The cDNA cloning and mRNA expression of heat shock protein 70 gene in the haemocytes of bay scallop (Argopecten irradians, Lamarck 1819) responding to bacteria challenge and naphthalin stress

Heat shock protein 70 (HSP70) is an important member of the heat shock protein superfamily, and it plays a key role in the process of protecting cells, facilitating the folding of nascent peptides and responding to stress. The cDNA of bay scallop Argopecten irradians HSP70 (designated AIHSP70) was cloned by the techniques of homological cloning and rapid amplification of cDNA end (RACE). The full length of AIHSP70 cDNA was 2651 bp in length, having a 5' untranslated region (UTR) of 96 bp, a 3' UTR of 575 bp, and an open reading frame (ORF) of 1980 bp encoding a polypeptide of 659 amino acids with an estimated molecular mass of 71.80 kDa and an estimated isoelectric point of 5.26. BLAST analysis revealed that the AIHSP70 gene shared high identity with other known HSP70 genes. Three classical HSP signature motifs were detected in AIHSP70 by InterPro, analysis. 3-D structural prediction of AIHSP70 showed that its N terminal ATPase activity domain and,C terminal substrate-binding domain shared high similarity with that in human heat shock protein 70. The results indicated that the AIHSP70 was a member of the heat shock protein 70 family. A semi-quantitive RT-PCR method was used to analyse the expression of AIHSP70 gene after the treatment of naphthalin which is one kind of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) and the challenge of bacteria. mRNA expression of AIHSP70 in scallop was up-regulated significantly after the stimulation of naphthalin and increased with increasing naphthalin concentration. A clearly time-dependent expression pattern of AIHSP70 was observed after the scallops were infected by Vibrio anguillarum, and the mRNA expression reached a maximum level at 8 h and lasted to 16 h, and then dropped progressively. The results indicated that AIHSP70 could play an important role in mediating the environmental stress and immune response in scallop. (c) 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.

皱纹盘鲍热休克蛋白70基因的克隆、表达及应用

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中最重要的一类家族成员，它具有“分子伴侣”、细胞保护、抗凋亡以及肿瘤免疫治疗等独特复杂的生物学功能，它的研究已成为生命科学领域研究的热点之一。采用RACE方法从皱纹盘鲍中克隆到一种HSP70基因的全长cDNA序列，该序列与其它物种的HSP70基因高度同源。克隆得到的皱纹盘鲍HSP70基因的全长cDNA序列为2631bp，开放阅读框为1968bp，另外其5'-和3'-非翻译区长度分别是90和573bp，其中3'-非翻译区具有AATAAA mRNA加尾信号及PolyA寡聚腺苷酸。开放阅读框编码655个氨基酸，包含N端包含的382个氨基酸的ATP酶结合域（约45kDa）、由161个氨基酸编码的底物肽结合结构域（18kDa）及112个氨基酸编码的C端结构域（10kDa）。构建了含有皱纹盘鲍HSP70的表达载体，以期得到体外表达的重组热激蛋白70，为制备抗体，通过Western blot杂交或酶联免疫等方法检测HSPs蛋白表达情况作准备。 为了研究皱纹盘鲍HSP70的转录表达，采用半定量RT-PCR方法，对HSP70不同组织及热休克、鳗弧菌感染下的转录表达情况分析。试验结果表明，采用热应激及鳗弧菌处理皱纹盘鲍，均能导致皱纹盘鲍肌肉中HSP70 mRNA转录水平明显增加，并在处理后96 h恢复至正常水平；与肌肉组织不同的是，鳃组织在温度及鳗弧菌处理后12 h后达到最高值，并一直维持相对较高的表达水平。在温度和鳗弧菌处理下，皱纹盘鲍HSP70上调表达表明HSP70的响应没有胁迫特异性，可能参与了皱纹盘鲍的免疫反应。 以皱纹盘鲍近交和杂交群体为材料，研究了不同群体的生长速率和HSP70的表达量的差异。试验结果表明，在较低的处理温度下，皱纹盘鲍近交群体HSP70的表达量高于杂交群体，随着处理温度的升高，在接近致死温度时，杂交群体的HSP70表达量要高于近交群体；不同群体达到最大HSP70表达量时的温度（Tpeak）也不同，近交群体的Tpeak为26C，低于杂交群体（28C）；近交群体的最大HSP70表达量高于杂交群体。以上试验结果表明杂交群体的HSP70的表达变化幅度较近交群体的变化幅度小，具有更宽的温度适应性。可能提供了关于杂交能够缓解皱纹盘鲍内在遗传压力的证据。 用荧光定量PCR方法分析不同壳色皱纹盘鲍在热激胁迫下不同恢复时间和南方与北方越冬的皱纹盘鲍在不同程度温度胁迫下的HSP70变化。在南方与北方越冬的皱纹盘鲍由于其越冬环境的温度明显不同，表现出明显的热响应差异。具体表现如下几个方面：首先，两个群体在非胁迫的正常条件下，其HSP70的初始表达量明显不同。南方越冬群体在其正常生长温度下（16C）的表达量高于北方群体的相应的表达量（12C）；其次，随着热激温度的增高，两个群体HSP70的表达量升高的幅度也不同。第三，两个群体HSP70表达量达到最高值后，随着温度的升高，表达量开始下降，但两个群体的表达量下降幅度也有所不同。结果表明在南方的适用后，体内可能聚集了较多的热休克蛋白，可能更有利于渡过北方的高温季节。

