Establishment and characterization of dual-species biofilms formed between a 3,5-dinitrobenzoic-degrading strain and bacteria with high biofilm-forming capabilities

In this study, the possibility of establishing a dual-species biofilm from a bacterium with a high biofilm-forming capability and a 3,5-dinitrobenzoic acid (3,5-DNBA)-degrading bacterium, Comamonas testosteroni A3, was investigated. Our results showed that the combinations of strain A3 with each of five strains with a high biofilm-forming capability (Pseudomonas sp. M8, Pseudomonas putida M9, Bacillus cereus M19, Pseudomonas plecoglossicida M21 and Aeromonas hydrophila M22) presented different levels of enhancement regarding biofilm-forming capability. Among these culture combinations, the 24-h dual-species biofilms established by C. testosteroni A3 with P. putida M9 and A. hydrophila M22 showed the strongest resistance to 3,5-DNBA shock loading, as demonstrated by six successive replacements with DMM2 synthetic wastewater. The degradation rates of 3,5-DNBA by these two culture combinations reached 63.3-91.6% and 70.7-89.4%, respectively, within 6 h of every replacement. Using the gfp-tagged strain M22 and confocal laser scanning microscopy, the immobilization of A3 cells in the dual-species biofilm was confirmed. We thus demonstrated that, during wastewater treatment processes, it is possible to immobilize degrader bacteria with bacteria with a high biofilm-forming capability and to enable them to develop into the mixed microbial flora. This may be a simple and economical method that represents a novel strategy for effective bioaugmentation.

麝鼠香化学成分与糖脂结构的质谱研究

天然产物和生物样品由于可获得的样品量少，并且它们常常是以多种结构相近的组份混合存在，因此对其结构的分析一直是具有挑战性的。先进质谱技术的不断问世，极大地促进了对天然产物和生物样品的直接分析。本论文采用气相色谱/质谱联用技术对天然麝香和麝鼠香的苯提取物进行了定性和定量分析。同时，利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱和电喷雾多级串联质谱对从菌种中分离得到的糖脂混合物进行了结构鉴定和质谱研究。实验结果表明，质谱作为一种快速而有效的分析方法，是分析天然产物和生物样品的不可缺少的手段之一。1. 天然麝香和麝鼠香苯提取物的气相色谱/质谱分析 根据保留时间和电子轰击质谱图，鉴定了麝鼠香苯提取物中的33个组份，其中多数组分属于新发现的成分。在麝鼠香苯提取物中，大环酮/醇为主要组成，并且它们都以奇数环酮/醇的形式存在。通过与天然麝香的麝香酮比较可知，麝鼠香中不含有麝香酮。麝鼠香中与麝香酮具有相同分子量的化合物是其同分异构体，环十六烷酮，并不是多数文献所报道的麝香酮。由此可知，麝鼠香中的香气成分不是麝香酮，而是含量较高的环十五酮和环十七酮。利用单离子监控技术并结合标准麝香酮外标的方法对麝鼠香中的主要环酮化合物进行了定量分析。结果表明，各组份的含量相对稳定，不随泌香期香量的改变而变化。其中麝鼠香中的两个主香气成分环十五烷酮和环十七烯酮的含量为0.4%。2. 微生物体中糖脂混合物的生物质谱研究 利用激光解吸飞行时间质谱和电喷雾多级串联质谱对从名为Bacillus pumilus菌种中分离得到的糖脂混合物进行了直接分析。激光解吸质谱确定了其中两个主要糖脂的分子质量。糖脂在激光质谱中加合钠和钾离子的形式存在说明糖脂与碱金属离子具有较强的亲合性。电喷雾全扫描质谱结果表明此糖脂混合物是由脂肪酸链组成不同的糖脂化合物构成。通过分析和比较未知组份和已知组份的断裂途径，证实了未知组份的推测结构。糖脂加合不同碱金属离子的多级串联结果比较显示碎片离子的强度和离子的断裂途径是与碱金属的种类紧密相关的。糖脂加合钠离子的断裂途径提供了糖脂的基本骨架信息。糖脂加合锂离子得到各种有关糖基的碎裂。尽管糖脂加合钾离子不能够如同加合钠离子和加合锂离子那样产生较多的碎片离子，但是它的二级质谱可以确定糖脂的脂化位点。利用电喷雾多级串联功能，对在电喷雾质谱过程中出现的两个特殊碎片离子的断裂机理进行了探讨，同时推测了碱金属离子与糖脂化合物的作用位置。

