火炬松体细胞无性系建立及其形态发生调控的研究

火炬松（Pinus taeda L.）原产美国东南部，是世界南方松中最重要的绿化和造林用速生针叶树种，现广泛分布于全球亚热带和部分热带地区，在我国的栽植面积居世界第2位，仅次于美国。目前，火炬松离体快速繁殖、遗传转化和品种改良研究中最大的障碍是没有获得良好的植株再生体系。本研究以火炬松的成熟种子为试材，建立了可调控的体细胞胚胎发生和器官发生植株再生系统，并对再生过程中的形态学变化进行了细胞学观察和扫描电镜观察;建立了胚性细胞悬浮系，测定了其重要生长参数的变化动态，优化了悬浮条件下体细胞胚胎发生的培养条件及悬浮细胞原生质体直接体细胞胚胎发生的培养条件。 进行了HA、HB、HC、MA、MB、MC、LA和LB等8种不同基因型的成熟合子胚在BMS、DCR、GD、LM、LP、MNCI、MS、SH及自行设计的TE等9种不同基本培养基上的愈伤组织诱导试验，筛选获得了愈伤组织发生频率较高的基因型HB、MA和MC，及基本培养基DCR和TE。激素组合试验表明，2,4-D和BA最有利于愈伤组织发生。两因子5水平等重复的愈伤组织诱导试验及方差分析结果证实，8 mg•L~(-1)2,4-D和4 mg•L~(-1)BA是愈伤组织诱导的最佳激素组合。诱导产生的愈伤组织经2次继代后，可明显分为4种类型，它们是1）白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织（WTGM）;2）淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织（YLGG）;3）淡绿色、疏松的颗粒状愈伤组织（GLG）;和4）浅白色、水浸状的粘性愈伤组织（WMM）。其中白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织有较强的体细胞胚胎发生能力，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织有较强的不定芽发生能力。这两种愈伤组织的最高诱导频率分别是28.1%和35.7%。 在附加2,4-D、IBA和BA的DCR体细胞胚诱导培养基上，白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织中的胚性细胞形成胚性胚柄细胞团和早期原胚。提高培养基中的渗透压后，早期原胚发育成后期原胚。在附加ABA、PEG和活性炭的DCR体细胞胚成熟培养基上，后期原胚发育成子叶胚。在无激素DCR培养基上，子叶胚萌发形成再生完整植株。体细胞胚转换成小植株的最高频率是18.4%。在直接体细胞胚诱导增养基和直接体细胞胚发育培养基的作用下，成熟合子胚的子叶和胚轴上直接形成体细胞胚。直接体细胞胚胎发生的最高频率是18%。 在附加NAA、IBA和BA的TE不定芽原基诱导培养基上，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织中的胚性细胞形成不定芽原基。在附加IBA和BA的TE不定芽分化培养基上，不定芽原基分化产生不定芽。用基因型HB、MA和MC的淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织进行的试验表明，不定芽分化的最佳低温（4 ℃）处理时间是5～6周，最佳蔗糖浓度是25～30 g•L~(-1)。