栉孔扇贝抗氧化酶基因的克隆与表达分析

扇贝是我国海水养殖的重要品种，但自1994年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且直接威胁到现有产业的生存和发展。扇贝病害的不断爆发以及病因的多样性迫切要求制定新的疾病防治措施和开发新型的抗菌物质。因此，深入研究扇贝免疫防御机制，探讨提高机体抗病力的有效途径和方法，改良种质和培育抗病品系，无疑是解决目前困扰扇贝养殖业健康可持续发展的必经之路。 抗氧化酶可以清除活性氧，是维持机体内氧环境平衡，抵抗外界环境影响的重要免疫因子。本研究采用大规模 EST 测序方法和同源克隆的方法，结合 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术，从栉孔扇贝中克隆到了超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）等抗氧化酶基因的全长 cDNA序列，并对其基因结构进行了分析。同时，用实时定量PCR方法对这三个基因在健康扇贝血淋巴细胞、肾、鳃、肌肉、性腺等组织和在分别用鳗弧菌，溶壁微球菌和假丝酵母处理扇贝后不同时间段的表达差异情况进行了研究。 超氧化物歧化酶基因CfSOD的cDNA 全长为1022 bp，其中开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有 459 bp，编码 153个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfSOD中存在两个Cu/Zn-SOD的签名序列；另外Cu结合必须氨基酸(His-45，-47，-62 和-119)和Zn结合必须氨基酸(His-62，-70，-79和Asp-82)在CfSOD中保守。实时定量PCR 检测发现，CfSOD在鳃、血细胞和肾中有较高的表达。在鳗弧菌和溶壁微球菌刺激后，CfSOD的相对表达量逐渐下降，然后分别在32小时和16小时的时候恢复到刺激前的表达水平。在假丝酵母刺激后，CfSOD的mRNA表达没有显著差异。 栉孔扇贝过氧化氢酶基因CfCAT的cDNA全长为3146 bp，其中开放阅读框含有1521bp，编码507个氨基酸残基，无信号肽，为胞内蛋白。经BLASTP分析发现，CfCAT与其它动物具有较高的同源性。 CfCAT中存在过氧化氢酶近端活性位点和过氧化氢酶近端血红素配体签名序列，另外存在两个糖基化位点 NFS和 NFT，同时在CfCAT 的C末端存在过氧化物酶体定位信号AQL，为典型过氧化氢酶。实时定量PCR 检测发现，健康的扇贝中CfCAT在鳃和性腺中有较高的表达。CfCAT基因在鳗弧菌刺后表达升高，在4小时达到最高，约是刺激前表达量的6.8倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在8小时表达量达到为刺激前表达量的1.3倍（P<0.05），在16和32小时略高于刺激前的水平。在溶壁微球菌刺激后CfCAT基因表达量也呈上升趋势，在刺激后4小时达到刺激前表达量的约2倍，然后有所下降，在16 小时又上升到刺激前表达量的2.9倍。CfCAT基因在假丝酵母刺激后的表达略有升高，4小时约是刺激前的1.2倍（P<0.05），在其他时间段变化不明显。 栉孔扇贝谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX的cDNA 全长为1290 bp，其中开放阅读框含有705bp，编码235个氨基酸残基，有一个24核苷酸的信号肽序列。经BLASTP 分析发现，CfSOD与其它动物具有较高的同源性。CfGPX中发现谷胱甘肽过氧化物酶活性位点的签名序列， 另外发现硒半胱氨酸和硒半胱氨酸插入序列，为含硒型谷胱甘肽过氧化物酶。实时定量PCR 检测发现，未经处理的扇贝中CfGPX在性腺、肌肉、血和肾中有较高的表达。CfGPX基因在鳗弧菌刺后表达量快速上升，在6 小时的时候表达量达到最高，为刺激前的4.0倍（P>0.05），后随着时间的变化而逐渐下降。在溶壁微球菌刺激后CfGPX在前6小时表达略有降低，在6小时的时候表达量为刺激前的0.5倍（P<0.05），后随着时间的变化而逐渐升高。在16小时的时候表达量为刺激前的2.1倍（P<0.05）。在假丝酵母刺激后， CfGPX的表达量略有下降在8小时的时候表达量为刺激前的0.8倍（P<0.05）。 实验证明栉孔扇贝的超氧化物歧化酶基因CfSOD，过氧化氢酶基因CfCAT，谷胱甘肽过氧化物酶基因CfGPX基因在机体抵抗外界微生物刺激中起到了重要的作用。