微生物对抗菌肽耐受的诱导及耐受机理初步研究

抗菌肽是一类具有强大杀菌能力的肽类分子，同时还具有离子调节、免疫调节、蛋白酶抑制剂和自由基清除等其他生物活性。现已鉴定的抗菌肽超过1,200 种，几乎存在于所有生物种类中。在抗生素耐受严重的今天，抗菌肽极有潜力成为新型的有效抗菌药物，许多抗菌肽已进入临床前研究或临床研究。在本论文中，我们选择了无指盘臭蛙（Odorrana grahami）来源的三种抗菌肽（Brevinin 2E-OG1、Nigrocin-OG4 和Palustrin-OG1），单独或组合使用，以藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和白假丝酵母菌（Candida albicans）为研究对象，进行微生物对抗菌肽耐受性的实验诱导；并通过检测胞外蛋白酶活性、蛋白质组学等方法对微生物耐受抗菌肽机制进行初步的研究。将微生物培养于含有低浓度抗菌肽（单独使用或组合使用）培养基中，每日转接一次，每十次酌情提高抗菌肽浓度。80 次转接后，除藤黄微球菌未对 Palustrin-OG1 产生耐受外，其余所有的实验菌株均表现出对所用三种抗菌肽的耐受。但是Palustrin-OG1 与Brevinin 2E-OG1 或Nigrocin-OG4 联合使用能在一定程度上降低耐受性。将诱导后细菌于不含抗菌肽条件下培养，转接5 次后，对耐受现象无影响，说明这种耐受是可以稳定遗传的。抗菌肽耐受机制之一是分泌蛋白酶水解胞外抗菌肽，我们通过两种方式检测胞外蛋白酶活性，一种是检测发酵液的酪蛋白水解活性，另一种是检测发酵液处理抗菌肽后对抗菌活性的影响。结果发现枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌发酵液存在着蛋白酶活性，推测胞外蛋白酶可能与二者对抗菌肽的耐受有关；而白假丝酵母菌发酵液中未检测到蛋白酶活性。另外，我们还通过蛋白质组学的手段对枯草芽孢杆菌耐受机制进行了初步的研究，鉴定了5 个差异表达的蛋白，表达上调的蛋白有yraA（功能未知）、Tpx （巯基过氧化物酶，Thiol peroxidase）、pdhD（二氢硫辛酰胺脱氢酶，dihydrolipoamide dehydrogenase），表达下调的有cotN/TasA（芽孢膜相关蛋白，spore coat-associated protein）和gapA（三磷酸甘油醛脱氢酶，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 1 ，GAPDH）。yraA 和Tpx 都由Spx 调控，yraA 可以水解小肽增加自由氨基酸，而自由氨基酸增多时gapA、tasA 表达水平会下降，Spx 是由sigma-M 因子调控的，所以我们推测sigma-M 因子在B. subtiis 对抗菌肽耐受中起到了重要的作用。总之，本研究发现抗菌肽的联合作用会减缓微生物对其耐受的程度，为抗菌肽类药物研发提供了一种新思路；同时对抗菌肽耐受机制的初步研究也为今后的深入研究打下了基础。另外，我们还设计了一种新型的抗菌肽系统命名方法，并构建了昆明动物研究所抗菌肽数据库。

海洋细菌B3B河豚毒素高产菌株的选育及其发酵技术研究

中文摘要 河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一种剧毒的海洋神经毒素，具有戒毒、局麻、镇痛等多种功效，其国际市场的售价高达每克20万美元。本文对微生物源TTX进行了研究，期望为今后TTX的大规模生产提供理论依据和试验指导。 对我国渤海红鳍东方豚体内产毒细菌的微生态分布作了研究，共分离到了34株产毒细菌。对其中毒性较强的B3B菌株进行了进一步研究。生理生化试验及16SrDNA序列测定结果表明，该菌属于梭形芽孢杆菌（Bacillus fusiforms）。通过小鼠试验、薄层层析试验及质谱分析，初步认定发酵产物中含有河豚毒素。 为提高TTX的产量，我们采用紫外线、亚硝基胍对出发菌株B3B进行了诱变，获得了TTX稳定高产的突变菌株N14。应用均匀设计，对培养基组分进行了优化，获得较理想的发酵培养基，组成为蔗糖：0.2%、酵母膏：0.3%、酪蛋白胨：0.5%、KH2PO4：0.6%。优化后摇瓶发酵试验TTX的产量为5.42MU/20mL, 较优化前提高了128.7%。 在摇瓶发酵工艺的基础上，进行了N14 突变株10L罐发酵试验, 结果表明当发酵48h时，TTX产量最高，为21.2MU/20mL，较摇瓶发酵提高了290％。

