Biosynthesis of gold nanoparticles assisted by Escherichia coli DH5 alpha and its application on direct electrochemistry of hemoglobin

In this communication, biosynthesis of gold nanoparticles assisted by Escherichia coli DH5 alpha and its application on direct electrochemistry of hemoglobin are reported. The gold nanoparticles formed on the bacteria surface are mostly spherical. The direct electrochemistry of hemoglobin can be achieved by incorporated into the bio-nanocomposite films on a glassy carbon electrode.

Functional biosynthesis of an allophycocyan beta subunit in Escherichia coli

Allophycocyanin is a phycobiliprotein with various biological and pharmacological properties. An expression vector was constructed using CpeS as the bilin lyase for the allophycocyanin beta subunit, resulting in overexpression of a fluorescent allophycocyanin beta-subunit in Escherichia coli. A high-density cell culture was developed using a continuous feeding strategy. After 16 h of culture, the dry cell density reached 21.4 g 1(-1), the expression of the allophycocyanin beta-subunit was 0.86 g l(-1) broth, and the relative chromoprotein yield was 81.4%. The recombinant protein showed spectral features similar to native allophycocyanin, which provide an efficient methodology for large-scale production of this valuable fluorescent protein. (C) 2008, The Society for Biotechnology, Japan. All rights reserved.

Biosynthesis of fluorescent allophycocyanin alpha-subunits by autocatalysis in Escherichia coli

APC (allophycocyanin) is widely used for fluorescence tagging and may be a promising antioxidant agent for use within the food and pharmaceutical industries. Chromophore attachment to apo-ApcA (apo-APC alpha-subunit without chromophore) can be auto-catalysed both in vitro and in vivo. In the present study, a plasmid containing genes of apo-ApcA and chromophore synthetases (HOI (ferredoxin-dependent haem oxygenase) and PcyA (phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase)] was constructed and expressed in Escherichia coli. The results show that holo-ApcA (APC alpha-subunit with chromophore) can be synthesized by autocatalysis in E. coli. Recombinant holo-ApcA showed the same spectral and fluorescent properties as PC (phycocyanin) and could serve as a good substitute for native PC for fluorescent tagging. Moreover, recombinant ApcA can inhibit hydroxyl and peroxyl radicals more strongly than holo-ApcA and native APC. The EC50 values were 296.4 +/- 22.4 mu g/ml against hydroxyl radicals and 38.5 +/- 2.6 mu g/ml against peroxyl radicals.

Positional distribution of fatty acids on the glycerol backbone during the biosynthesis of glycerolipids in Ectocarpus fasciculatus

The biosynthesis of glycolipids in E. fasciculatus was studied by C-14 label and chase. The fatty acids in sulphoquinovosyl diacylglycerol (SQDG) were almost 16-carbon and 18-carbon ones. In addition to the two fatty acids, monogalactosyl diacylglycerol (MGDG) and digalactosyl diacylglycerol (DGDG) contained 8.5 mol% and 31.0 mol% of eicosapentaenoic acid (20 : 5), respectively, and this fatty acid was usually distributed in the sn-1 position of the glycerol backbone. When plants were incubated with [2-C-14] acetate, differences existed in the positional distribution of the labeled fatty acids in sn-1 and sn-2 among the three glycerolipids. In SQDG C-14-labeled fatty acids were distributed uniformly in the sn-1 and sn-2 positions. In DGDG, C-14-labeled fatty acids were mainly distributed in the sn-2 position. In MGDG, the radioactivity of fatty acids in sn-1 position was far greater than that in sn-2 position after a 30 min pulse label, and the difference in radioactivity between the two positions decreased rapidly. The above results indicated that differences in the positional distribution of C-14-labeled fatty acids between sn-1 and sn-2 positions might be related to 20 : 5 and the biosynthesis of DGDG. Our results also suggested that E. fasciculatus had the same DGDG biosynthetic pathway as that in higher plants and galactosyl transferase was selective for MGDC.

Fatty acid biosynthesis in eukaryotic photosynthetic microalgae: Identification of a microsomal delta 12 desaturase in Chlamydomonas reinhardtii

Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) are important components of infant and adult nutrition because they serve as structural elements of cell membranes. Fatty acid desaturases are responsible for the insertion of double bonds into pre-formed fatty acid chains in reactions that require oxygen and reducing equivalents. In this study, the genome-wide characterization of the fatty acid desaturases from seven eukaryotic photosynthetic microalgae was undertaken according to the conserved histidine-rich motifs and phylogenetic profiles. Analysis of these genomes provided insight into the origin and evolution of the pathway of fatty acid biosynthesis in eukaryotic plants. In addition, the candidate enzyme from Chlamydomonas reinhardtii with the highest similarity to the microsomal Delta 12 desaturase of Chlorella vulgaris was isolated, and its function was verified by heterologous expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae).