分化产生的不定芽在附加IBA、GA_3和活性炭的TE培养基上，幼茎伸长。附加IBA、BA和GA_3的TE培养基上，伸长的不定芽生根形成完整植株。伸长不定芽的最高生根频率是46%。成熟合子胚在直接不定芽原基诱导培养基及直接不定芽分化培养基的作用下，从子叶和胚轴的不同部位产生直接不定芽。直接不定芽发生的最高频率是58.2%。 由成熟合子胚诱导愈伤组织形成过程中的形态学观察表明：在附加2,4-D和BA的DCR愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA主要在下胚轴形成愈伤组织，MC主要在子叶和胚根形成愈伤组织，HB主要在胚根形成体积较小的愈伤组织。在附加NAA和BA的TE愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA在单个子叶的顶端形成生长较快的愈伤组织，MC的所有子叶都形成愈伤组织，HB在所有子叶的顶端形成愈伤组织。 石蜡切片观察表明：4类愈伤组织的细胞组成不同．第1类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞及核呈柱状或新月形的体积较大的非胚性细胞组成;第2类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞组成，第3类愈伤组织主要由体积较大的棒状、葫芦形、新月形、盾片状细胞组成、第4类愈伤组织主要由体积较大的薄壁细胞和细胞壁加厚、细胞间连结紧密、无细胞核的分化细胞组成，第1类愈伤组织上形成的早期原胚的特点是：胚性头部由排列紧密、体积小的园形细胞组成，轮廓十分清晰、呈半圆形，胚柄由排列疏松的长形细胞组成，细胞体积大、细胞中有大的液泡，早期原胚在发育过程中和母体组织保持一定的隔离状态。第2类愈伤组织上形成的不定芽的特点是t结构上为单极性，其维管束和母体组织保持密切联系。扫描电镜观察表明;直接体细胞胚基部和母体组织保持较少的联系，其子叶是直立生长的．直接不定芽基部和母体组织保持较多的联系，其幼叶是向心卷曲生长的。 在培养周期内，基因型HB、MA和MC胚性细胞悬浮培养物的几个生长参数的变化动态相似。鲜重增长高峰在12—15 d，干重增长高峰在15～18 d，细胞体积增长高峰和胚数增长高峰在18—21 d。在培养的18—21 d，培养液中的pH值、电导率和蔗糖浓度接近或降到最低点。在悬浮培养条件下，体细胞胚形成的最佳起始细胞密度是5～6×103个／ml。继代培养时间延长，体细胞胚胎发生能力下降。热激处理促进基因型HB和MA体细胞胚的形成，抑制基因型MC体细胞胚的形成。在悬浮培养物中，观察到了裂生多胚。 对数生长期的火炬松胚性悬浮细胞，在以甘露醇作为渗透压稳定剂的酶混合液Cel-lulase“Onozuka”RS l%+Cellulase“Onozuka”R-10 2.5%+Pectolyase Y-23 0.2%的作用下，原生质体的产量和活力均最高。原生质体在DCR和KM8P两种培养基上形成了体细胞胚（包括胚性胚柄细胞团、早期原胚和后期原胚）．体细胞胚形成的最佳起始原生质体密度是7×l04个/ml，最佳ABA浓度是4 mg．L-I．