磷霉素生物转化菌株的诱变选育

磷霉素（FOM）具有化学结构独特、适应症多、不易形成耐药性、可治疗危重感染等特点，其市场前景越来越被看好。但是，现在所采用的对称性化学合成工艺却存在着原材料浪费、环境污染和成本难以下降等问题。研究和开发磷霉素手性生物合成工艺可能是解决上述问题的一条可行途径。 在本论文之前的研究工作中，项目组筛选到了手性环氧化顺式丙烯磷酸（cPA）合成FOM的高效生物转化细菌－梭形芽孢杆菌（Bacillus fusiformis）FB7912，该菌株在cPA浓度为10mg/mL时的磷霉素产量为1.15mg/mL。本论文以FB7912为出发菌株，采用多种诱变方法对其进行诱变育种，并通过初筛和复筛获得了一株磷霉素产量显著增加的高效突变株，并对此突变株进行了相关特性研究。同时，本文还对几种不同诱变剂的诱变效应进行了评估。论文获得的主要研究结果如下： (1)采用了多种诱变方法－物理、化学及复合诱变对FB7912菌株进行诱变处理，如：紫外线、氯化锂、NTG、吖啶橙、（-）FOM耐受、NTG复合吖啶橙、NTG复合（-）FOM的诱变方法。结果表明，不同诱变因子对该菌株有着不同的致死效应和诱变效果。经过诱变，利用单菌落琼脂块法初筛共获得146株正突变株。其中，吖啶橙诱变处理筛选到了20株，NTG诱变处理筛选到了92株，（-）FOM耐受处理筛选到了25株，NTG复合吖啶橙诱变处理筛选到了6株，NTG复合（-）FOM诱变处理筛选到了3株，而紫外线和氯化锂诱变处理均未筛选到高效突变株。 (2)通过分析和比较不同诱变方法对FB7912的诱变效应，我们发现复合诱变的诱变效应要好于单一因素的诱变效应，化学诱变要好于物理诱变。以抗产物为最终目的的定向诱变的负突变率相对较低。从单因素化学诱变效应来看，NTG的诱变效应较强。以NTG复合吖啶橙的诱变结果为最佳，最后所得的正突变菌株即是从此诱变方法筛选得到。 (3)经过复筛，所选育到的菌株ZY39的最高磷霉素产量达到1.81mg/mL，比出发菌株提高了57.39%，而闫浩林等人报道的对另一株磷霉素转化菌株进行诱变仅使其产物产率提高33%。迄今已报道的最高产量的磷霉素转化菌株是一株Cellvibrio gilvus，当底物浓度为5 mg/mL时，其产物浓度达2.1 mg/mL。ZY39菌株的产物产量只比已报道的最高产量略低，但高于所有其它已报道菌株。 (4)对诱变所得菌株进行了磷霉素生物转化特性考察，发现与原始出发菌株相同，其顺丙烯磷酸的环氧化过程也具有严格的VO3-依赖性，Co2+和甘油对环氧化均有促进作用。

长期重金属污染胁迫下农田土壤微生物特征研究

本论文以沈阳张士污灌区土壤为例，首次采用传统微生物生态学与现代微生物分子生态学相结合的研究方法系统地研究了污灌区长期重金属污染胁迫下原位农田土壤微生物特征。结果表明，虽然已经停止污灌十多年，张士灌区土壤耕作层（0～30 cm）仍然存在普遍的Cd污染，灌区土壤Cd含量高达1.75～3.89 mg kg-1。部分区域土壤Cd呈现向下迁移的趋势,且同时伴随有Cu、Zn复合污染。灌区土壤Cd含量较高时清水灌溉能降低土壤表层Cd含量，灌区土壤Cd含量下降到一定程度（约2 mg kg-1）后，清水灌溉对消除土壤表层Cd污染的作用消失。重金属元素中Cd对土壤微生物的影响最突出，在三个不同季节中土壤Cd与土壤微生物生物量（MBC）和微生物商（qM）呈显著负相关，与土壤微生物代谢商（qCO2）呈显著正相关。所检测的微生物指标中qM和qCO2与多种重金属元素呈显著相关性，可作为评价一定程度重金属污染的微生物指标。土壤营养元素（除P外）与微生物特征呈显著正相关性，土壤营养元素对微生物的刺激作用有可能在某种程度上掩盖了重金属对土壤微生物的负面影响。 用16S rDNA-PCR-DGGE方法，研究了不同浓度Cd胁迫下土壤Cd抗性细菌群落结构的动态变化，结果表明在Cd的胁迫下Cd抗性细菌多样性显著增加，不同土壤样品中Cd抗性细菌群落结构向相似的方向偏移，群落结构最终将可能趋向一致。Cd胁迫使敏感菌Pontibacter消失，而伯克氏菌（Burkholderia）、罗尔斯通氏菌（Ralstonia）、芽孢杆菌（Bacillus���和节杆菌（Arthrobacter）则富集成为优势菌。 从张士灌区Cd污染土壤中分离出32株Cd抗性细菌，研究了Cd抗性细菌和Cd抗性基因cadA的分布特征。这32株Cd抗性细菌分别归属于拟杆菌门(Bacteroidetes)（37.5%）、变形菌门(Proteobacteria) （37.5%）、放线菌门(Actinobacteria)（9.4%） 和厚壁菌门(Firmicutes)（15.6%）。在液体LB培养基中对Cd的抗性浓度都大于2 mmol L-1，对Zn抗性浓度介于5～13 mmol L-1。首次从Cetobacillus���的Cd抗性菌株S1基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。在芽孢杆菌属(Bacillus)的4株菌N7，N9，N10和N11的基因组DNA中扩增出cadA基因的部分片断。序列分析结果表明这5株菌的cadA基因序列相似性为99％～93％，它们与坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus） cadA 基因序列(M90750）相似性为94％～92％。系统发育分析结果表明这5株菌的cadA都与Bacillus firmus cadA 基因有着较近的亲缘关系。不同属的Cd抗性细菌间cadA基因的高度相似性揭示了cadA基因能在不同种属间转移的特性。

