藻胆体的光谱特性和光能传递

一，螺旋藻藻胆体光谱特性及其光能传递的研究 1，完整藻胆体与解离藻胆体吸收光谱的比较研究 对螺旋藻完整藻胆体和解离藻胆体的吸收光谱中进行了比较研究。随着PBS逐渐解离，其吸收光谱表现出如下变化特点：在紫外区，吸收峰始终位于355nm，尖形峰逐渐变成钝形峰;在红区，完整藻胆体和解离藻胆体都有很强的光吸收，吸收峰呈平顶状，其半带宽逐渐变小，紫外区与红区相对吸收强度比值逐渐变小，四组导数吸收光谱中的小峰数目越来越少。室温荧光发射光谱表明，PBS在低于0.9mol/L的磷酸缓冲液中变得不稳定，并开始逐渐解离，解离的PBS与完整的PBS相比，其荧光发射峰逐渐蓝移。 2，藻胆体在解离过程中荧光发射和光能传递的研究 完整藻胆体的室温荧光发射光谱中只有一个峰，在678nm。说明在完整藻胆体中，光能传递效率高。在77K荧光发射光谱中，完整藻胆体只有一个峰，位于682nm，这是L_(cm)(TE_1)的荧光峰;严重解离的藻胆体的主峰在656nm，是PC的荧光;在679nm有一个小峰，是APC-B的荧光(TE_2)。据此，我们提出螺旋藻藻胆体的光能传递链为：(此处表从略，见全文) 二，螺旋藻藻胆体核心及其与藻蓝蛋白的重组 PC+core混合物，浓缩重组48h后，其室温荧光发射峰位于663nm，与PC的室温荧光发射峰643nm和PC+core混合物（未重组）的室温荧光发射峰648nm相比，说明部分APC与部分PC发生了重组，使部分PC吸收的光能传递给了APC，使荧光发射峰红移;与藻胆体核心室温荧光发射峰664nm相比，则非常接近，说明重组效果较好。PC+core混合物（未重组），其77K荧光发射光谱中有两个峰：654nm,679nm,分别是PC,APC-B的荧光峰，F679/F654的比值为32.0%。我们以F679/F654比值的变化来判断PC与core是否发生了重组。PC+core混合物，经48h浓缩重组后，77K荧光发射光谱中有F657,F679两个峰，F679/F654的比值则为45.9%，比未重组的混合物32.0%升高了，说明部分PC与core发生了重组，部分PC吸收的光能传递给了APC和APC-B，使F679加强，F654减弱。 三，螺旋藻藻胆体一类囊体膜光谱特性与光能传递的研究 藻胆体一类囊体膜的吸收光谱，室温荧光发射光谱和77K荧光发射光谱表明：藻胆蛋白能将捕获的光能传递给叶绿素a，叶绿素a捕获的光能不能逆传给藻胆蛋白。 四，藻胆体一类囊体膜的重组 藻胆体一类囊体膜的吸收光谱说明，一部分被洗下来的PBS能重新结合到类囊体膜上，但并没有达到100%的重组。 五，整体螺旋藻光谱特性及其光能传递的研究 整体螺旋藻光谱特性与PBS-类囊体膜的光谱特性极为相似，表现出同样的规律：PBS的吸收面积与叶绿素a相比，叶绿素a的吸收是主要的。 从PBS-类囊体膜和整体螺旋藻的吸收光谱，室温荧光发射光谱，77K荧光发射光谱的研究中可知，二者表现出极为相似的规律：PBS藻胆蛋白捕获的光能能传递给叶绿素a，叶绿素a捕获的光能不能逆传给PBS藻胆蛋白。主要的捕光物质是叶绿素a。 另外，我们还对Spirulina platensis 6 and Spirulina maxima的藻胆体在解离过程中的荧光发射和光能传递进行了研究，表现规律与Spirulina platensis相同。

大蹼铃蟾皮肤白蛋白的分离纯化及抗体制备

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,在大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中得到其白蛋白(BmA-skin).该蛋白具有较强的胰蛋白酶抑制活性.用0.5mg/只BmA-skin作为免疫源免疫大白兔,经三次免疫后,抽取大白兔血液,分离血清,饱和硫酸氨沉淀,获得抗BmA-skin的多克隆抗体.经ELISA方法测定该抗体与大蹼铃蟾白蛋白发生免疫反应,抗体滴度为1:100000.

