大蒜、绊根草中重金属抗性分子机制的研究

日益加剧的重金属污染已经危害到了全球的生态环境以及人类健康。在分子水平上阐明植物中的重金属抗性机制并应用于环境修复和绿色农业是植物科学和环境科学以及农业科学的交叉点和新的生长点。为了了解植物重金属抗性的分子机制，我们的研究主要是从重金属抗性植物材料大蒜(Allium sativumL．)和绊根草(Cynodon dactylon)中分离重金属抗性相关基因，并研究它们在重金属抗性机制中的功能。 在高等植物中有迹象表明，一种富含半胱氨酸的低分子量蛋白．类金属硫蛋白 (Metallothioneins Like，MTs Like)和一类具有Y-(Glu-Cys) n-Gly特殊结构的多肽一植物络合素(Phytochelatins，PCs)在重金属抗性机制中占有重要地位。然而人们对于同一种植物中这两种重金属结合肽作用的相互关系还缺乏了解，同时对于MT Like基因以及PCs合酶基因在同一种植物中的表达模式如金属离子专一性、时空表达特点等，还投有文献报道，因此本文将首先以这两个基因为切入点进行研究。 本研究采用RACE的方法，从大蒜中分离得到了类金属硫蛋白(MT-Like)的cDNA序列(GenBank Accession No.AY050510)，PCR和SoutheLrn Blot分析表明，大蒜基因组中不仅存在类金属硫蛋白基因，而且可能以基因家族的形式存在。对获得的MT Like cDNA进行的序列分析及同源性分析表明，大蒜MT Like cDNA含有一个完整的开放阅读框架，编码73个氨基酸，其中12个为半胱氨酸，占氨基酸总数的1 6.4%，并与其他植物如水稻、小麦、紫羊茅草中的类金属硫蛋白基因同源性较高，其中最高达89%。对该基因编码的氨基酸序列和结构分析表明在N-端、c-端结构域中分别含有3个典型的金属硫蛋白的结构模式Cys-Xaa-Cys，属于典型的Type-1类金属硫蛋白。这些Cys-Xaa-Cys特征结构表明大蒜MT Like基因编码的蛋白可以结合二价金属离子。重金属胁迫下大蒜根中MT Like基因在转录水平的表达检测表明，MT Like基因的表达受重金属离子Cu2+、Cd2+的诱导，暗示MT Like基因在大蒜对重金属的抗性中有重要作用。此外，用能谱电镜技术研究大蒜中重金属的积累与分布，以及用组织原位杂交技术分析MT Like基因的表达定位与重金属的积累、转运的关系已在进行之中。 植物络合素也是富含巯基的多肽化合物，在重金属抗性中起重要作用。由植物络合素结构中存在的Y一酰胺键或β-Ala可知PCs不是基因表达的直接产物，而是以GSH为前体的酶促反应产物。目前已知y一谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶(简称为PCs合酶，phytochelatin synthase，PCS)是PCs合成途径的关键酶，编码这一关键酶的基因目前已在小麦、拟南芥菜和裂殖酵母中克隆。由于这一基因在不同物种中的保守性较低，其克隆较困难。本研究通过设计植物络合素台酶基因简并引物，从大蒜中扩增得到了345bp的cDNA序列。序列分析和推测的氨基酸序列同源性比较表明，此序列的翻译产物与已知的植物络合素合酶同源性最高，此cDNA序列应为大蒜植物络合素合酶基因的部分cDNA序列(GenBank Accession No.AF384110)。目前大蒜植物络台素合酶基因的全长序列的扩增，以及这两种与重金属抗性有关的基因(MT Like，PCS)的表达模式仍在研究中。 本文还尝试了利用酵母重金属敏感突变株M379/8功能互补的方法从重金属抗性植物绊根革中分离新的重金属抗性相关基因。构建了用于转化的酵母质粒表达文库，探索了酵母转化体系建立的条件。曾尝试多种转化方法，并对其中的条件进行了优化改进。下一步的工作将集中在合适的酵母突变体的筛选或穿梭表达载体的选择标记基因替换上