微生物固定化方法修复多环芳烃污染土壤

针对传统游离微生物修复技术的缺点和弊端，提出了采用固定化微生物技术修复受多环芳烃污染的非流体介质的新课题。本文筛选出2株高效降解菌，并进行了固定化载体筛选，优化并确定了3种固定化工艺。通过实验室模拟实验，考察了固定化菌对PAHs污染非流体介质的修复能力，最后通过扫描电子显微镜（SEM）分析，对固定化微环境强化修复机制进行了初步探讨。 细菌芽孢杆菌（Bacillus sp.，SB02）和真菌毛霉（Mucor sp.，SF06）对土壤中的Pyr、BaP降解率高，降解速率快，为高效降解微生物。 碱化后的泥炭土适宜作为细菌固定化载体；玉米芯适宜作为真菌固定化载体；改性后蛭石适宜作为混合菌固定化载体。这些载体来源广泛，成本低廉，工艺简单，安全无毒。 将固定化菌应用于Pyr、BaP污染土壤的修复，考察了初始接种量、环境温度、土壤含水量对固定化菌降解Pyr、BaP的影响，固定化菌对不同系列浓度Pyr、BaP的降解，以及固定化菌在不灭菌土壤中对Pyr、BaP的降解，表明固定化菌对土壤中Pyr和BaP的降解率均高出游离菌20%，固定化混和菌降解效果最好，其次是固定化真菌，再次是固定化细菌。 SEM分析了固定化颗粒的微观结构和微生物在颗粒内部的形态变化，结果表明颗粒内部丰富的疏松多孔结构和巨大的比表面积为微生物提供了适宜的生存空间，使吸附固定化成为可能。 固定化菌对沈抚灌区PAHs污染土壤修复效果非常理想，经过6个月，土壤中总PAHs的去除率达70.3%，高于游离菌。

海洋细菌3512A对黄瓜枯萎病的防治及其生物学特性的研究

黄瓜枯萎病(Cucumber fusarium Wilt)又称萎蔫病、蔓割病，是一种世界性的植物维管束病害。1925年Weber 首次报道在美国佛罗里达州发生。该病由半知菌亚门，镰刀菌属尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)侵染所致，是一类主要经土壤传播的维管束病害，在我国瓜类种植区也普遍发生，在北方地区尤为严重。近年来随着蔬菜栽培面积的增加，土壤菌量逐年积累，此病的发生日趋严重。据统计，每年黄瓜枯萎病的发病率可达20%，严重时高达80%-90%，甚至全部毁种，导致了黄瓜的严重减产。 本论文从56株选自与海洋动、植物共生/共栖的细菌为资源，以黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)为靶菌，通过平板对峙试验筛选出8株具有较强抑黄瓜枯萎病菌作用的菌株，其中以海洋细菌3512A的抑菌效果最好。室内模拟实验表明该菌株能够在灭菌土和有菌土中高密度定殖，促进黄瓜幼苗的生长。盆栽试验表明其能够有效的防治黄瓜枯萎病，防效达64.29％～73.62％，还能促进黄瓜的生长，提高叶绿素含量，增加黄瓜的产量，可认为是一株植物根际促生菌（PGPR）采用传统的细菌学和分子生物学的鉴定方法对其进行了菌种鉴定，为枯草芽孢杆菌（Bacilluss subtilis）。 通过对抗菌谱的研究，发现海洋细菌3512A除了对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum) 有很强的抑菌活性外，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌和多种植物病原真菌都具有较强的抑制作用，抗菌范围广，可进一步做对其它农作物病害的防治实验。 海洋细菌3512A在盆栽试验中对黄瓜枯萎病的成功防治以及促生作用，为其良好的使用提供了指导并为其进一步的研究提供了基础。