盐角草（Salicornia europaea L.）SePSY和SeLCY基因克隆及功能分析

盐角草（Salicornia europaea L.）是一种叶片退化而茎肉质化，不具有盐腺和盐囊泡的真盐生植物，可以在1020 mM NaCl下生存。其特殊的形态适应特点使其成为研究植物抗盐性的良好实验材料。但目前与盐角草抗盐机理相关的生理和分子方面的研究还非常有限。本文以盐角草为材料，首先探讨了盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡的影响，在此基础上进一步克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶，八氢番茄红素合成酶（SePSY）和番茄红素β-环化酶（SeLCY）基因，并进行了功能分析。该研究对于了解类胡萝卜素在植物抗盐性中所起的作用具有重要意义。 盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡影响的实验结果表明：200 mM NaCl是盐生植物盐角草生长的最适盐浓度，在该盐度下盐角草中叶绿素a/b的比值和光饱和点升高，植株的光合作用表现出增强的效应，植株生长最佳。而27％ PEG-6000所模拟的渗透胁迫显著降低了盐角草中叶绿色a/b的比值，抑制其光合作用和生长。200 mM NaCl下，Na+的含量显著增加，但脯氨酸含量保持不变，说明Na+对盐角草渗透平衡的作用要强于脯氨酸。同时盐角草中液泡H+-ATPase（V-H+-ATPase）活性增强，而盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）在盐分和渗透胁迫下却表现为组成型表达;我们因此推断在盐分胁迫下，Na+的吸收是由于液泡H+-ATPase活性的增强，而不是诱导SeNHX1基因的表达。同时Na+的吸收可能进一步诱导了与光合作用相关基因的表达。 盐分对植物的影响涉及植物体内包括光合作用和活性氧代谢在内的多个代谢过程。在植物中，类胡萝卜素是植物捕光天线复合体（LHC）和光系统反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分。植物体内类胡萝卜素能够清除植物叶绿体，线粒体和过氧化物体在电子传递过程中产生的活性氧。同时类胡萝卜素是植物激素ABA的前体。200 mM NaCl虽然增加了盐角草细胞的渗透势，但并没有对其造成氧化胁迫和离子毒害，相反提高了其光合能力。类胡萝卜素作为植物活性氧的淬灭剂和光系统的组成成分，可能在盐角草抗盐机理中发挥着比较重要的作用。在过去的十年中，类胡萝卜素研究大多集中在其生物合成和提高作物中类胡萝卜素含量方面，可是，在植物对非生物逆境（如氧化和盐分胁迫）的适应机制中，类胡萝卜素合成途径究竟发挥什么作用目前还不是很清楚。为了了解盐角草中类胡萝卜素合成途径在植物逆境的适应机制中所发挥的作用，本文采用RACE的方法克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶基因 SePSY和SeLCY，将它们构建到植物表达载体SN1301中，转化拟南芥，并对它们进行了初步的功能分析。 研究发现盐角草SePSY基因全长1655 bp，编码419个氨基酸，推测分子量为47.2 kDa，等电点为8.92。其蛋白在1-65个氨基酸处有一个信号肽。在1-19和242-264氨基酸处有2个跨膜区。盐角草SeLCY基因全长1937 bp，编码498个氨基酸，推测分子量为56.1 kDa，等电点为8.41。其蛋白在1-37个氨基酸处有一个信号肽。在79-96，367-385和454-474氨基酸处有3个跨膜区。SePSY和SeLCY基因过量表达均促进转基因拟南芥的生长，转SePSY基因拟南芥次生根数目比野生型拟南芥明显增多。SePSY和SeLCY基因的过量表达还使转基因拟南芥对百草枯的抗性得到提高;SePSY基 因的过量表达增强了植株体内抗氧化保护酶过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）活性，但过氧化氢酶 （CAT）的变化不显著;转SeLCY基因株系POD，SOD，CAT的活性都有所增强，但转SePSY基因株系中POD活性明显高于 转SeLCY基因株系。转SePSY和SeLCY基因拟南芥叶片中丙二醛（MDA）和H2O2含量均降低，但转SePSY基因株系中MDA和H2O2含量明显低于转SeLCY基因株系。说明转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性得到了提高，同时使得光系统II（PSII）和细胞膜的结构和功能不被破坏。而转SePSY基因株系对盐分和氧化胁迫的抗性明显高于转SeLCY基因株系。SePSY和SeLCY基因的过量表达还提高了转基因拟南芥的光合效率，气孔导度和Fv/Fm比值。 SePSY和SeLCY基因转化拟南芥及其功能分析的初步结果表明，SePSY和SeLCY基因的过量表达提高了转基因拟南芥对体内活性氧（ROS）的清除能力，增强了拟南芥的光合能力，进而提高了拟南芥的抗盐性。