非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的细胞核转运及其选择性杀伤肿瘤细胞机制的研究

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(βγ-CAT)是从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的分子量为72 kDa的天然蛋白复合物.本研究通过激光共聚焦显微镜和Westem blot分析βγ-CAT在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞核转运机制,以及βγ-CAT对多株肿瘤细胞(HCT116,HT29,A375,Hela,THP-1等)的细胞毒效应.结果表明:βγ-CAT的α亚基中含有典型的GTP/ATPase的保守结构模体Walker A和Walker B,体外检测到βγ-CAT具有GTP/ATP水解酶和GTP/ATP结合活性.在细胞核转运过程中,βγ-CAT的α亚基和β亚基参与形成约150kDa含有泛素化修饰信号的大分子复合物,且泛素化修饰信号和βγ-CAT的α亚基和β亚基共定位于细胞内和融合于细胞核区域的转运囊泡小体中.βγ-CAT能够选择性的杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞脱落和发生凋亡.上述结果为进一步深入研究阡βγ-CAT的细胞核转运和调节细胞功能的分子作用机制提供思路和线索.

电镜分析非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物在人红细胞膜上的孔道形成效应

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(non-lens βγ-crystallin and trefoil factor complex,βγ-CAT)是一个从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的大然分子量为72kDa的全新的蛋白复合物.本研究测定了βγ-CAT处理红细胞后引起细胞内钾离子外流与溶血效应的时效曲线,结合扫描电子显微镜和透射电子显微镜分析βγ-CAT处理红细胞引起的早期形态学变化.结果表明:βγ-CAT(3 nmol/L)37℃处理红细胞5 min,(93.31±5.89)%的细胞内钾离子迅速外流(P＜0.01),相心溶解率为(13.12±1.92)%(P＜0.05).电子显微镜观察发现红细胞形态发生明显变化,细胞体枳增加,肿胀.少数红细胞表面向外形成棘状异常突起,部分肿胀细胞内的血红蛋白通过棘状突起缺口向细胞外喷射血红蛋白.表明βγ-CAT通过在红细胞膜上形成孔道使细胞内钾离子迅速外流导致红细胞内渗透压改变而溶血.其结果为理解βγ-CAT的溶血机制提供了直接的形态学证据.

大蹼铃蟾皮肤白蛋白的胰蛋白酶抑制活性研究

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,在大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤中得到其白蛋白.该蛋白有强烈抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其它丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制.它以1∶1摩尔比同胰蛋白酶形成稳定结合的复合物.经测定发现,该蛋白对温度、pH值及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,三种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大.说明大蹼铃蟾皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在大蹼铃蟾防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.

两栖类动物皮肤分泌物及其生物学适应意义--大蹼铃蟾皮肤分泌物蛋白质多肽组的启示

以大蹼铃蟾(Bombina maxima)为代表性物种,揭示了两栖类皮肤分泌物蛋白质多肽组丰富的分子和功能多样性.目前在大蹼铃蟾已发现的分子包括3类不同的抗菌肽、缓激肽、缓激肽增强肽和缓激肽拮抗肽、缓激肽基因相关肽、富含脯氨酸铃蟾肽及其基因相关肽、神经调节素U、Bv8肽、三叶型蛋白和蛋白酶抑制剂等.抗菌肽分子多样性及其形成机制、缓激肽及其基因相关肽功能和表达模式的多样性都较好地揭示了在多样的生态条件下,两栖类皮肤活性肽环境适应的分子基础及生物合成的调控机制.富含血红素辅基的白蛋白广泛分布在大蹼铃蟾皮肤外皮层细胞膜上和真皮海绵层内,表明它在皮肤的生理功能,如在呼吸、物质交换和渗透压调节中有重要作用.两栖类皮肤分泌物蛋白质多肽组,由于其分子结构的多样性、新颖性和哺乳类同系物的存在,在生物医学研究和天然药物开发中具有独特和不可替代的价值;同时,两栖类皮肤功能基因组具有多样性丰富、快速重组突变的特征,是探讨生物适应的基因基础、基因形成机制和进化特性等生物学基本问题的优秀模型.