中国南海深海沉积物中的微生物资源

由于采样条件和培养条件的限制，深海微生物研究的较少，因此目前海洋微生物资源的研究主要集中在近海和浅海。而深海独特的生态环境，使微生物形成了独特的代谢体系，成为新颖化合物的重要来源，具有很好的开发应用前景。本文首次较为系统的研究了深度为1758-3600m南海海底沉积物中深海微生物资源的分离和活性菌株的筛选情况，旨在为探索我国南海深海微生物资源提供一定的科学依据。 采用多种分离培养基从6个不同深度（1758、2620、3200、3500、3587和3600m）的南海深海沉积物样品中，分离到225株深海微生物，包括40株放线菌和185株细菌。以分离得到的225株深海微生物为研究对象，从产蛋白酶、抗真菌、杀虫三个方面进行活性菌株的筛选，研究南海深海沉积物中的微生物资源状况： （1）.将分离到的225株深海微生物，同时在10℃、28℃、45℃三个温度下进行产低温蛋白酶、中温蛋白酶、高温蛋白酶的筛选。初筛结果表明：这225株深海微生物大都有大小不同的产蛋白酶能力。10℃有产蛋白酶的有109株，28 ℃产蛋白酶的有160株，45℃产蛋白酶的有117株。筛选到一株在45℃下有较强产蛋白酶能力的菌株B1394，其酶活可达873U/ml，有一定的应用前景。通过形态观察、生理生化测定、16SrDNA序列测定，将B1394定名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。其粗酶液性质研究发现：最适酶活温度60℃，最适pH 8.0， 40℃、50℃和60℃热稳定性较好， Mn2+ 、Mg2+ 、Ca2+对该蛋白酶有激活作用，Hg2+ 、Fe3+ 、Cu2+ 、Zn2+ 、 Fe2+对其有抑制作用，苯甲基磺酰氟（PMSF）几乎完全抑制其活性，推断为丝氨酸蛋白酶。 （2）.对其中100株深海细菌和40株深海放线菌，以立枯丝核菌（ Rhizoctonia solani）和白色念珠菌（Candida albicans）为靶菌进行了抗真菌活性的筛选。初筛结果表明：分别有37株和35株深海细菌对立枯丝核菌和白色念珠菌有抑菌活性，分别占被检测细菌数目的37%和35%；有18株深海放线菌对立枯丝核菌有抑制作用，占被检测放线菌总数的45%。筛选到一株有较强抗真菌活性的深海放线菌SHA6，其发酵液对包括尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）在内的10种植物病原菌有明显的抑制作用。对其发酵液的理化性质进行初步研究发现SHA6发酵液具有良好的热稳定性和酸碱稳定性, 对SHA6进行分子生物学鉴定后将其初步定名为为橙色单胞菌（Aurantimonas altamirensis）。 （3）.以卤虫为初步筛选模型，对其中的20株深海放线菌进行了杀虫方面的筛选，结果发现有5个深海放线菌菌株表现有较强的杀虫活性。其中深海放线菌SHA4发酵液的乙酸乙脂提取物杀卤虫的活性最强，在浓度为100μg/ml时杀卤虫活性为83%,而在浓度400ppm时，48h可以杀死38%的甜菜夜娥。对SHA4进行分子生物学鉴定后将其初步定为拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis sp）。 总之，本论文阐明了我国南海深海沉积物中微生物资源状况的初步研究结果，为进一步开发利用我国南海深海微生物资源奠定了基础。

施肥和海洋微生物调控对桉树人工林土壤质量的影响

本文研究施化肥和海洋微生物制剂对桉树人工林土壤质量的影响。研究结果表明：施用不同的化肥对桉树人工林土壤质量影响具有明显差异；从海洋植物根际分离得到的微生物菌株制成的微生物制剂中的活性微生物菌株能够在桉树人工林土壤中定殖，对桉树生长具有一定促进作用。桉树凋落叶分解过程中是否释放化感物质是桉树人工林发展过程中人们普遍关注的问题之一，本论文也对该部分做了初步研究。 对施用长效尿素、芬兰复合肥、高峰复合肥三种不同化肥对桉树人工林土壤质量的的影响进行了初步研究，研究结果表明长效尿素在保障土壤氮素供应、促进土壤纤维素分离能力提高和增强土壤对磷元素吸收方面具有重要作用；芬兰复合肥在增强土壤呼吸作用和促进土壤酶活性提高方面优于长效尿素和高峰复合肥。 以两株海洋来源的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 3512, Bacillus subtilis 3728)和一株海洋木霉(Trichoderma TF4)为研究材料，在实验室条件下对其生防机理进行了研究，研究表明:两株枯草芽孢杆菌通过产生脂肽和蛋白酶对植物病原菌产生抑制作用；海洋木霉TF4则能够产生HCN，IAA类植物生长激素，同时还具有一定的解磷能力，具有很好的应用前途，采用传统分类学方法和分子系统学方法鉴定为棘孢木霉(T.asperellum)。这三株海洋菌株制成微生物菌剂，在原位条件和盆栽条件下考察了其对桉树生物量和土壤质量指标的影响，研究结果表明将三株海洋微生物混合后添加少量三叶草作辅剂，能有效改善桉树人工林土壤质量，并促进桉树树高和胸径的增加，具备进一步研究和开发成产品的价值。 用高效液相色谱(HPLC)对桉树凋落叶中毒性物质进行分离、纯化，以小麦、绿豆、大速生菜为指示植物，对分离到的物质进行毒性跟踪，分离到一个毒性较强的组分，经1H氢谱和NMR鉴定为3–β甲酰基–乌索酸。