内蒙古大针茅草原碳循环模式初步研究

本文综述了全球碳循环研究、中国陆地生态系统碳循环研究及国内外草地生态系统碳循环研究的理论、方法、最新进展及主要成果。根据碱液吸收法对大针茅草原整个生长季土壤呼吸和地表凋落物分解的CO2排放速率的测定结果，分析了大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解的CO2排放速率季节动态，并比较了二者对大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解共同的CO2排放量的贡献。探讨了大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解的CO2排放速率与各种生物因子、环境因子的关系，以及生物因子、环境因子对大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解的CO2排放速率的协同作用;建立了土壤呼吸和凋落物分解的CO2释放速率与各种生物因子、环境因子及与它们的协同效应的回归模型。根据所建立的模型估算了大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解CO2年排放速率。最后，计算了大针茅草原生态系统各碳库的贮量及它们之间的流量，建立了大针茅草原生态系统的碳循环模式，初步评价了大针茅草原目前对于大气碳库的源汇功能。 本文初步得出以下结论： 1)在整个观测期内，大针茅草原由土壤呼吸和地表凋落物分解的CO2排放速率的季节动态呈梯形曲线型，它在8月下旬达到最大值2.51gCm-2d-l; 2)大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解速率的CO2排放速率季节变化趋势与地上生物量，尤其是地上绿色生物量部分的季节动态有一‘定同步性;地表凋落物层有减缓土壤向大气排放CO2的作用; 3)建立了大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解速率的CO2排放速率y(gCm-2d-1)与绿色生物量x1(g)、降水量X2 (mm)的回归模型： Y= -1.556+0.0171 x+0.0169 X2 （当y≤1.5867时） Y= 0.6395 - 0.0059 x+0.0103 X2 （当y>1.5867时） 其相关系数r为0.9954。 4)根据建立的模型估算大针茅草原土壤呼吸和凋落物分解C02年排放速率为367.81gCm-2Y-1; 5)大针茅草原目前对于大气碳库来说是一个碳汇，它每年从大气中净吸收C02速率平均为147.5gCm-2Y-1。

内蒙古毛乌素沙地不同生境油蒿(Artemisia ordosica Krasch.)灌丛地碳动态研究

油蒿(Artemisia ordosica Krasch.)是内蒙古鄂尔多斯高原特有的半灌木，构成该地区沙地优势植被类型。主要分布在固定、半固定沙丘，同时在流动沙丘也有少量分布。它在当地经济价值、防风固沙环保方面均处于无以取代的地位。在毛乌素沙地沙漠化日益扩大的严峻态势下,研究其群落地上、地下过程对生境变化的响应不仅对维持干旱、半干旱区生态系统稳定的管理措施上有所帮助，而且也有助于了解全球变化背景下物种对环境条件的长期变化适应策略。 为此，本项研究以毛乌素沙地为研究区域，利用异速生长关系确立不同生境油蒿生物量最佳回归方程，并调查、比较了毛乌素沙地固定沙丘、半固定沙丘和流动沙丘三个生境油蒿灌丛地的生物量、土壤和植被的碳储量、生产力和细根周转、土壤微生物生物量碳、氮和土壤呼吸。具体结果如下： 1. 建立并比较了油蒿枝、株两个水平上各部分（不含细根）生物量异速生长关系式，其中枝形态指标（枝直径BD、枝长BL、叶枝长LBL）与油蒿叶、枝、果各部分生物量的异速关系最好;株水平上冠层面积CA与其叶、枝干、果、粗根各部分生物量的回归效果较好。不同生境生物量与其生长变量的异速生长关系存在差异。2004年调查的油蒿灌丛生物量从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘分别是354.8，178.3和30.4 g m-2;各部分（叶、枝干、果、粗根、不同径级细根的)生物量都呈递减趋势。地下根与总生物量比值排序为固定>半固定>流动沙丘。不同生境细根生物量垂直分布存在差异，在固定沙丘根可至100 cm，半固定沙丘达90 cm，而在流动沙丘仅为60 cm，这些结果有助于使了解不同生境中的相同物种如何通过自身形态及其生物量调整来适应生境的差异。 2. 不同生境油蒿灌丛地植被碳储量和土壤碳储量在P < 0.05水平上差异显著，其中固定沙丘植被碳储量和土壤碳储量分别为224.04和7521 g C m-2，半固定沙丘是119.27和3029 g C m-2，流动沙丘是16.83和2300 g C m-2。可见沙区土壤有机碳远大于植被碳量。 3. 利用最大值减最小值方法、标准取样法和内生长土芯法研究了不同生境油蒿灌丛地的地上、粗根生产力和地下细根生产力。发现各生境生产力、细根周转都随着植被盖度增加而增加，地下根生产力与总生产力之比随着植被盖度增加而减少;不同生境油蒿灌丛地生产力在P < 0.05水平上存在显著差异，2005年总生产力范围在18.23-293.82 g m-2 yr-1之间;细根总周转率在0.16-0.54 yr-1之间。 4. 利用异速生产关系确立不同生境不同水平上油蒿叶面积的最佳回归关系式并对不同生境的比叶面积（SLA）进行了比较，其中枝水平上各生境叶面积与枝直径、枝叶长、枝长相关关系在P < 0.001水平上显著;株水平上各生境叶面积与株高、冠层面积相关关系在P < 0.001水平显著;从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘SLA由大变小，这可能与生境养分差异有关。 5. 不同生境油蒿灌丛地土壤微生物碳、氮和土壤呼吸范围分别在117.99-153.99 mg kg-1、1.49-3.31mg kg-1和0.54-1.96 μmol m-2 s-1之间，它们从固定沙丘、半固定沙丘到流动沙丘依次下降。

