反刍动物的比较分子细胞遗传学研究

1. 反刍动物核型演化研究 反刍亚目是偶蹄目中最大的亚目，包括鼷鹿下目(鼷鹿科)和有角下目(叉角 羚羊科、长颈鹿科、麝科、牛科和鹿科)。许多物种具有巨大的经济价值（如： 牛，羊，鹿和麝，等）和重要的科学研究价值（如麂类动物）。对反刍动物进行 细胞遗传学研究，不仅可以为动物遗传育种和驯化提供重要的理论依据和合理 建议，也可以为生物演化等基础科学研究提供新的见解和理论阐释。种间染色 体涂色可以快速、准确地检测物种间全基因组水平上的同源性，已经成为比较 细胞遗传学研究的首选技术。通过构建物种间的染色体同源图谱，分析保守的 同源染色体片段在不同物种、不同类群核型中的分布和排列方式，可以推导各 类群可能的祖先核型并重建伴随物种形成所发生的基因组结构变化(包括染色 体重排的类型、速率和核型演化的趋势等)，为系统发育关系研究提供重要的细 胞遗传学证据。 本研究首次通过种间染色体涂色技术，利用小麂染色体特异探针，大规模 建立了小麂与牛科、鹿科及长颈鹿科代表物种间的染色体同源关系，阐明了其 核型演化中所发生的染色体重排，并以染色体重排为特征，构建了反刍动物各 类群的核型系统发生树。结果表明：1) 有角下目动物的共同祖先核型为2n=58， 牛科2n=60 的祖先核型和鹿科2n=70 的祖先核型都由共同祖先核型经过染色体 分离演化而来；2）与鹿科动物的核型相比，麝科动物与牛科动物的核型比较保 守，更接近共同祖先的核型，二者共有更多的核型特征；3）在有角下目的绝大 多数类群中，罗伯逊易位是导致核型多样化的主导染色体重排方式；鹿科的麂 亚科是个例外，染色体间不断地串联融合使其核型发生了迅速而极端的变化, 导致现生各种极大的核型差异；4）长颈鹿的核型演化较为复杂，除了广泛的罗 伯逊易位外，还涉及到其它类型的染色体重排，如，着丝粒位置变化、串联融 合及染色体内部倒位。现在，黄牛的基因组序列已拼接完毕，鹿、羊的基因组 测序正在进行，本论文中构建的反刍动物间的染色体同源图谱有助于将已有的基因组序列信息向其它反刍动物转移。 2. 麂属动物染色体演化研究 鹿科的麂属动物以快速的物种辐射、迅速而极端的核型演化和不断的新种 发现成为染色体重排与物种形成研究的理想模型。已有的细胞遗传学研究证明 麂属动物的祖先核型为2n=70，染色体间的串联融合是导致其核型迅速演化， 染色体数目急剧降低的主要原因。但是，关于麂属动物核型演化，还有很多问 题没有解决，如，黑麂、贡山麂、费氏麂核型演化中串联融合的类型没有确定， 导致串联融合的分子机制依然不清楚。 本研究利用比较BAC 定位技术首次构建小麂－黑麂、小麂－贡山麂、小麂 －费氏麂、小麂－毛冠鹿染色体间的比较BAC 图谱，研究结果丰富和发展了“串 联融合假说”的内容，对麂属动物的核型演化提出了新的阐释：1）在毛冠鹿、 黑麂、贡山麂和费氏麂的核型演化中所发生的串联融合均为着丝粒－端粒型融 合；2）黑麂1p+4 染色体的演化大体经历了三个步骤，主要涉及染色体易位和 臂间倒位；1p+4 的存在使雄性黑麂具有独特的X1X2Y1Y2Y3 性染色体系统， 1p+4 可以看作新的Y染色体(neo-Y),将是哺乳动物性染色体起源研究的理想模 型； 3）黑麂、贡山麂和费氏麂各自有独特而稳定的基因组结构和核型特征， 支持它们各自为独立的种。此外，实验中筛选出的70 个麂类着丝粒特异的或 C5 样的重复序列克隆将有助于研究麂类基因组中重复序列的类型、组成、结构、 演化及导致串联融合频繁发生的分子机制.