海洋枯草芽孢杆菌3512A抗真菌脂肽的研究

芽孢杆菌 (Bacillus) 被认为是一种具有潜在的能有效抑制植物病原真菌并促进植物生长作用的有益菌种，它能产生许多种不同结构的抗菌物质，其中脂肽类抗菌物质是其中重要的一类。这些抗菌脂肽具有对动植物无害、对环境友好、不易产生交叉抗性等特点，因而在生物防治由真菌引起的病害中起着十分重要的作用。海洋中也存在着大量芽孢杆菌，并且由于海洋的特殊生存环境有可能开发出与陆生芽孢杆菌性质或功能不同的代谢产物。 本论文从108株海洋芽孢菌中筛选到一株抗真菌活性显著、脂肽产量高的海洋枯草芽孢杆菌3512A（Bacillus subtilis 3512A）。对该菌株产生的脂肽进行分离纯化，结合酸沉淀、Flash Chromatography、HPLC等现代色谱手段，从其发酵液中分离得到了 4 个纯化合物，分别是流分 4 中分离到的Comd.1 和Comd.2，以及流分 8 中分离到的ALP1 和 ALP3。流分 4 中的 Comd.1 和Comd.2 分子量分别为1036D和1050D，结合1D, 2D-NMR, MS 等结构分析后确定分子式分别为 C53H93N7O13 和 C54H95N7O13，Comd.2为Comd.1的甲基化产物，均属于surfactin 的同系物，其它组分还有待进一步测定分析。而流分 8 中得到的三个化合物 ALP1、ALP2 和ALP3，对ALP1 和ALP3进行鉴定，通过 TLC 原位酸水解实验、1H-NMR 图谱分析等推断 ALP1 和 ALP3也属于环状脂肽类化合物。对这两种脂肽化合物的氨基酸组成进行分析，发现这两种化合物的氨基酸组成相同，推测可能是一组同系物，且这两种化合物的氨基酸组成不同于目前已报道的脂肽类化合物的氨基酸组成，可能是一类新的脂肽类物质，其具体化学结构还有待于进一步分析鉴定。 考察3512A所产粗脂肽的热稳定性和pH稳定性，结果显示粗脂肽的热稳定性很好，即使在115 ℃、30 min, 活性只有部分损失；粗脂肽对酸的耐受性比较好，对碱有部分耐受性，pH10后活性降低显著。通过单因素法考查培养基组成和培养条件对3512A产脂肽能力的影响，研究结果表明，以蔗糖或葡萄糖作碳源，以硝酸铵为氮源，pH为8.0，每250 ml三角瓶装液量60 ml，以5% 的接种量28℃，180 r/min培养48 h，脂肽产量最高，达到1003 mg/L。