Combinational biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial holo-alpha-allophycocyanin in Escherichia coli

Allophycocyanin ( APC) is a phycobiliprotein with various biological and pharmacological properties. An expression vector containing five essential genes in charge of biosynthesis of cyanobacterial APC holo-alpha subunit ( holo- ApcA) was constructed, resulting in over- expression of a fluorescent holo- ApcA in E. coli. After being cultured for 16 h, the dry cell density reached 22.5 gl(-1), and the expression of holo- HT- ApcA was up to 1 gl(-1) broth. The recombinant protein showed similar spectral features to native APC.

Biosynthesis of fluorescent cyanobacterial allophycocyanin trimer in Escherichia coli

Allophycocyanin (APC), a cyanobacterial photosynthetic phycobiliprotein, functions in energy transfer as a light-harvesting protein. One of the prominent spectroscopic characteristics of APC is a strong red-shift in the absorption and emission maxima when monomers are assembled into a trimer. Previously, holo-APC alpha and beta subunits (holo-ApcA and ApcB) were successfully synthesized in Escherichia coli. In this study, both holo-subunits from Synechocystis sp. PCC 6803 were co-expressed in E. coli, and found to self-assemble into trimers. The recombinant APC trimer was purified by metal affinity and size-exclusion chromatography, and had a native structure identical to native APC, as determined by characteristic spectroscopic measurements, fluorescence quantum yield, tryptic digestion analysis, and molecular weight measurements. Combined with results from a study in which only the monomer was formed, our results indicate that bilin synthesis and the subsequent attachment to apo-subunits are important for the successful assembly of APC trimers. This is the first study to report on the assembly of recombinant ApcA and ApcB into a trimer with native structure. Our study provides a promising method for producing better fluorescent tags, as well as a method to facilitate the genetic analysis of APC trimer assembly and biological function.

