蓝藻应答高 pH 胁迫的亚细胞蛋白质组学研究

蓝藻是迄今地球上发现的最古老、分布最广和最具多样性的光合自养原核生物，其细胞结构简单，具有类似于植物的光合作用，是研究光合作用及其它代谢过程重要的模式生物。由于这类生物起源于远古前寒武纪，但至今依然繁多，在极端寒冷的南北极冰湖和近于沸腾温度的温泉，以及高盐、强碱的极端环境中均有存在,它们在漫长的进化过程中如何应对灾难性环境、针对随时可能遭遇的不同胁迫环境因子形成了怎样的分子适应机制，是近年来倍受关注但仍未诠释的问题之一。由于蓝藻与高等植物叶绿体在进化上密切相关，搞清楚这类生物适应不同胁迫环境因子的分子基础及其作用机制，对从进化的角度理解光合生物与环境相互作用、通过同源性发现作物抗逆育种新靶标，有重要的理论和实践意义。 逆境应答蛋白的表达是细胞对逆境胁迫的主要适应机制之一。在特定的逆境条件下，细胞通常会表达一组蛋白质，用于识别与传递环境胁迫信号、稳定细胞内环境、消除并修复逆境造成的损伤等。因此，逆境应答蛋白的系统鉴定和功能确认，是揭示逆境条件下细胞代谢网络及抗逆性分子机制的关键。单细胞模式蓝藻基因组序列的确定，极大地推动了蓝藻细胞蛋白质组成模式研究，也为系统发掘蓝藻逆境应答蛋白、理解和揭示分子适应机制提供了新的切入点。Synechocystis 6803是第一个完成基因组测序的放氧光合模式生物。由于其具有易培养、可转化、对环境条件变化反应快等优点，以该藻种为材料所展开的逆境应答特别是盐胁迫蛋白质组研究方面已经取得了重要的进展，而对高pH胁迫的蛋白质组研究还鲜有报道。因此，本论文以Synechocystis 6803为材料，从分离纯化的亚细胞组分入手，采用蛋白质组学研究手段，对蓝藻细胞应答高pH胁迫的蛋白质代谢网络进行探讨。利用蔗糖密度离心和水溶性两相分离法相结合的方法，分别获得了对照（pH7.5）和处理（pH11）细胞的质膜、外膜和类囊体膜，并分别构建了包括可溶性蛋白和膜组分的一维和二维蛋白质凝胶电泳图谱。分析结果表明，高pH胁迫下质膜和可溶性蛋白蛋白组分的变化较外膜和类囊体膜蛋白组分更为明显。在考马斯亮兰染色胶上共发现有近110个蛋白点上调或下调表达，其中有82个蛋白点来源于质膜。对质膜蛋白进行的差异荧光标记双向电泳（2-D DIGE）分析结果与考马斯亮兰染色结果基本一致。对质膜上的82个蛋白点进行胶内消化和MALDI-TOF和MALDI-TOF/TOF质谱鉴定，得到了39个不同基因产物，其中25个是上调蛋白，14个是下调蛋白。在这些发生变化的蛋白中，近1/3是ABC型转运蛋白，如3个磷转运蛋白（Sll0679，Sll0683，Sll0684）均在高pH胁迫下明显上调。其它高pH响应蛋白包括参与光合作用（PsaF，Sll0819；CpcA，Sll1578）、呼吸作用（CoxB，Sll0813）以及细胞分裂过程的蛋白（MinD，Sll0289）。还有LexA repressor (Sll1626)和Guanylyl cyclase(Cya2，Sll0646)等起调控作用的蛋白质。此外发现8个高pH胁迫响应蛋白为功能未知的新蛋白。生物信息学预测结果显示，在已鉴定的质膜响应蛋白中有17个蛋白具有信号肽。6个蛋白为具有跨膜域的膜蛋白，其中的3个膜蛋白是首次被证明定位于质膜上，且其表达与高pH胁迫有关。这些研究结果对从分子水平理解蓝藻细胞主动应对高pH胁迫、维护细胞内pH相对稳定机制有重要启示。

不同营养源对人工湿地基质生物膜培养液pH值的影响

采用恒温摇床培养方法,研究了不同营养源(处理1:尿素+乙酸钠;处理2:亚硝酸钠+乙酸钠;处理3:硝酸钾+乙酸钠;处理4:碳酸氢铵;处理5:硫酸铵+碳酸氢钠;处理6:磷酸二氢钾+碳酸氢钠)对复合垂直流人工湿地基质生物膜培养液pH值的影响,探讨了pH值变化过程中生物膜脱氢酶活性和多糖含量的变化规律。结果表明,处理1、4以及5中培养液pH值先下降然后再上升,但下降和上升的幅度不同。处理2、3以及6中培养液pH值添加碳源前在7.30~7.40之间缓慢变化,添加碳源后均上升至9.00左右。在培养液pH值变化的过程中

温度和pH值对嗜水气单胞菌毒力基因表达的影响

为了解培养温度和pH值对嗜水气单胞菌的毒力基因表达以及致病性的影响,利用反转录PCR(RT-PCR)对4种基因的表达进行了研究。研究结果显示嗜水气单胞菌毒力基因的表达受温度和pH值影响,其中溶血素(AHH)、气溶素(AerA)、外膜蛋白(OMP)和粘附素(Aha)毒力基因在15℃、25℃和37℃下均能高效表达,在4℃AHH和AerA两基因也能持续表达,但OMP和Aha两基因的表达停止。在中性或偏酸性的条件下(pH5.0和pH7.0)4种毒力基因都得以表达,在碱性条件下(pH9.0)4种基因中只有AHH得以