Nisin高产菌株选育及应用的研究

本论文以牛奶为原料分离出42株球菌，经鉴定其中15株为乳链球菌（Streptococcus lactis）。对15株乳链球菌进行Nisin效价测定后，确定SN-21为诱变的出发菌株（598.1IU/ml,NO.95培养基），经过硫酸二乙酯和紫外线的多次诱变后，选育出一株Nisin高产菌株（1514IU/ml,CM培养基），命名为S. L. 21 (Streptococcus lactis 21)。通过对S. L. 21发酵条件的选优，其Nisin效价达到1862IU/ml。采用紫外吸收光谱法确定S. L. 21发酵产物中的抑菌物质为Nisin。在Nisin高产菌株选育的同时，开创了Nisin应用于蕨菜罐头的加工贮藏研究。通过在蕨菜罐头中添加0.1g/kg的Nisin，降低了蕨菜罐头的杀菌温度（100 ℃）和杀菌时间（15min），保证了蕨菜的品质，提高了蕨菜罐头的贮藏安全性，这为低酸易软烂野生蔬菜食品的加工贮藏提供了一条重要途径。100 ℃，15min杀菌条件下，在加工的蕨罐头中，未添加Nisin的处理和添加苯甲酸钾（1.0g/kg）的处理，均出现胀罐，爆罐现象。经分析确定蕨菜罐头胀罐原因是由污染的细菌产气引起的。通过分离污染菌优势类群得到8株芽孢杆菌，经系统的细菌学鉴定，4~#菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），8~#菌株为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus），其余为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。经进一步产气试验证明5~#菌株产气快，产气量大，是引起蕨菜罐头胀罐的污染优势种，经研究发现蕨菜罐头污染菌优势种是一种枯草芽孢杆菌的新变种，命名为枯草芽孢杆菌嗜热耐盐新变种（Bacillus sutilis n. var. sp.），这株新变种具有耐热（90 ℃），耐盐（10%NaCl），产生的特点。对蕨菜罐头污染菌优势种（5~#）进行防腐剂抑菌试验发现其对Nisin敏感（MIC 500ppm），而对苯甲酸钠（MIC 1.5%）和山梨酸钾（MIC 3%）不敏感，抑菌率试验进一步证明，在允许应用范围内，只有Nisin对蕨菜罐头防腐有良好的效果，而苯甲酸钠和山梨酸钾抑菌效果均不理想。在Nisin对污染菌优势种（5~#）的溶菌作用试验中，通过电镜可以观察到，Nisin的作用首先是破坏细胞壁，细胞膜，造成细胞内物质外流，严重溶菌结果，导致污染细菌死亡。以上关于Nisin应用于蕨菜罐头防腐，蕨菜罐头污染菌优势类群的分析，污染菌优势种的研究的试验结果均为国内外首次报导。总之，通过在蕨菜罐头中添加Nisin来抑制污染菌优势种的生长敏殖，进而达到降低杀菌强度的目的，对于保证蕨菜固有的品质及今后蕨菜等野生资源的开发具有重要的意义。

地衣芽孢杆菌GXN151纤维素酶基因的克隆与表达

从广西大学农场陈旧稻草堆、甘蔗渣堆、龙胜温泉等地采集不同的土样和水样，从中共分离到10株能降解结晶纤维素的细菌、放线菌和真菌，对它们的165RNA或185 rRNA基因序列进行了分析，其中从稻草堆中分离到的好氧细菌GXN 151具有耐中温、生长迅速、能降解天然纤维素的特点。运用生理生化和电镜观察进一步将其鉴定为地衣芽抱杆菌。用pUC18和pBluescript KS＋作载体，分别以CoR工和品u3AI部分酶切的GXN 151的总DNA作目的片段，在大肠杆菌中构建了地衣芽抱杆菌GXN151的2个基因文库。运用含狡甲基纤维素的平板筛选法，从GXN151的基因文库中共筛选到14个表达梭甲基纤维素酶（CMCase）活性的克隆，采用酶切分析、亚克隆、Southern杂交、DNA测序分析将这些克隆划分为3类不重叠克隆群。pGxNLI、pGXNLZ、pGxNL7、pGxNP12和pGxNPI～pGXNP6共10个克隆归为一类重叠克隆，测序分析了PGXNLZ的序列，其长度为3672bP，其上含有一个完整的长1626 bp的ORF（GenBonk索引号为AY291583），可编码一个含542个氨基酸的内切葡聚糖酶Ce15A，其预计分子量为59，625D娜Ce15A含有家族5糖基水解酶催化功能域和家族3碳水化合物结合组件（CBM3）。PCR 扩增了ceJSA的编码框并将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）上，酶谱分析表明该基因在大肠杆菌JM109（DE3）和BL21（DE3） pLysS中均表达出具梭甲基纤维素酶活性的蛋白质产物。克隆pGxNLg测序共得5818bp，pGxNLg序列中含有一个完整的内切葡聚糖酶基因cel12A（GenBaok索引号为AY291066）和一个外切-Q-葡萄糖营酶基因amyA，cel12A长783 bp，可编码含261个氨基酸的蛋白质，预计分子量为29，035 Da，含有一个家族12糖基水解酶催化功能域。amyA为1680bP，推断其编码含560个氨基酸的蛋白质，预计分子量为65，121 Da。PCR扩增了cel12A基因的含催化功能域编码区的DNA序列并连接到表达载体pET30a（＋）上得表达质粒pGxN12A，pGXN 12A在大肠杆菌JM1O9（DE3）和BL21（DE3）pLysS中均J高效表达，并对表达条件进行了研究。克隆pGXNLS、pGXNPS和pGXNpn为一类重叠克隆，测序表明pGxNPll克隆的序列共为3406bP，它包括了一个完整的内切葡聚糖酶基因ce19A和一个不完整的纤维二糖水解酶基因ce148A，ce19A基因由1899bP组成，可编码一个含633个氨基酸的蛋白质，预计分子量为71，240Da。ce19A基因的产物Ce19A含有一个家族9糖基水解酶催化功能域和一个家族3碳水化合物结合组件（CBM3）。Ce148A属于糖基水解酶第4S家族，DNA杂交表明cel48A基因的未被克隆的下游序列位于一个约10kb的SaLI片段或4kb的EcoRI片段上。