大蹼铃蟾抗菌肽- 2 与IFN2α22b 和TNF2α对膀胱癌细胞株抑制活性的实验研究

目的:比较大蹼铃蟾抗菌肽- 2 (Maximin 2) 与肿瘤坏死因子2α(TNF2α) 、干扰素2α22b ( IFN2α22b) 对不同膀胱癌细胞株的抑制杀伤作用。方法:采用细胞培养及MTT 比色法,检测Maximin 2 、TNF2α及 IFN2α22b 对3 个不同膀胱癌细胞株的抑制作用及作用特点,计算量效回归曲线及50 %抑制率。结果: Maximin 2 对不同的膀胱癌细胞株在100μgPmL 左右(48 h) 即达到50 %抑制率浓度( IC50) ,并呈剂量相 关性,与TNF2α、IFN2α22b 抑制作用的表现形式不同。Maximin 2 抑制率最高表现在第48 h ,以后逐渐减 弱, TNF2α、IFN2α22b 则在前24 h 作用较弱,以后逐渐增强。结论:Maximin 2 对不同的膀胱癌细胞株均 有较强的抑制作用,同TNF2α、IFN2α22b 比较其作用机制有所不同,Maximin 2 对膀胱癌细胞株的杀伤作 用可能主要是通过对肿瘤细胞的直接抑制,并且相对容易失活。

大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株的抑制作用及对端粒酶的影响

目的探讨大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株的 抑制作用及对端粒酶的影响。方法采用肿瘤细胞培养方 法，检测大蹼铃蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株."%、/01’)+、 234/56的抑制作用；以.&-7’78&’9:02-方法检测大蹼铃 蟾蛋白提取物对膀胱癌细胞株端粒酶表达的影响。结果 大蹼铃蟾蛋白提取物表现出对膀胱癌细胞株有较强的抑制 作用；对膀胱癌细胞株端粒酶表达则无影响。结论大蹼铃 蟾蛋白提取物对多个膀胱癌细胞株具有直接细胞杀伤作用， 其作用机制不通过抑制端粒酶活性。

六种常见两栖类动物皮肤分泌物的生物活性比较

对6种常见两栖类动物皮肤水溶性分泌物的生物学活性与酶学活性进行了研究。其中，红瘰疣螈（Tylototriton verrucosus）、大蹼铃蟾（Bombina maxima）、华西蟾蜍（Bufo andrewsi）皮肤分泌物对小白鼠具有致死毒性，对小白鼠腹腔注射的半数致死剂量分别为11.5、18.8和264mg/kg。而沼哇（Rana nigromaculata）、泽蛙（Rana guentheri）、黑斑蛙（Rana limnocharis）的皮肤分泌物在小白鼠腹腔注射剂量达到500 mg/kg时仍不显示致死毒性。红瘰疣螈、大蹼铃蟾皮肤分泌物的毒性成分为3～60 kDa的多肽与蛋白质。6种两栖类动物皮肤分泌物都具有蛋白酶水解活性与胰蛋白酶蛋白酶抑制活性。红瘰疣螈、大蹼铃蟾和华西蟾蜍皮肤分泌物具有广谱抗菌活性。大蹼铃蟾、华西蟾蜍皮肤分泌物具有肿瘤细胞细胞毒活性。6种皮肤分泌物对哺乳类血液凝固系统无显著影响。仅发现红瘰疣螈皮肤分泌物具有磷脂酶A_2活性。6种皮肤分泌物均无乙酰胆碱脂酶活性。