胡萝卜素β-和ε-环化酶及辣椒红/辣椒玉红合酶基因的分离及特性研究

利用3’和5' RACE、Uneven PCR等技术成功地从胡萝卜肉质根中分离了茄红素β-环化酶、茄红素ε．环化酶和辣椒红／辣椒玉红素合酶cDNA以及茄红素β一环化酶基因5’端上游的部分序列，并研究了它们在胡萝卜肉质根中的表达模式，对胡萝卜中类胡萝卜素代谢和积累的分子机制进行了探讨。 胡萝卜茄红素β--环化酶cDNA（DCLYC1）长2089bp，包含一个1515bp的开放阅读框架，所编码蛋白长505个氨基酸，其一级结构与番茄、烟草和辣椒等植物的茄红素β--环化酶高度同源。与农杆菌和夏噬孢欧文氏菌等微生物的茄红素环化酶相似性较差，但相互间有3个短小的同源区，且蛋白疏水模式也十分相似。茄红素β--环化酶在胡萝卜肉质根中的表达受品种和组织特异性的调控。在紫色的富含茄红素的“齐头红”胡萝卜肉质根中该基因的表达受到了强烈的抑制，相反，在橙色的富含β--和α--胡萝卜素的“CA201”胡萝卜肉质根中表达十分活跃。茄红素β--环化酶和八氢番茄红素合酶基因的表达在肉质根的韧皮部和木质部之间存在差异，在韧皮部中的表达强于木质部。类胡萝卜素生物合成基因的差异表达是造成不同胡萝卜品种和组织中积累的类胡萝卜素的种类和含量不同的原因。 对紫色品种和橙色品种的茄红素β--环化酶基因组DNA的PCR分析表明两者的基因组中均存在茄红素β一环化酶基因。为了探明茄红素β--环化酶基因在不同胡萝卜品种中差异表达的原因，利用Uneven pCR从胡萝卜基因组DNA中分离克隆了茄红素β--环化酶基因5’端上游部分序列。该DNA片段长1.7kb，3’端286bp区域与DCLYC1的5’端序列交叉重叠，在GenBank中没有找到相似的序列。在1294bp-1336bp位置串连着3个TATA盒，结构十分特殊，在TATA盒上游大约700bβ位置有2个CAAT盒。瞬间表达实验证明它具有启动子活性，可以指导GUS基因在胡萝卜肉质根、叶片和茎等组织中表达。然而，其表达模式却与茄红素B．环化酶基因的Northern杂交结果不同，主要在韧皮部和木质部交界的分生组织中表达，同时在紫色胡萝卜肉质根中其表达并没有受到抑制。这一片段可能还不是完整的胡萝卜茄红素β--环化酶基因启动子，缺少了调控基因进行品种和组织特异性表达的部分序列元件。因此，分离更长的胡萝卜茄红素环化酶基因5’端上游序列，将有助于揭示茄红素β一环化酶基因呈品种和组织特异性表达的分子机制。 所分离的胡萝卜辣椒红／辣椒玉红素合酶cDNA (DCCCS)长1744bp，包含一个长1476bp的开放阅读框架，所编码蛋白长492个氨基酸。与辣椒和柑桔CCS的氨基酸序列同源性分别为为76.6%和75.3%，与DCLYC1等其它植物茄红素β--环化酶的氨基酸序列同源性为63.9-67.4%。DCCCS的表达模式在两个不同颜色的品种之间十分相似，在肉质根韧皮部中强烈表达，而在木质部中表达明显受到了抑制。由于CCS与LYC-B高度同源，有人认为CCS可能具有茄红素环化酶活性，然而本研究结果表明，DCCCS虽然在紫色的齐头红胡萝卜肉质根韧皮部中强烈表达，却没有影响细胞中积累大量的茄红素，因此DCCCS即使具有茄红素环化酶作用，其活性也是极低的。 分离到的胡萝卜茄红素ε--环化酶cDNA片段(DCL YC-E)长1264bp，包含了完整的3’端，5’端尚不完整。按照引物LYCP1上的阅读框架进行翻译得到长385个氨基酸的肽链与莴苣、番茄和拟南芥LYC-E肽链相应区域的氨基酸序列高度同源，达80.5%以上，其中与莴苣茄红素ε--环化酶最为接近。与拟南芥茄红素ε--环化酶第448位基团和莴苣茄红素ε--环化酶第457位基团对应的氨基酸基团为H。这一基团是一个分子开关，决定茄红素ε--环化酶是催化茄红素的一端还是两端形成ε--环，因此，胡萝卜茄红素ε--环化酶可能与莴苣茄红素ε--环化酶具有相同的功能，即可以催化对称的线性茄红素的两端均形成ε--环，生成双ε--环胡萝卜素。DCLYC-E在胡萝卜肉质根中表达模式与DCLYCI不同，在紫色品种齐头红肉质根韧皮部中表达十分强烈，没有受到抑制，而且明显强于木质部;在橙色品种CA201中DCLYCE的表达模式与DCLYCI相似，韧皮部中表达强，而木质部中相对弱得多。DCL YC-E的表达模式在所测试品种间没有差异。在富含茄红素的齐头红胡萝卜肉质根中DCL YC-E强烈表达，可见它并没有将茄红素大量转化为双ε--环胡萝卜素，因此该酶的功能和活性有待进一步研究。