四种海藻热休克蛋白70（HSP70）基因的克隆与表达分析

热休克蛋白70是热休克蛋白家族中重要的成员，参与新生蛋白的折叠、转运、重折叠变性蛋白、协助降解变性蛋白和抗逆环境胁迫等功能。海带和裙带菜是浅海潮下带典型的褐藻，孔石莼和浒苔是潮间带典型的绿藻，四种大型海藻均有重要的经济价值和生态价值。随着潮汐变化固着藻类生境理化因素变化剧烈，藻类面临着严重的环境胁迫，因此研究藻类抗逆机理有着重要的意义。 本研究采用同源克隆法配合RACE-PCR，克隆了海带、孔石莼、裙带菜和浒苔HSP70基因的全序列（分别命名为LJHSP70、UPHSP70、QDHSP70和EPHSP70）。利用生物信息学方法分析了四种藻类HSP70结构特征、同源性关系和进化地位。获得的海带HSP70基因全序列长为2918 bp，5’非翻译区为248 bp，3’非翻译区为696 bp，开放阅读框为1974 bp，编码657个氨基酸，预测的分子量为72.03 kDa，等电点为4.97。获得的裙带菜HSP70基因全序列长为3243 bp，5’非翻译区为248 bp，3’非翻译区为1021 bp，开放阅读框为1974 bp，编码657个氨基酸，预测的分子量为72.03 kDa，等电点为4.96。获得的孔石莼HSP70基因全序列长为2283 bp，5’非翻译区为65 bp，3’非翻译区为247 bp，开放阅读框为1971 bp，编码656个氨基酸，预测的分子量为71.13 kDa，等电点为5.04。获得的浒苔HSP70基因全序列长为2265 bp，5’非翻译区为65 bp，3’非翻译区为217 bp，开放阅读框为1983 bp，编码660个氨基酸，预测的分子量为71.39 kDa，等电点为5.03。四种海藻HSP70氨基酸序列均含有四肽重复序列GGMP，具有三个典型的HSP70签名基序。细胞质定位的HSP70 C-末端特征基序为EEID或EEVD，并且N-端氨基酸序列保守性高于C-端。海带和裙带菜HSP70蛋白同源性为98%，孔石莼和浒苔HSP70蛋白同源性为96%，四种海藻HSP70蛋白序列与陆地植物和其他藻类HSP70蛋白序列同源性为70-80%。 利用荧光定量RT-PCR技术对不同胁迫条件处理的海带和孔石莼HSP70 mRNA的表达水平进行定量分析。不同热激温度（5-40 ℃）处理组中，30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量最高是10 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量的3倍，而35 ℃或40 ℃处理组的海带HSP70表达量却低于25 ℃或30 ℃处理组的海带HSP70 mRNA表达量。25 ℃不同热激时间（0-12 h）处理组中，海带HSP70 mRNA表达量呈先上升后下降趋势。热激1 h后海带HSP70 mRNA表达量迅速上升，热激7 h后mRNA表达量达到最大，是对照组表达量的4倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中，0‰或5‰盐度处理组的海带HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组海带HSP70 mRNA表达量的3倍。35‰、40‰和45‰盐度处理组之间HSP70 mRNA表达量较低且无显著差异。 不同热激温度（5-40℃）处理组中，20 ℃或25 ℃处理的孔石莼HSP70 mRNA表达量较低，而5 ℃、35 ℃、或40 ℃处理组的孔石莼HSP70 mRNA的表达量是25 ℃处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量的2倍以上。30 ℃不同热激时间（0-12 h）处理组中，孔石莼HSP70 mRNA表达量也呈先上升后下降趋势。热激5 h后孔石莼HSP70 mRNA表达量达到最大，是对照组的3.5倍。不同盐度（0‰-45‰）胁迫处理组中，0‰或5‰盐度处理组的孔石莼HSP70 mRNA表达量是30‰盐度处理组孔石莼HSP70表达量的3倍。30‰、40‰和45‰盐度处理组孔石莼HSP70 mRNA表达量较低，且无显著差异。不同紫外线照射时间（0-4.0 h）和不同干燥时间（0-4.0 h）处理组中，孔石莼HSP70 mRNA表达量都在3 h后达到最高值，之后表达量维持在较高水平。 为进一步研究藻类HSP70的生物学功能，将海带HSP70基因的开放阅读框区域克隆到表达载体pEASY-E2中，并转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。将阳性重组子培养于含有AMP（100 U/mL）的LB培养基，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳鉴定。经5 h诱导，其表达量达到平台期，继续培养HSP70表达量并不显著增高。5 mM IPTG诱导海带HSP70蛋白表达量高于1 mM IPTG诱导蛋白表达量。