大蹼铃蟾皮肤分泌液中抗菌活性肽的分离纯化及其性质

从云南产大蹼铃蟾( Bombina maxima)皮肤分泌液中分离得到了一种有广泛抗菌活性的多肽,被命名为MSP-VII。用快原子轰击质谱(f.a.b.m.s)分析其M+/Z=2648,即此活性肽的分子量为2647D。用自动氨基酸分析仪分析,含有26个氨基酸。抗菌实验结果表明,此多肽对格兰氏阴性和格兰氏阳性细菌以及真菌都有较强的抗菌活性。溶血实验表明此活性肽有很轻微的溶血活性。此外,MSP-VII也可以促进平滑肌收缩和增加微血管的渗透性。

Direct antimicrobial activities of PR-bombesin

PR-bombesin is a bombesin-like peptide derived from the skin of tile Chinese red belly toad, Bombina maxima. The 8-residue segment of N-terminal of RP-bombesin, comprising four prolines and three basic residues, is extensively different front other bombes

Frog albumin is expressed in skin and characterized as a novel potent trypsin inhibitor

A novel potent trypsin inhibitor was purified and characterized from frog Bombina maxima skin. A full-length cDNA encoding the protein was obtained from a cDNA library constructed from the skin. Sequence analysis established that the protein actually comprises three conserved albumin domains. B. maxima serum albumin was subsequently purified, and its coding cDNA was further obtained by PCR-based cloning from the frog liver. Only two amino acid variations were found in the albumin sequences from the skin and the serum. However, the skin protein is distinct from the serum protein by binding of a haem b (0.95 mol/mol protein). Different from bovine serum albumin, B. maxima albumin potently inhibited trypsin. It bound tightly with trypsin in a 1: 1 molar ratio. The equilibrium dissociation constants (K-D) obtained for the skin and the serum proteins were 1.92 x 10(-9) M and 1.55 x 10(-9) M, respectively. B. maxima albumin formed a noncovalent complex with trypsin through an exposed loop formed by a disulfide bond (Cys(53)-Cys(62)), which comprises the scissile bond Arg(58)(P-1)-His(59)(P-1'). No inhibitory effects on thrombin, chymotrypsin, elastase, and subtilisin were observed under the assay conditions. Immunohistochemical study showed that B. maxima albumin is widely distributed around the membranes of epithelial layer cells and within the stratum spongiosum of dermis in the skin, suggesting that it plays important roles in skin physiological functions, such as water economy, metabolite exchange, and osmoregulation.

大蹼铃蟾抗微生物肽及其制备方法和其基因

本发明涉及一种大蹼铃蟾抗微生物肽及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。抗微生物肽为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2840，等电点983，多肽氨基酸全序列一级结构为：NH2－SIGAKILGGVKTFFKGALKELASTYLQ－NH2。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经离子交换、高压液相反相柱层析分离纯化后得到。编码抗微生物肽的基因由663个核苷酸组成，其中编码成熟抗微生物肽为第165－245位核苷酸。抗微生物肽具有广谱和显著的抑制细菌和真菌生长作用。抗微生物肽基因作为基因工程制备抗微生物肽的应用。

饱食因子及其制备方法和其基因

本发明涉及一种饱食因子及其制备方法和其基因，属于生物医学领域。该饱食因子为从中国两栖类动物大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离得到的由28个氨基酸组成的一种单链多肽，分子量3229.57，等电点7.7，多肽氨基酸全序列一级结构为：Asp Met Tyr Glu Ile Lys Gln Tyr Lys The Ala HisGly Arg Pro Pro Ile Cys Ala Pro Gly Glu Gln Cys Pro Ile Trp Val-AMIDATION。制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，经凝胶过滤、离子交换柱层析、高压液相反相柱层析分离纯化后即得到。编码饱食因子的基因由1041个核苷酸组成，其中编码成熟饱食因子为第835-918位核苷酸。具有抑制进食，增强缓激肽生物效应的作用，作为制备肥胖症治疗药物，心血管系统疾病治疗药物的应用。