青蒿的遗传转化及青蒿素生物合成的调控

利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)1601，1000，1500，15834，A4，均成功地转化了中药青蒿(Artemisia annua L.)并且建立了pRi1601，pRi15834，pRiA4诱导的发根培养。pRi1601，pRi15834的发根诱导率比其它质粒高。太老或太幼的叶片不利子发根的诱导;发根主要从叶脉的伤口处萌发;带顶芽或带侧芽的叶片容易诱导根，但不一定是发根。光照有利于发根的诱导和发根的生长。以每个发根的“绝对生长速率”(Gtowth Ratio，GR)和绝对“侧根”数量(Number of Side Roots，NSR），通过大量的发根系的筛选，建立了8个发根系，1601-L-1, 1601-L-2, 1601-L-3, 1601-L-4, 15834-L-1, 1601-P-I, 16 01-P-2，15834-L-2。Southern分子检测表明，160l-1-1，1801-L-2, 1601-L-3，1601-L-4，1601-P-1，1601-P-2均为转化子。8个建立的发根系之间无论生长或者QHS的合成存在明显的差异。比较光／暗(16/8hrs)，25℃条件下培养的16 01-L-1，1601-L-2，1601-L-3，1601-L-4，1601-P-l，和1601-P-2，其中16 01-L-3的生长最快，160l-L-1的生长最慢;但是，1601-L-1的QHS的含量最高（可达1. 048%），1601-1-3的QHS的含量最低。160Z-L-3，15834 -L-1和2583:1-L-2的生长速率相差不大。用盛有l000mLMS液体培养基的3000mL的锥形瓶扩大培养1601-L -3，15834-L-1和15834-L-2，转速为ll0rlpm，培养过程中发根容易形成发根球（Hairy Root Balis，HRB），HRB的形成严重影响发根的生长和QHs的合成，HpLC分析表明扩大培养发根中QHS的含量比较低。 改变MS基本培养基中的无机离子的浓度，研究不同无机离子对发根生长和QHS的合成的影响。 l、KN03为18.79×10-3M时有利于1601- L-1生长，为14. 84×10-3M时有利于QHS的合成。NH-4N0-3浓度在10.93-12. 49×10—3M范围内有利于1601-L-1生长，在0-20.62×10-3M范围内对QHS的合成影响不大，大于20. 62×lO-3M不利QHS的合成。培养基中NH-4+／N0-3-比值为0. 37-0. 4-0.52:1时有利于发根的生长，比值为0.52 - 0.58:1时有利于QHS的合成。 2、H-2P0-4-浓度为2.498×10-3M时有利于发根的生长在0-2. 498×l0-3M范围内，随着浓度的提高，促进发根的生长。培养基中的H2P4 -的浓度在0-1.249×lO-3M的范围内，随着浓度的提高，促进QHS的合成，为1.249×10-3M时QHS的含量最高。 3、培养基中最适16 01-L-1生长的Ca-2+浓度为0.198- 0.766×10-3M，大于或小于该浓度范围，显著地抑制发根的生长。但是，在0-3.695×10-3M范围内，随着培养基中Ca-2+浓度提高，促进QHS的合成，最适Ca-2+浓度为3.695×l0-3M。 4、培养基中不加Mg-2+时，完全抑制发根生长，在0. 142×10-3M-7.506×l0-3M浓度范围内，对发根生长影响没有明显的差别。但是，HPLC和UV分析发根中QHS含量，培养基中不加Mg-2+时，发根中QHS含量最高。 5、培养基中的Fe-2+浓度在0. 25 -1．0×10-3M范围内，同时有利于16 01- L-1的生长和QHS的形成。 6、培养基中最适合予16 01- L-3生长的KI浓度为2.5ppm，大于或小予该浓度均显著地抑制发根的生长，培养基中加入KI明显地降低发根中的QHS的含量。 7、H2BO3对l601-L-l生长影响不大，HPLC分析QHS的含量，培养基中的H3BO3浓度为100ppm和400ppm，QHS的含量分别为1.69mg/g和1.80mg/g(DW)。 8、Cu-2+对1601-L-3的生长影响显著，最适合1601-L-3生长的Cu-2+浓度为1.00ppm，在0 -1.00ppm的浓度范围内，随着培养基中的Cu+浓度的提高，发根的生物量不断增加。培养基中QHS合成的最适Cu2+浓度为0.05ppm，大于或小于该浓度均显著地抑制发根中QHS的合成。 比较光培养和暗培养对发根生长的影响，结果表明光照明显地促进1601-L-l的生长，暗培养明显不利于发根的生长。最适合于发根生长的温度为25℃，大于35℃显著地抑制发根的生长，影响发根的根尖细胞的正常分裂。 改变培养基中的蔗糖浓度和在发根培养的不同时期给培养基中添加蔗糖，试验结果表明蔗糖作为碳源对1601-L-3和1601-L-1的生长具有显著的影响。 (1)培养基中缺少蔗糖显著地抑制发根的生长。 (2)发根培养的前5天时间内，蔗糖浓度为30- 60glL昀培养基最有利于发根的生长，50glL的培养基中的发根生长最快，培养基中的蔗糖浓度大于60g/L小于30g／L时，发根的生物量增加较少。 (3)发根培养至第15天时，蔗糖浓度为60g/L的培养基最有利予发根的生物量的增加。发根培养至30天时，蔗糖浓度为60-90g/L的培养基，发根的生物量的增加相差不大，但是为蔗糖浓度为30-40g/L的培养基中的发根生物量一倍。 (4)发根培养过程中，分别于第5和15天给蔗糖浓度为30g/L的培养基中添加一次或二次蔗糖，使培养基中的蔗糖终浓度相当于60g/L或90g/L，培养至30天时，添加蔗糖的培养基中的发根的干重生物量相当于不添加蔗糖培养基中的发根生物量一倍，相当于初始蔗糖浓度为60g/L和90g/L培养基中发根的生物量。 (5)随着培养基中蔗糖浓度的提高，发根干重/鲜重比显著增加。培养基中的蔗糖的消耗量与发根生物量的增加呈正相关，蔗糖消耗越多，发根生物量的增加越大。 比较pH值对发根生长和QHS合成的影响表明，灭菌前pH值在5.O-6.5范围内的培养基适合予1601-L-1的生长，小于5.O不利于发根的生长，pH5.8有利于1601-1-1生长和QHS的生物合成。发根收获时培养基中的pH值一般为4.5-5.2. pH7.O抑制发根的生长，pHl0.O对发根具有强烈的致死作用。发根在培养过程中，对培养基中的pH值具有显著的调节作用，发根能在很短的时间内(24- 48hrs)使pl:l值为5.8、6.4、7.0培养基降低到pH4. 5-5.2，pH为5.8的培养基有利于QHS合成。 比较不同基本培养基对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明N6、DCR、Litvay培养基有利于1601-L-1的生长，WS、White、B5培养基不利于发根的生长。DCR培养基中的QHS含量最高。 根据三水平试验选用三水平正交表来安排试验的原则，选用三水平正交表L7(3-)，研究多因子效应对发根生长和QHS合成的影响，试验结果表明，Mg2+，Fe2+，Mn-2+，NH4NO3，KN03 ,KI,Ca-2+为发根生长的主要因子，NH4N03，KNOs，Mg2+，Ca2+，肌醇为QHS合成的主要因子。 通过TLC分析发根中QHS和其它化学成分，同时比较发根和无菌苗及野生植株的化学成分，发根和无菌苗均能合成包括QHS在内的野生青蒿叶片中的大部分非挥发性的化台 物。 研究青蒿植株在发育过程中QHS的含量的变化以及发根、无菌苗和野生青蒿中QHS的合成，HP分析结果表明，l、不同的单株青蒿之间的QHS量相差很大。2、同一植株幼 叶的QHS含量比老叶的QHS含量高。3、不同单株青蒿之间达到最高QHS含量的时间不一样，开花期或开花之前。4、无菌苗（带根）或者不带根丛生芽均能合成QHS，但是带根的无菌蕾的QHS量比丛生芽中的QIS的含量高。5、不同发根农杆菌转化的发根系1601-L-1和15834-L-1都能合成ＱＨＳ。