长白山阔叶红松林土壤氮转化微生物作用的研究

自长白山北坡自然保护区采集阔叶红松林 A_0 和 A_1 层土壤。进行了微生物数量、土壤酶活性、微生物生物量、土壤速效氮及土壤中群体微生物氮转化测定；分离并鉴定了芽孢杆菌36株、产荧光假单胞菌34株，并对各优势菌株进行了氮转化活性的测定。A_0 层土壤在微生物数量、土壤酶活性、微生物生物量、土壤速效氮 (NH_4~+-N) 等方面明显高于A_1层。氨化作用、硝化作用速率也得到同样的结果；硝酸盐还原、固氮作用及同化作用速率两次采样测定的结果不同。而土壤速效氮 (NO_3~－N)是 A_1 高于 A_0层。芽孢杆菌的优势种是 B. megaterium 和B. cereus，产荧光假单胞菌的优势种是 P. fluorescens－F。所有分离到的芽孢杆菌及产荧光假单胞菌均能活跃地进行氨化作用。所有芽孢杆菌都能进行反硝化作用。而能进行反硝化作用的 P. fluorescens－F及 P. fluorescens－C其作用能力均高于 Bacillus S的20倍以上，同化作用是这两类菌的共同特征。不同种之间以及同种异株间进行氮转化速率的比较。有的差异很大。讨论了这两类菌的数量分布与土壤氮转化速率的关系。建立了反映土壤内部氮转化的模型。

Aspergillus sp136抗细菌耐药活性成分研究

基于广谱抗细菌耐药性这一思路，本研究中心建立了一套抗细菌耐药性化合物的筛选方法。由此从3000多种西南地区特殊生境的微生物和植物样品提取物中筛选获得17个抗细菌耐药性活性样品。对其中一株来自峨嵋山土样的微生物（Aspergillus sp136）进行了深入研究。通过TLC自显影等方法从其发酵产物中追踪分离得到抗耐药有效成分，并鉴定为烟曲霉酸。 采用多种方法对烟曲霉酸的体外抗细菌耐药活性进行评价。在平板扩散法中，烟曲霉酸表现出对青霉素（β-内酰氨抗生素）的协同抗耐药能力，其活性大约3倍于克拉维酸。在MIC的测试实验中，烟曲霉酸表现出对青霉素（β-内酰氨抗生素）以及非β-内酰氨抗生素如红霉素、四环素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素的抗耐药能力。在棋盘格杀菌以及时间致死曲线的研究中，烟曲霉酸也表现出对青霉素、红霉素、四环素的协同抗细菌耐药活性。 在广泛的活性筛选中发现烟曲霉酸对LDLR基因具有上调活性，表明烟曲霉酸可能具有降血脂的活性。 在研究中发现，同空白对照相比，烟曲霉酸使耐药菌（Bacillus cereus NCPF63509）细胞外β-内酰胺酶酶活大幅度下降，而细胞内β-内酰胺酶酶活仅略有上升，这表明烟曲霉酸对β-内酰胺酶分泌过程具有抑制作用。 综述了β-内酰胺酶的研究进展。 A two-step agar diffusion method was established to screen wide spectrum synergistic antibacterial agents. By using this method, 17 active samples against antibiotic resistance were discovered from more than 3000 plants and microbes, which were collected from southwest china. One isolate Aspergillus sp136 collected from E-mei mountain area was selected for further studies. From the metabolites of this strain, a synergistic antibacterial compound was isolated by bioautographic TLC assay-guided fractionation and identified as helvolic acid. The synergistic effect of helvolic acid was confirmed by several methods in vitro. The synergistic effect of helvolic acid with penicillin (β-lactam antibiotics) was about 3 times as that of clavulanic acid with penicillin in agar diffusion assay. In MIC studies, helvolic acid exhibited synergistic effects with β-lactam antibiotics such as penicillin and non β-lactam antibiotics such as erythromycin, tetracycline, kanamycin, streptomycin and gentamycin. In checkerboard and time-kill studies, helvolic acid also exhibited synergistic effects with penicillin, erythromycin and tetracycline. In general screen of bioactivities, helvolic acid upregulate LDLR gene, which was indirectly determined by the activity of fluorescent enzyme. Therefore, helvolic acid might have the ability to lower lipid in blood. Compared with blank control, the extracellular β-lactamase activity decrease significantly and the intracellular β-lactamase activity increase slightly in Bacillus cereus NCPF63509 in the presence of helvolic acid, indicating that the secretion of β-lactamase was inhibited by helvolic acid. The research of β-lactamase was reviewed.