赤潮藻中肋骨条藻的光合作用对海水pH和N变化的响应

为探讨赤潮发生时中肋骨条藻 (Skeletonemacoatatum)的光合作用生理变化 ,研究了不同无机氮 (N)水平上 ,海水pH值升高对其胞外碳酸酐酶 (CA)和光合生理特性的影响。海水pH从 8.2升至 8.7时 ,中肋骨条藻胞外CA被诱导 ,细胞对无机碳的亲和力 (1/Km)提高 ;在pH8 7时 ,高N条件下的胞外CA活性是低N条件下的 3倍 ,1/Km 值也提高了 80 %。单位叶绿素a的最大净光合能力 (Pam)在不同pH和N水平上没有显著差异 ;但单位细胞的最大净光合能力 (Pcm)提高

pH对萼花臂尾轮虫种群动态和休眠卵的影响

应用种群累积培养法,研究了pH3.5～11.5(间隔1.0)之间萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)的种群动态及休眠卵的形成。结果表明,该轮虫在pH5.5～10.5为正增长,pH7.5时种群增长趋势最好;pH4.5时为负增长;pH3.5和11.5分别是该轮虫存活下限和上限。pH对轮虫休眠卵的产量和形成效率、平均混交雌体百分率和受精率皆具极显著影响。7.5是该种轮虫休眠卵规模化生产的最佳pH值,此时休眠卵的产量和藻类食物的形成效率最大,分别为(132567±20264)/(20ml·

低pH值对大型溞（Daphnia magna Straus）存活、生长和生殖的影响

在静置换水条件下，研究了低ｐＨ值对大型存活、生长和生殖的影响。结果表明，在２５±１℃下，急性试验低ｐＨ值对大型的２４ｈ和４８ｈＬＬ５０值及其９５％可信限分别为ｐＨ值４．６６±０．１９和４．９４±０．２０。慢性试验进行了１４天，对存活和生长，ｐＨ值１．７５有影响，ｐＨ值５．０没有影响；对生殖，ｐＨ值５．０有影响，ｐＨ值５．５没有影响。显示出低ｐＨ值对大型的毒性阈限在ｐＨ值５．００－５．５０之间。

低pH对鱼类胚胎发育、鱼苗生长及鳃组织损伤影响的研究

本文研究了低pH水平对鱼类的胚胎,鱼苗和鱼种的影响以及鱼鳃的组织学观察。在硬水环境,pH≤4.5时,对泥鳅胚胎发育有严重影响。胚胎在低pH水平下,发育进程明显地迟缓。pH≤5.5时,泥鳅幼苗的生长受到抑制;在软水环境,pH≤4.5时,影响草鱼苗和幼鱼的存活率。低pH水平加上铝则对鱼类呈现出协同毒性。低pH使鱼鳃直接遭受严重的损害:出现大量的粘液、渗血、鳃上皮肿胀和脱落,组织增生和融合。

低pH和铝对几种淡水鱼类早期生活阶段的影响

在实验室条件下,把早期生活阶段的白链(Hyhophthalmichthys molitrix)、鳙鱼(Arist-ichthys nobilis)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)突然置于一系列低pH值水中,以测试产生毒性影响的pH水平.在受试的三种鱼中,未发现对低pH的敏感性有显著差异,但在发育过程中其敏感性逐渐降低.在pH5.0的水中,Al(0.1—16mg/L)对草鱼仔鱼毒性测试结果表明,96h的LC_(50)为0.26mg/L(0.21—0.31mg/L),致死阈浓度为0.

低pH对草鱼呼吸活动和耗氧代谢的影响

研究了低pH(6.0—3.6)对草鱼呼吸活动机能及耗氧代谢的影响.结果表明,在pH4.6—3.6条件下,草鱼呼吸和气体代谢活动受干扰的程度随酸度增大而急剧加重.其具体表现为:呼吸率加快,咳嗽反应增加,呼吸深度加大.耗氧率起始升高继而迅速下降,并在极端pH(3.6)下最终引起机体组织缺氧而致死.对于pH5.6,草鱼各类呼吸与代谢指标未受明显影响,基本属于正常.供试草鱼对低pH反应的灵敏程度依次为:咳嗽率>呼吸率>耗氧率>呼吸深度.

低pH对草鱼血液酸碱平衡的影响

研究了低pH(6.0—4.0)对草鱼血液酸碱平衡、p_(o2)及p_(co2)的影响,结果表明,低pH引起草鱼严重的酸血症.亚致死pH(6.0—5.0)时,血液酸碱平衡的影响主要表现为碱贮备[HCO_3]的丧失,血液pH的明显下降经机体缓冲调节可趋于稳定.致死低pH(4.0)时,血液pN和[HCO_3]下降均非常显著,并在96h内随酸化时间延长而日趋严重.仅在pH≤4.0的酸水中草鱼存在低氧症影响问题.草鱼是一种酸敏感性鱼类,为确保成鱼在天然水体的生存和繁育,水质pH至少应维持在6.0以上.