青蒿异源基因的遗传转化及青蒿生物合成相关基因的克隆

本论文由三部分内容组成，一、药用青蒿的遗传转化，即根癌农杆菌和发 根农杆菌介导的转化系统的建立及其影响参数的研究。二、青蒿素生物合成的 分子调控。三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。 一、药用青蒿的遗传转化。建立了Ri质粒介导和Ti质粒介导的两种转基因系统， 其中Ri质粒介导青蒿转基因系统的建立是国际上首次报道;以GFP基因为报 告基因，首次获得高效表达的青蒿转绿色荧光蛋白基因的丛生芽，并对GFP基 因的表达进行了组织和细胞水平的定位。此外，对影响两种转基因系统的主要 参数进行了较为详细的研究。上述研究为青蒿素生物合成的分子调控奠定了坚 实的基础。 二、青蒿素生物合成的分子调控。为探索提高青蒿植株或组织和器官中的青蒿 素含量，首次以棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷酸合成酶的 cDNA 为 目的基因导入青蒿，对青蒿中青蒿素的生物合成进行了分子调控研究的尝试。 通过已建立的两种转基因系统，将从棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷 酸合成酶的 cDNA 导入青蒿，获得转基因发根和转基因植株。结果表明，外源 基因的表达能够影响青蒿素的生物合成，其中法呢基焦磷酸合成酶基因的过量 表达能够促进青蒿素的生物合成，提高转基因发根和植株中的青蒿素的含量。 转基因发根F-26系中青蒿素含量最高达3.01 mg/g.DW，与对照相比青蒿素含量 提高3～4倍;转基因植株的青蒿素含量最高达10.08 mg/g.DW，与对照相比， 转基因植株的青蒿素产物提高2～3倍。此外，研究还表明，在转基因的发根C -37株系中，外源杜松烯合成酶基因的导入和表达可能相应地促进青蒿转基因 发根自身的法昵基焦磷酸基因的表达。 三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。采用 RT-PCR 技术，从马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 幼叶中克隆了 HMGRII 亚基因家族的一个新的成员 HMGR-c2（GenBank accession No．AF 096838Southem）;杂交分析表明，该基因至少以 两个拷贝以上形式存在于马铃薯基因组中;RT-PCR分析表明，HMGR -c2的 表达在幼苗期无组织特异性，广泛地存在于根、茎、叶等组织中。以青蒿001 株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期的λgtll cDNA文库，以PCR筛库方 法从青蒿中克隆一个法呢基焦磷酸合成酶cDNA (Artfps2 GenBank accession No． AF136602)和一个HMGR cDNA(GenBank accession No．AF142473);以青蒿 025株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期部分质粒文库以 PCR 筛库方法从 青蒿中克隆一个法昵基焦磷酸合成酶 cDNA (Artfpsl GenBank accession No.AF112881);此外，还从青蒿中克隆了倍半萜合成酶的 cDNA 片段(GenBank accession No.AF156854)。其中青蒿倍半萜合成酶基因的克隆是目前国际上本研 究领域最受关注的焦点和难点之一。至此，本研究已将与青蒿素生物合成相关 的三个重要的关键酶基因基本克隆，这无疑将加速青蒿素生物合成的基础和应 用研究的进程。

