OSC-PLS 分析结果找出了9 个处理后含量明显提高的标记物，其中6 个倍半萜化合物，3 个三萜化合物。标记物鲨烯含量提高了67%，另一个未鉴定出结构的倍半萜提高了60%，这些化合物可能与青蒿素有着类似的调控机制，而外源喷洒茉莉酸甲酯可以作为提高青蒿素产量的有效途径之一。

中药青蒿紫穗槐二烯合酶基因表达及调控的研究

青蒿素是从我国传统药用植物中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。目前，青蒿素生物合成的组织部位及其调控机制仍不完全清楚。紫穗槐二烯合酶（amorpha-4， 11-diene synthase, ADS）作为青蒿素生物合成分支途径的第一个关键酶，催化倍半萜化合物的通用前体法呢基焦磷酸环化，生成紫穗槐二烯。本论文通过对ADS 表达特性的分析，研究了青蒿素生物合成的组织特异性及其调控机制，主要研究结果如下： 一．紫穗槐二烯合酶基因启动子功能的研究 从青蒿高产株系001 中克隆得到了2850 bp 的ADS 启动子调控区。通过比较5’RACE 的测序结果与启动子序列，确定转录起始位点位于翻译起始位点上游44 bp，TATA 盒下游27 bp。该启动子序列包含的顺式作用元件有脱落酸应答元件(ABRE )、乙烯应答元件(ERE)、生长素应答元件(AUXRE）等植物激素反应元件，以及低温应答元件（LTRE）、高温应答元件（HSE）等与逆境有关的反应元件，还有与真菌诱导有关的W-box 元件等。将不同长度ADS 启动子与报告基因GUS 融合，构建了植物表达载体，通过农杆菌介导的方法获得稳定整合的转基因烟草。经过组织化学、GUS 荧光活性检测及RT-PCR 分析，发现该启动子的转录活性很低，无法通过GUS 染色进行观察。GUS 荧光活性检测及RT-PCR 结果表明，转录起始位点上游346 bp 是ADS 基础表达所必需的。高温、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸甲酯等处理均能促进青蒿中ADS 的表达，而脱落酸和乙烯的作用效果较小，与启动子序列分析的结果并不完全一致。 二．紫穗槐二烯合酶基因表达特性的研究 以青蒿高产株系001 为材料，在基因和蛋白水平揭示了ADS 的表达特性。RT-PCR 和Western 分析结果表明，ADS 在幼叶和花蕾中大量表达，在老叶和完全开放的花中表达量很低，而在青蒿的根和茎中几乎检测不到ADS 的表达。石蜡切片和整体原位杂交的结果表明，ADS 在顶端分生组织、叶原基及分泌腺毛中表达，在非分泌的T 型腺毛中不表达。当叶片完全展开后，ADS 只在分泌腺毛中表达，而且随着叶片的生长和老化，ADS 的表达量逐渐减少。另一个非常有趣的发现是同一叶片上的分泌腺毛，有些有ADS 的表达，有些则没有。用强光、低温、高温和水杨酸等因素处理后，有ADS 表达的分泌腺毛的比例没有明显的变化。 三．外源水杨酸促进青蒿素的生物合成 研究了外源水杨酸对青蒿素生物合成的影响，结果表明：1 mM 水杨酸处理后，青蒿叶片中的游离态水杨酸含量快速增加，处理后4 h 达到 0.79 μg g-1 FW，是对照的3.5 倍。外源水杨酸能够抑制青蒿中过氧化氢酶活性，提高抗坏血酸过氧化物酶活性，并通过对抗氧化酶活性的抑制引起青蒿体内活性氧水平的迅速升高。在处理后4 h，青蒿中H2O2 和O2-的含量分别达到对照的2.1 倍和2.4 倍。青蒿素含量在水杨酸处理后的前8 h 缓慢升高，随后升高的速度增加。外源水杨酸处理后8 h 和96 h，青蒿素含量分别达到9.1 mg g-1DW 和13.9 mg g-1DW，比对照高21.7%和75.8%。处理后8 h，青蒿酸的含量没有明显变化，随后开始增加。处理后16 h，青蒿酸的含量达到3.6 mg g-1DW，比对照高90%， 随后继续升高，至96 h 达到4.98 mg g-1 DW，比对照高127%。二氢青蒿酸的含量在处理后的8 h 内有所下降，随后缓慢升高。处理后8 h，二氢青蒿酸的含量降低了23.3%，随后二氢青蒿酸的含量开始升高，在处理后96 h，达到7.4 mg g-1DW，比对照高72.1%。外源SA 处理提高了青蒿素及其前体的总含量，在处理后1、2、4 天分别比对照提高了1.3、1.5 和1.8 倍。Northern 结果表明，水杨酸强烈诱导了青蒿素生物合成基因HMGR、ADS 的表达，但是对FPS、CYP71AV1 的诱导作用较小。这些研究结果表明，外源水杨酸至少通过两条途径诱导青蒿素的生物合成：一是通过诱导活性氧的产生促进二氢青蒿酸向青蒿素的转化；二是上调部分青蒿素生物合成相关基因的表达。根据这一研究成果，在青蒿田间栽培中，可以在收获前通过喷施水杨酸来快速、有效和低成本地提高青蒿素产量。