软体动物线粒体基因组学及分子系统发生研究

本研究以双壳纲、翼形亚纲、珍珠贝目、扇贝超科的栉孔扇贝(Chlamys farreri )、海湾扇贝(Argopecten irradians)和牡蛎超科巨蛎属(Crassostrea)的长牡蛎(C. gigas)、葡萄牙牡蛎(C. angulata)、熊本牡蛎(C. sikamea)、香港巨牡蛎(C. hongkongensis)和近江牡蛎(C. ariakensis)5种牡蛎及异齿亚纲、帘蛤目、帘蛤科的紫斑文蛤(Meretrix pethechialis)为研究对象，系统的研究了以上物种的线粒体基因组全序列的特点。并以线粒体12个蛋白质编码基因的序列，在氨基酸和核苷酸水平上构建了软体动物的分子系统发生树。本研究旨在为利用线粒体基因组全序列全面构建软体动物分子系统发生树，为软体动物的系统发生和进化研究提供一种新的思路和前期基础工作，本研究主要内容分为以下三个部分： 一、栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体基因组序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR技术扩增了栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体全基因组，利用步移法结合文库构建的测序策略获得了线粒体基因组的序列。海湾扇贝线粒体全基因组长度为16,211 bp，栉孔扇贝接近全序列长度为20,789 bp。两个基因组都编码35个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和21个tRNA。与典型的动物线粒体基因组相比，两个基因组都缺少一个蛋白质编码基因atp8和2个trnS, 在海湾扇贝基因组中有1个trnF的重复，而在栉孔扇贝基因组中有1个trnM的重复。基因排列比较显示，尽管海湾扇贝、栉孔扇贝和巨扇贝分类学上属于同一扇贝科，但是它们的线粒体基因排列非常不同。在四种扇贝中，虾夷扇贝与栉孔扇贝的基因排列顺序非常相似；即使排除tRNA的比较，栉孔扇贝和海湾扇贝基因组仅仅共享三个小的基因块；而海湾扇贝与巨扇贝仅有一个相同的基因块。在所有的系统发生分析中，四种扇贝稳定的系统发生关系得到强有力的支持，海湾扇贝较其他三种扇贝较早的分化出来；栉孔扇贝比其他两种扇贝与虾夷扇贝亲缘关系更近。贝叶斯法和最大似然法分析都支持扇贝超科的单系发生。 二、巨蛎属牡蛎线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了巨蛎属C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis 5种牡蛎线粒体全基因组序列，并于GenBank已公布的美洲牡蛎C.virginica序列进行比较研究。C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis线粒体全基因组长度分别为18,225 bp、18,225 bp、18,243 bp、18,622 bp和18,414 bp，都长于C. virginica基因组17,244 bp的长度。本研究的5种牡蛎线粒体基因组都编码39个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和25个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，都缺少一个蛋白质编码基因atp8，有trnM、trnK和trnQ 3个tRNA基因的重复，更特别的是基因组中的rrnL分为两段，这在其它线粒体基因组中未见报道，有一个重复的rrnS；而C. virginica基因组编码37个基因，与其他牡蛎相比，没有trnK和trnQ重复，只有一个rrnS。基因排列比较显示，巨蛎属的5种牡蛎C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis基因排列完全一致，而与C. virginica的基因排列相比仍然有较大的差别，有多个tRNA发生易位。系统发生分析显示，C. gigas和C. angulata首先聚在一起，然后与C. sikamea聚为一支。C. hongkongensis和C. ariakensis聚成一支。C. virginica为单独的一支。系统树清楚的显示出C. gigas和C. angulata以及C. hongkongensis和C. ariakensis非常近的亲缘关系，这也是长期以来，牡蛎分类学上的经典问题，有学者认为C. gigas和C. angulata为同一物种，线粒体基因组的数据显示C. gigas和C. angulata可能达到不同物种的差异。传统分类上的“近江牡蛎”的“白蚝”和“赤蚝”，线粒体序列差别明显，完全支持两种牡蛎新种名的制定。 三、紫斑文蛤线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了紫斑文蛤线粒体基因组全序列。该基因组全长19,567 bp，编码36个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和22个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，缺少一个蛋白质编码基因atp8和1个trnS, 有1个trnQ基因的重复。基因排列比较显示，双壳类的基因排列在低的分类阶元时相对保守。在帘蛤科中，紫斑文蛤M. petechialis和菲律宾蛤仔V. philippinarum共享四个完全一致的基因块，两个大的基因块是cox1-L1-nad1-nad2-nad4L-I 和 cox2-P-cob-rrnL-nad4-H-E-S2-atp6-nad3-nad5，另两个小基因块只包括tRNA基因。在以氨基酸序列构建的分子系统树中，帘蛤科紫斑文蛤与菲律宾蛤仔首先聚在一起，然后，它们与A. tuberculata形成一个进化枝。这一枝与H. arctica结合起来，支持异齿亚纲单系发生。

Two trichodinid ectoparasites from marine molluscs in the Yellow Sea, off China, with the description of Trichodina caecellae n. sp (Protozoa : Ciliophora : Peritrichia)

The morphology and infraciliature of two ectoparasitic ciliates, Trichodina caecellae n. sp. and T. ruditapicis Xu, Song & Warren, 2000, parasitising the gills of marine molluscs from the Shandong coast of the Yellow Sea, China, were investigated following wet silver nitrate and protargol impregnation. T. caecellae was found on the small marine sand clam Caecella chinensis Deshayes and is distinguished mainly by the acute triangle-like blade, the very delicate central part and the needle-shaped ray. T. ruditapicis was studied based on four populations from three clams: two populations from Ruditapes philippinarum (Adams) and one each from Saxidomus purpuratus (Sowerby) and Solen grandis Dunker. All four populations fell within the range of morphometry and agreed closely in the overall appearance of the adhesive disc. However, variability was found in the denticle structure, especially in populations from different host clams. Our observations suggest that denticle morphology may be more or less variable between and within populations, and that such minor differences should not be overestimated. It should be emphasised that, except for the denticle morphology, the bright granules or circles in the centre of the adhesive disc represent another important feature facilitating the identification of this trichodinid species.