水母雪莲细胞悬浮培养黄酮合成的调控及生物反应器放大培养

水母雪莲（Sausswea medusa Maxim）为菊科风毛菊属植物，其主要的活性成份为黄酮类化台物。为进一步提高雪莲细胞培养物的黄酮含量和实现雪莲细胞培养生产黄酮类化合物的工业化，本文开展了水母雪莲细胞悬浮培养黄酮生物合成的调控及雪莲细胞生物反应器放大培养的可行性研究。 在水母雪莲细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸和乙酸钠两种前体，结果显示，它们均能促进细胞内黄酮的生物合成，但它们对细胞的生长也有一定的抑制作用。实验表明，前体的添加时间均以第6天为宜，它们的最佳添加浓度都是0.1 mmol/L。苯丙氨酸、乙酸钠两种前体协同添加，黄酮产量是对照的1.94倍，比它们单独加入更能促进细胞的黄酮合成。 两种非生物诱导子硝酸银和谷胱甘肚都能诱导水母雪莲悬浮培养细胞黄酮的生物合成，诱导子的作用效果与诱导于的浓度和添加时间有关。二者协同诱导，获得的黄酮产量达是对照的1.72倍，高于它们单独加入时的黄酮产量。 应用2L通气搅拌式生物反应器一步批式培养水母雪莲细胞。研究了搅拌转速、通气量和接种量对细胞生长和黄酮合成的影响，发现在75 r/min、700-1000 L/min和4.0-5.0 9 DW/L接种量下细胞生长和黄酮合成比较好。经过12 d培养细胞干重达13.8 9 DW/L,黄酮产量416 mg/L。水母雪莲细胞生长及黄酮合成的进程表明，黄酮积累与细胞生长呈正相关。对细胞聚集体分布的研究发现，剪切力等因素使细胞聚集体分裂，使反应器中细胞生长受到影响，黄酮产量较摇瓶中降低。