PLOD3基因3'调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20-24个碱基).其中,miR-124a是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用.由于miRNAs特异性地识别靶基因的3'端调控区(3'UTR)的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3'UTR的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA调控的改变.通过靶基因预测和3'UTR区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a的靶基冈中有一个基因(PLOD3)3UTR的靶位点中存在人类特异突变位点.利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3'UTR靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低.研究表明,miRNAs靶基因3'UTR的序列变异具有功能效应,它有可能足人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一.

大蹼铃蟾缓激肽及其制备方法和其基因

本发明涉及大蹼铃蟾缓激肽及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。其缓激肽为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由19个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量2180，等电点11.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：DLPKINRKGPRPPGFSPFR。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码大蹼铃蟾缓激肽基因核苷酸序列由cDNA由829个核苷酸组成，编码成熟大蹼铃蟾缓激肽为第140-196，224-280，308-364，392-448，476-532，560-616位6个核苷酸重复单元片断，从两栖类动物皮肤中得到的缓激肽基因作为基因工程制备缓激肽的应用。

烙铁头蛇毒L-氨基酸氧化酶的分离、纯化及其生物学活性

通过DEAF Sephadex A-50阴离子交换柱，Sephadex G75分子筛，Resourse Q阴离子交换柱三步层析从湖南产的烙铁头蛇毒中分离、纯化得到一个L-氨基酸氧化酶( T1vf LAO)，它由两个非共价的亚基组成，每个亚基的分子量为55 kD。与台湾产的烙铁头蛇毒L-氨基酸氧化酶分子量(70 kD)不同。T1v+ LAO的N末端氨基酸序列是ADNKNPLEECFRETNYEEFLEIAR，与报 道的蜂科的L-氨基酸氧化酶的相似性比眼镜蛇科的要高。T1vf LAO能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和痢疾杆菌的生长，杀死肿瘤细胞以及诱导血小板聚集。这些活性能被过氧化氢酶所抑制，说明T1vf LAO生理学功能主要是通过酶反应产生的过氧化氢( H202)介导的。

Purification, characterization and biological activity of an L-amino acid oxidase from Trimeresurus mucrosquamatus venom

An L-amino acid oxidase (TM-LAO) from the venom of Hunan Trimeresurus mucrosquamatus was purified to homogenicity by three steps including DEAE Sephadex A-50 ion-exchange chromatography, Sephadex G-75 gel filtration and Resourse Q ion-exchange chromatography. TM-LAO is composed of two identical subunits with a molecular weight of 55 kD by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The molecular weight was different with that of LAO purified from the same species distributed in Taiwan that was 70 kD. The 24 N-terminal ammo acid sequence of TM-LAO is ADNKNPLEECFRETNYEEFLEIAR, which shares high similarity with other Viperid snake venom LAOs and has moderate similarity with Elapid snake venom LAOs. Further studies found that TM-LAO inhibited the growth of E. colt, S. aurues and B. dysenteriae. TM-LAO also showed cytotoxicity and platelet aggregation activity. All the biological activities were eliminated by catalase, a H2O2 scavenger. It shows that these biological effects are possibly due to the formation of H2O2 produced by TM-LAO.

云南蝠蛾属一新种及生物学特性研究

描述了新种人支蝠蛾H. renzhiensis Yang的成虫、幼虫、卵、蛹的外 部形 态, 并观察了生活史与生态习性, 模式标本保存于第一作者单位。图3表2参5