Chromosomal rearrangement in Pectinidae revealed by rRNA loci and implications for bivalve evolution

Karyotype and chromosomal localization of major (18-5.8-28S) and minor (5S) ribosomal RNA genes were studied in two species of Pectinidae, zhikong (Chlamys farreri) and bay (Argopecten irradians irradians) scallops. using fluorescence in situ hybridization (FISH). C. farreri had a haploid number of 19 with a karyotype of 3m + 4sm + 7sm-st + 4st + 1st-t, and A. i. irradians had a haploid number of 16 with a karyotype of 5st + 11t. In C. farreri, the major and minor rRNA genes had one locus each and were mapped to the same chromosome-Chromosome 5. In A. i. irradians, the major rRNA genes had two loci, located on Chromosomes 4 and 8, and the 5S rRNA gene was found at a third chromosome-Chromosome 10. Results of this and other studies indicate that karyotype of A. i. irradians (n = 16, 21 arms) is secondary and derived from an ancestral karyotype similar to that of C. farreri (n = 19, 38 arms) through considerable chromosomal loss and rearrangements. The ability to tolerate significant chromosomal loss suggests that the modal karyotype of Pectinidae and possibly other bivalves with a haploid number of 19 is likely tetraploid; i.e., at least one genome duplication has occurred during the evolution of Bivalvia.

扇贝营养需求与代用饲料研究

营养学是生物学研究的重要组成部分。对养殖对象营养需求的深入研究是未来养殖业持续健康发展的重要保证。滤食性贝类营养学研究起步较晚，与鱼、虾营养学相比也有不小的差距。本论文在揭示饥饿对栉孔扇贝肥满度、营养组成和代谢影响的基础上，着重研究了不同蛋白源对栉孔扇贝生长的影响和黑西哥湾扇贝对主要营养成分的需求。实验部分 I：目前，贝类营养学研究通常是通过强化某一种工某几种营养来进行的，而在饥饿这一特殊条件下贝类的生理活动情况却少见报导。本实验研究了饥饿对扇贝生命活动的影响，从这一特殊的角度研究了扇贝对各种营养组分的利用情况，同时为揭示近年来栉孔扇贝大规模死亡的原因和机制提供参考数据。实验结果表明，饥饿60d不会导致栉孔扇贝的大批死亡；饥饿对栉孔扇贝肥满度的影响较大，以饥饿10d后最为明显；饥饿对不同组织营养组成的影响首先表现在内脏团粗脂肪相对含量的急剧下降和蛋白质相对含量的增加；饥饿期间的O:N 比（耗氧量/排氨量）在饥饿20d后下降到最低值，然后又有所回升。实验期间，O:N比小于10，这表明在饥饿期间栉孔扇贝以蛋白质代谢为主。实验部分 II：滤食性贝类对何种来源的蛋白质摄食、吸收较佳，以及滤食性贝类对蛋白质和糖类的需求情况都是值得注意的问题。本实验配制了三种配合饲料，其中两种参照滤食性贝类天然饵料单胞藻的营养成分，其蛋白源分别为植物性原料（螺旋藻粉和豆粉）和动物性原料（鱼粉和贝边粉）；另外还配制了主要成分为糖类的地瓜粉饲料。在研究不同营养条件下栉孔扇贝（Chlamys farreri）的摄食、同化和生长情况的基础上，初步确定了不同蛋白源和糖类对栉孔扇区贝生长的影响。结果表明：栉孔扇贝对单胞藻组饵料的摄食率最高，以下依次是动物蛋白组，地瓜粉组和植物蛋白组。而贝类对植物蛋白饲料组的同化率最高，以下依次是动物蛋白组，单胞藻组和地瓜粉组。在不同营养条件下，栉孔扇贝的生长明显有差异。就不同规格的栉孔扇贝而言，三角褐指藻效果最好，以下依次为：动物蛋白饲料，地瓜粉饲料和植物蛋白饲料。由此可见，在配合饲料中，营养效果为：动物性蛋白> 糖类 > 植物性蛋白。不同营养条件对栉孔扇贝的内脏部分和肉柱部分生长的影响基本相同。实验部分III：应用正交实验设计法研究了黑西哥湾扇贝（Argopecten irradians concentricus）对饲料中蛋白质、糖、脂肪及维生素C的适宜需求量，并初步筛选了最佳饲料配方。实验结果表明：在本实验条件下，就黑西哥湾扇贝性腺指数，肉柱指数，内脏团指数和肥满度而言，最佳营养成分含量相同，均为：蛋白质35%，糖类39%，脂类9%，维生素C含量对贝类生长影响不大。在三种营养物质中，蛋白质含量对性腺指数和肥满度的影响最大，而糖尖含量对肉柱指数和内脏团指数的影响最大。脂类含量对贝类生长的影响相对较小。本实验结果下最佳配方为：蛋白质35%， 糖类39%，脂类9%，与实验结果中各营养物质的最优水平一致。