真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性研究

本论文主要包括以下两部分内容： 一、真菌诱导子对青蒿发根生长和青蒿素生物合成的影响 用3种真菌诱导子[大丽花轮枝孢（Verticillium dahliae Kleb.）、葡枝根霉(Rhizopus stolonifer (Ehrenb. ex Fr.) Vuill)和束状刺盘孢(Colleto trichumdematium (Pers.) Grove)]分别处理青蒿(Ar temisia annuaL．)的发根，这3种真菌诱导子均能促进发根中青蒿素的合成，其中以大丽花轮枝孢的诱导效果最好;对细胞生长均没有明显影响。经大丽花轮枝孢处理的发根中青蒿素含量达1. 12 mg/gDW，比对照(0. 77 mg/g DW)提高45%。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及发根的生长状态有关。对大丽花轮枝孢来说，诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖0.4 mg;发根在指数生长末期对诱导作用最敏感：在加入诱导子4d后收获发根，发根中的青蒿素含量最高。 二、早花基因FPF1、co对青蒿开花时间的影响及开花与青蒿素生物合成的相关性 1．将来源于拟南芥的早花基因Flowering Promoting Factorl (FPFl)插入到植物表达载体pBI121中，构建CaMV 35S启动子控制下含FPFl基因的植物表达载体pBI121FPF/，用含有pBI121FPF/质粒的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404感染青蒿(Artemisia annua L.)叶片并诱导丛生芽，经卡那霉素筛选，获得转基因抗性植株。PCR、 PCR-Southem blot及Southern blot检测表明，外源基因FPFI已整合到青蒿基因组中：RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，FPF1转基因植株的开花时间较对照提前20天左右，但提早开花的转基因植株与未开花的对照其青蒿素含量无明显差异，即提早开花并不能使开花植株的青蒿素含量有所提高，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。 2．将拟南芥的早花基因CONSTANS (CO)置于CaMV 35S启动子之下，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404介导转入青蒿(Artemisia annuaL．)，使之在青蒿中表达，并得到了抗性植株。PCR、PCR-Southem blot及Southemblot检测表明，外源基因co已整合到青蒿基因组中;RT-PCR及RT-PCR Southemblot分析表明，外源基因在转录水平上已有表达。在短日照条件下，co转基因植株的开花时间较对照提前2周左右，但提早开花的转基因植株的青蒿素含量与未丌花的对照无明显差异，即植株开花前青蒿素含量的提高并不是由于开花本身引起的，再次证明，开花与青蒿素合成之间可能没有直接的关系。

青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究-金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析

第一部分：青蒿开花与青蒿素生物合成相关性的研究 青蒿素是从中药青蒿中分离出的倍半萜内酯化合物，目前是世界上唯一有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物。青蒿植株中青蒿素含量在开花期最高，但是目前尚不清楚开花与青蒿素生物合成的关系。为此，我们用光周期（短日照）诱导青蒿提前开花，不仅同时获得了开花与不开花的青蒿植株，而且还成功地在同一植株上诱导部分分枝开花，另一部分分枝保持营养生长状态。这一实验体系为研究青蒿开花与青蒿素生物合成的相关性奠定了基础。实验结果表明，开花与不开花青蒿植株青蒿素含量有明显差异。开花植株的青蒿素含量在前2周内逐渐提高，第三周（开花期）达到最高，并保持一周左右，在随后的2周内下降。青蒿植株开花后，叶片便开始老化变黄，逐渐死亡。未开花青蒿植株的青蒿素含量动态在前三周内与开花植株类似，但是这种高青蒿素含量状态能保持较长时间，至少在随后的2周内没有下降。未开花植株的叶片依然保持绿色。这一结果表明，开花不是导致青蒿素含量提高的直接原因。 扫描电镜观察结果表明，幼嫩叶片上的毛状腺体( trichrome)结构是完整的，而在老化的叶片上，则观察到了相当比例(40-50%)破损的腺体。这可能是导致青蒿素含量下降的直接原因。 不同生态型青蒿对光周期的反应是不同的。在北京地区，本地青蒿在8月初便开始开花，而来自四川武陵的青蒿则要到9月份才能开花。根据这一特性，采用“南蒿北栽”的方法，能够使青蒿保持较长时间的营养生长状态，延长适于采收的时间。 第二部分：金丝桃和百金花二苯甲酮合酶基因的克隆，异源表达及功能分析 植物次生代谢物山屯酮( Xanthones)仅存在于龙胆科和藤黄科植物中。它们具有抑制单胺氧化酶，细胞毒素及抗肿瘤活性。 含有1 3个碳原子的二苯甲酮是山屯酮生物合成的中间产物，是由二苯甲酮合酶催化合成的，这一反应是山屯酮生物合成的关键步骤。二苯甲酮合酶已经在金丝桃和百金花细胞悬浮培养系统中检测到，并进行了细致的生化水平上的研究。本研究是在上述研究的基础上，进一步克隆该酶的基因，并进行异源表达及功能分析工作，以便更好地了解和调控山屯酮的生物合成。 用PCR和RT-PCR技术，从金丝桃cDNA文库和逆转录产物中分别克隆到一个基因HBPS1和HBPS2，从百金花cDNA文库中克隆到一个基因CBPS1。HBPS1含有1402个碱基，其开放阅读框架编码390个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为6.55。HBPS2含有1398个碱基，其开放阅读框架编码395个氨基酸，分子量为42.8 kDa，等电点为5.78。CBPS1含有1383个碱基，其开放阅读框架编码389个氨基酸，分子量为42.7 kDa，等电点为7.88。与GenBank中序列同源性比较结果表明：在氨基酸水平上，HBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性高达92%，HBPS2与萝卜（Raphanus sativus）查尔酮合酶的同源性为64%，CBPS1与茶（Camellia sinensis）查尔酮合酶的同源性为71%。HBPS1与HBPS2的同源性仅为62%。 将三个新克隆的基因的ORF整合到载体pGEX-G上的谷胱甘肽还原酶S基因下游，构建成转化质粒，并在大肠杆菌中诱导表达。结果表明，这三个基因的ORF片段均能被表达成约68 kDa的产物，这与期望的结果一致。 活性检测结果表明，HBPS1是查尔酮合成酶，其底物为香豆酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：香豆酰辅酶A 2.8μM，丙二酸单酰辅酶A，11.2μM。最适反应条件是350C，pH7.0，DTT浓度10 μM。 HBPS2是二苯甲酮合酶，其底物是苯甲丙氨酰辅酶A，和丙二酸单酰辅酶A，对这两种底物的亲和性KM分别为：苯甲丙氨酰辅酶A 2.4 μM，丙二酸单酰辅酶A 9.6μM。最适反应条件是350C，pH 6.5，DTT浓度50 μM。而CBPS1则没有检测到任何活性。从同一种植物中同时获得了查尔酮合酶和二苯甲酮合酶，对研究这两种十分相近的酶的差异表达，酶促反应机制等问题将非常有利。

