cDNA cloning, characterization and mRNA expression of a pacifastin light chain gene from the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis

The pacifastin family, characterized by several conserved arrays of six cysteine residues, is a newly identified serine protease inhibitor (SPI) family discovered uniquely in arthropods and plays important roles in multiple biological processes. In the present study, the full-length cDNA of a pacifastin light chain (designated ESPLC) was cloned from the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis by expressed sequence tags (ESTs) and PCR techniques. The 1036 bp ESPLC cDNA contained an 831 bp open reading frame (ORF) encoding a putative pacifastin-related peptide of 276 amino acids, a 5'-untranslated region (UTR) of 67 bp, and a 3'-UTR of 138 bp. Six putative conserved domains sharing a characteristic cysteine array (Cys-Xaa(9-12)-Cys-Asn-Xaa-Cys-Xaa-Cys-Xaa(2-3)-Gly-Xaa(3-4)-Cys-Thr-Xaa(3)-Cys) were identified in the deduced amino acid sequence of ESPLC. The conservation of these PLDs (pacifastin light chain domains) and the relative higher similarity of ESPLC to other pacifastin-related precursors suggested that ESPLC was a member of pacifastin family. The mRNA transcripts of ESPLC were found to be higher expressed in hepatopancreas, gill and haemolymph than in gonad, muscle and heart, with the highest expression level in hepatopancreas. The ESPLC mRNA expression in haemolymph of Chinese mitten crab was up-regulated at 2 h and 12 h after challenged with Listonella anguillarum. The tissue distribution and temporal characteristics of ESPLC mRNA expression, similar to that of prophenoloxidase gene in E. sinensis, suggested that ESPLC was potentially involved in the response against invading bacteria, with the possibility that it functioned in the prophenoloxidase system in E sinensis. (C) 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）cDNA文库的构建、EST分析及其酚氧化酶系统关键基因的研究

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）是我国的特色物种，具有重要的经济和科研价值。酚氧化酶系统作为节肢动物特有的免疫机制，在中华绒螯蟹的免疫反应中发挥重要作用。本研究构建了一个中华绒螯蟹的cDNA文库，利用表达序列标签 (Expressed Sequence Tag，EST) 技术，对中华绒螯蟹表达序列进行了大规模测序分析，并利用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）、实时定量PCR、原核重组和RNAi等技术研究了其酚氧化酶免疫系统的分子基础及其相应功能。 用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌同时感染中华绒螯蟹，提取血细胞的RNA构建了一个库容为3.3×106 克隆cDNA文库。随机测序后获得7535条高质量的EST序列，其中在GenBank数据库中未发现同源序列的为4593 条，而具有较高同源性2942条可以分为20个功能类别，参与了23个生物学反应。 进一步分析发现，969 条（32.9% ）EST与免疫相关，可拼接成221个免疫基因。这个比例高于其它任何一个已公布的甲壳动物cDNA文库。在免疫相关EST中，抗菌肽比例最高，约占总数的20.1%（195条EST）。免疫基因的高比例和抗菌肽的高表达，证明细菌刺激是提高cDNA 文库中免疫基因丰度的有效方法。 EST序列的获得和免疫基因的富集，丰富了中华绒螯蟹的基因组信息，初步了解了中华绒螯蟹固有免疫系统的概况, 为进一步克隆和研究中华绒螯蟹免疫防御功能基因提供了序列基础。 本研究在EST分析的基础上，克隆获得了中华绒螯蟹酚氧化酶系统10个基因的cDNA全长序列, 它们分别是前酚氧化酶（EsproPO），丝氨酸蛋白酶同源物（EsSPH), 丝氨酸蛋白酶抑制剂pacifastin, serpin, PAPII (EsPLC, Es serpin, EsPAPII), 模式识别丝氨酸蛋白酶（EsPRSP），peroxinectin (Esperoxinectin)和3个前酚氧化酶激活酶 (EsPAP1, 2, 3)。它们与相近物种的酚氧化酶系统相应基因均具有较高同源性，并含有胰酶催化结构域，CLIP结构域，PLD结构域，KAZAL结构域，Serpin结构域以及酚氧化酶结构域等酚氧化酶系统相应基因典型的特征结构域。分析发现，PAPs的CLIP结构域和PRSP，Pacifastin，Proxinectin，proPO基因是节肢动物特有的，是酚氧化酶系统作为节肢动物特有免疫机制的分子基础。本研究从多个基因的3′UTR区发现了调控元件，如15-LOX-DICE，K-box和 Brd-Box。在所推断的蛋白中，EsPAP3和EsPAPII的等电点呈碱性，Esperoxinetin的为中性，而EsPRSP，EsSPH，EsproPO, EsPAPII, Esserpin，EsPAP1的等电点在酸性区间。健康中华绒螯蟹 EsPAP1，EsPAP2，EsPAPII基因在肌肉中的表达量最高，而在血细胞中的表达量相对较低；EsPAP3，EsproPO，EsPLC基因在血细胞中表达量较高，在肌肉中的表达量最低。其中，EsPAP3在血细胞中的表达量是其在肌肉组织中表达量的526.35倍。调控元件和多种激活酶与抑制剂的存在、组织分布和等电点的差异，说明中华绒螯蟹酚氧化酶系统在转录、翻译、激活等多个层次上受到了调控。在中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激后，EsPAP1，EsPAP2，EsPAP3，EsPLC和EsPAPII基因的表达量呈上升或下降的趋势，但表达量的极限值均出现在2小时和12小时，这一规律与EsproPO应激后的mRNA表达和酶比活力的变化特点相吻合，说明中华绒螯蟹酚氧化酶系统各因子相互协调共同参与中华绒螯蟹对入侵细菌的防御反应。同时EsPAP2，EsPAP3，EsproPO，EsPAPII，EsPLC在中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激后的表达呈现反复多次上升，表明酚氧化酶系统可能参与了多种免疫反应。研究还发现EsPAP1参与中华绒螯蟹血液凝集过程，而EsPAP3是蟹血细胞中的有效的前酚氧化酶激活因子。研究结果初步揭示了中华绒螯蟹酚氧化酶系统的分子基础、对微生物的响应机制及其调控机制和演化趋势，为节肢动物固有免疫系统研究奠定了良好基础。