大蒜重金属抗性基因的克隆及其功能分析

金属硫蛋白（metallothionein，MT）和植物络合素（phytochelatin，PC）是植物中能够与金属离子结合的两大类多肽。二者均富含Cys，但前者是mRNA的编码产物，后者是酶促反应的产物，植物络合素合酶（PCS）则是合成PC的关键酶之一。目前已发现许多植物同时存在金属硫蛋白基因和植物络合素合酶基因。研究重金属胁迫下这两类基因的表达对了解植物的重金属抗性的分子机制具有重要意义，同时还可以为培育能用于植物修复的品种提供新思路。 本论文从大蒜中克隆了一个type 2 MT基因，命名为AsMT2a，将其在大蒜中的表达模式与大蒜的植物络合素合酶基因（AsPCS1）进行了比较，并对二者的过表达转基因拟南芥的重金属抗性进行研究。其主要结果如下： 1． AsMT2a基因全长525 bp，编码79个氨基酸，其中有14个Cys 残基。 推测的氨基酸序列分析表明其Cys的位置和数目与来自其它植物的type 2 MT蛋白的完全一致。 2． RT-PCR的结果显示，大蒜根部AsPCS1的表达在Cd处理的短期（1 hr）内迅速增强，同时PCs含量也大幅度增加。但AsMT2a的表达在Cd处理10 hr后才有明显的增加。说明AsPCS1可能在植物对重金属的急性解毒方面起主要作用，而AsMT2a则在植物对重金属长久耐性中的离子平衡方面起更大作用。暗示在大蒜暴露于Cd胁迫的不同时期AsPCS1和AsMT2a基因可以互相协调而对重金属胁迫作出反应。此外，在不同胁迫条件下，AsPCS1和AsMT2a的表达模式不同，其中Cd、As和热激可以促进根中AsPCS1的表达和PCs的积累。 3．将AsPCS1和AsMT2a转入对砷和镉敏感的酵母菌株 FD236-6A中，RT-PCR的结果显示这两个基因均可在酵母中稳定表达，对转化子的重金属抗性实验表明这两个基因均可提高转化子对砷和镉的抗性。 4．将AsPCS1和AsMT2a 置于 CaMV 35S启动子下转入拟南芥中，RT-PCR结果表明，这两个基因均可在拟南芥中表达。有趣的是，AsPCS1在拟南芥中存在两个转录本，且二者均具有完整的ORF，其推测的氨基酸序列相差38个氨基酸。说明部分AsPCS1在拟南芥中经过了精确的剪切和拼接过程，但其机制尚不清楚。 5．在Cd 胁迫下，AsPCS1的超表达拟南芥的生长好于野生型植株，主要表现在转基因拟南芥的根较长，根数目较多;但在As胁迫下AsPCS1转基因植株与野生型植株没有明显的差别。与此不同的是将AsMT2a转入拟南芥后，转基因植株的As抗性明显增强，同样表现在根长度和根数目上。进一步将AsPCS1和AsMT2a同时转入拟南芥进行超表达，在Cd胁迫下，转基因植株的生长好于野生型植株，且种子萌发率也较高。 6．Cd和As胁迫下，AsPCS1过表达植株的PCs含量增加，同时Cd和As的积累量也明显增加，其中Cd胁迫下Cd含量增加最多，平均比野生型对照增加4倍;而As胁迫下As含量比野生型对照增加1.2倍。在Cd和As胁迫下，AsMT2a过表达植株的Cd和As积累量与野生型相比分别增加1.4倍和0.8 倍。双价基因AsMT2a +AsPCS1过表达植株的 Cd 积累量是野生型的5.8倍，是AsMT2a过表达植株的2.4 倍，是AsPCS1过表达植株的1.2倍。 在克隆AsMT2a的同时，我们还从大蒜中克隆到了一个金属硫蛋白基因家族的新成员，命名为AsMT2b，并对其功能进行了初步探讨。主要结果如下： 1．AsMT2b 全长520 bp，其开读框架为243 bp，编码80个氨基酸，其中含有15个Cys 残基。对推测的氨基酸序列分析表明AsMT2b的N端和C端domain内，Cys的数目和排列方式与其它type 2 MT蛋白明显不同。 其N 端domain内的结构为CXXC——CXC——CXC——CXCC，C端domain 内的结构为CXXC——CXC——CXC。暗示AsMT2b 可能具有与其它MT不同的生物学功能。 2．在较低浓度Cd（200 µM）胁迫下，AsMT2b的表达量随着处理时间（24 hr内）的延长而降低，但随着处理浓度的升高（500 µM）和处理时间延长（48 hr），其表达量又逐步增强，说明AsMT2b可能在胁迫强度增大到一定值时方起作用。 3． 将AsMT2b转入对Cd和As敏感的酵母菌株FD236-6A中，发现AsMT2b对酵母As抗性的提高贡献不大，但可明显提高酵母对Cd的抗性。 4．对AsMT2b的超表达拟南芥的重金属抗性分析表明，与野生型植株比较，转基因植株具有较强的Cd抗性，表现在Cd胁迫下，种子的萌发率较高，根较长，侧根数较多。但在As胁迫下，转基因植株的生长和野生型没有明显差异。可以看出，转AsMT2b的拟南芥对重金属的抗性不同于转AsMT2a的植株，前者的抗Cd性较强，而后者的抗As性较强。 5． Cd胁迫下，AsMT2b过表达拟南芥的Cd含量明显增加，平均比野生型对照植株增加70％，但各个株系的增加幅度不一致。 另外，我们还对CdCl2胁迫下，大蒜幼苗中镉的积累及氧化胁迫和抗氧化能力的变化进行了研究。结果表明在CdCl2 胁迫下，大多数Cd在根部积累，而只有少量的Cd积累于叶片中。5 mM 和10 mM CdCl2 抑制SOD和CAT的活性，但随着处理时间的延长，二者的活性回复到对照水平或高于对照。在CdCl2胁迫下，POD的活性明显增强，同时脂质过氧化产物积累。这些结果说明镉胁迫下，植物细胞中氧化胁迫加剧，而抗氧化酶活性的增强是植物对次生氧化胁迫的一种适应策略。 综上所述，在重金属胁迫下， AsPCS1和AsMT2a之间及AsMT2a和AsMT2b之间均表现出明显的协调反应。这种协调反应可能是植物维持细胞内离子稳态的机制之一。而重金属胁迫下，过表达AsPCS1，AsMT2a或AsPCS1+AsMT2a的拟南芥体内的重金属含量明显增加，表明这些基因可望用于重金属污染土壤的植物修复中。