Chromosomal localization and molecular marker development of the lipopolysaccharide and beta-1,3-glucan binding protein gene in the Zhikong scallop Chlamys farreri (Jones et Preston) (Pectinoida, Pectinidae)

Zhikong scallop Chlamys farreri(Jones et Preston) is an economically important species in China. Understanding its immune system would be of great help in controlling diseases. In the present study, an important immunity-related gene, the Lipopolysaccharide and Beta-1,3-glucan Binding Protein (LGBP) gene, was located on C. farreri chromosomes by mapping several lgbp-containing BAC clones through fluorescence in situ hybridization (FISH). Through the localization of various BAC clones, it was shown that only one locus of this gene existed in the genome of C. farreri, and that this was located on the long arm of a pair of homologous chromosomes. Molecular markers, consisting of eight single nucleotide polymorphism (SNPs) markers and one insertion-deletion (indel), were developed from the LGBP gene. Indel marker testing in an F1 family revealed slightly distorted segregation (p = 0.0472). These markers can be used to map the LGBP gene to the linkage map and assign the linkage group to the corresponding chromosome. Segregation distortion of the indel marker indicated genes with deleterious alleles might exist in the surrounding region of the LGBP gene.

Construction and characterization of a bacterial artificial chromosome library of marine macroalga Porphyra yezoensis (Rhodophyta)

A large-DNA-fragment library is necessary for research into the Porphyra genome. In this study, a bacterial artificial chromosome (BAC) library of Porphyra yezoensis was constructed and characterized. The library contains 54,144 BAC clones with an average insert size of about 65 kb and fewer than 0.7% of clones without large inserts. Therefore, its capacity is more than 6.6 P. yezoensis genome equivalents, and the probability of recovering any nuclear DNA sequence from the library is higher than 99%. The library shows good fidelity and stability. A putative trehalose-6-phosphate synthase (TPS) gene was successfully screened out from the library. The above results show that the library is useful for gene cloning and genomic research in P. yezoensis.

Construction of bacterial artificial chromosome libraries for Zhikong Scallop Chlamys farreri

Two Large-insert genomic bacterial artificial chromosome (BAC) libraries of Zhikong scallop Chlamys farreri were constructed to promote our genetic and genomic research. High-quality megabase-sized DNA was isolated from the adductor muscle of the scallop and partially digested by BamH I and Mbo I, respectively. The BamH I library consisted of 53 760 clones while the Mbo I library consisted of 7 680clones. Approximately 96 % of the clones in BamH I library contained nuclear DNA inserts in average size of 100 kb, providing a coverage of 5.3 haploid genome equivalents. Similarly, the Mbo I library with an average insert of 145 kb and no insert-empty clones, thus providing a genome coverage of 1.1 haploid genome equivalents.

利用荧光原位杂交技术（FISH）对中国明对虾和栉孔扇贝若干重要基因定位的研究

本研究将荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH）技术引入中国明对虾和栉孔扇贝这两种重要的海水养殖动物的染色体研究中，建立了相关技术平台，在染色体上定位了部分功能基因，详述如下： 1. 在中国明对虾和栉孔扇贝中建立了FISH平台，利用单色和双色FISH技术在中国明对虾和栉孔扇贝染色体上成功定位了多拷贝基因，发现5S rDNA定位于中国明对虾的一对同源染色体上，栉孔扇贝18S rDNA和组蛋白序列也各自定位于一对同源染色体上，它们均可以作为染色体特异性探针来鉴别染色体。 2. 在栉孔扇贝中发展了BAC-FISH技术，定位了包含热休克蛋白70（HSP70）、丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）和脂多糖葡聚糖结合蛋白（LGBP）等免疫相关基因的BAC克隆，发现它们均定位于一对同源染色体的长臂上。利用双色BAC-FISH技术，发现6个包含栉孔扇贝LGBP基因的BAC克隆在间期细胞核上共定位。对栉孔扇贝5个探针进行了同时定位，初步鉴别了栉孔扇贝5条染色体。 3. 在栉孔扇贝热休克蛋白70（HSP70）、丝氨酸蛋白酶（Serine Protease）和脂多糖葡聚糖结合蛋白（LGBP）等免疫相关基因内部发掘了数个潜在的SNP位点，展示了栉孔扇贝SNP位点的丰富性。这些SNP位点可以用于图谱整合。