毛白杨（Populus tomentosa）木质素生物合成相关基因分离与木质素合成调节

木质素是植物体中具重要生物功能的次生代谢产物。然而纸浆生产主要是将原料中的木质素与用于造纸的纤维素分离，该工艺过程产生了造纸工业的主要污染废液，并且增加造纸成本。本研究目的在于利用反义RNA技术，在分子水平调节木质素的生物合成，降低中国特有造纸树种毛白杨的木质素含量，培育更适于我国造纸工业的原料树种。以下为本研究已取得的相关研究进展： 1.通过RT-PCR技术，从毛白杨中克隆了木质素生物合成的三个相关酶的cDNAs，它们分别为咖啡酸甲基转移酶(caffeic acid O-methyltransferase，COMT)、咖啡酰CoA甲基转移酶(caffeoyl Co-enzyme A O-methyltransferase，CCoAOMT)及香豆酸：辅酶A连接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)。序列分析显示了毛白杨这三个基因与杨属中其它种的相应基因cDNA核苷酸序列高度同源。Northern点杂交分析表明，COMT、CCoAOMT及4CL基因在毛白杨正在生长的次生木质部中高水平表达，其表达高峰与树木的木质化进程同步;而在叶与叶柄中，这三个基因均不表达。COMT、CCoAOMT及4CL是木质素生物合成的相关酶，该表达特征与其基因功能相一致。本研究克隆的COMT、CCoAOMT及4CL基因的cDNAs已在GenBank注册登记，接受号分别为AF237777、AF240466、AF314180 (publish on Jan l,2002)。 2.通过一系列的DNA重组，构建了携带反义COMT、CCoAOMT或4CLcDNA的反义表达载体以及同时整合反义COMT与CCoAOMT cDNA的双价反义表达载体，PCR扩增与酶切检测确证构建无误。 3.以田间取材的速生三倍体毛白杨B19、B331及B304的茎尖、叶片与嫩茎为外殖体，首次获得了三倍体毛白杨的组培再生试管苗，并建立了速生三倍体毛白杨的组培再生系统，为通过基因工程改良其造纸性能奠定了基础。 4.农杆菌介导转化烟草，PCR与PCR-Southern检测表明我们获得了整合反义COMT、CCoAOMT cDNA及反义COMT及CCoAOMT cDNA共整合的转基因烟草。以Digoxigenin标记的对应于反义链的单链RNA为探针与转基因烟草的总RNA进行NoIthern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA均已表达。转基因烟草的木质素分析将有助于对COMT及CCoAOMT两个甲基化酶功能的认识。 5.通过农杆菌介导，将反义CCoAOMT cDNA转入欧洲山杨与银白杨的杂交杨（P tremulaXP.alba）。经PCR，PCR-Southern及Southern检测，确认获得了转基因植株。以Digoxigenin标记的对应于CCoAOMT cDNA反义链的单链RNA为探针与转基因杂交杨总RNA进行Northern点杂交，结果表明整合到其中的反义cDNA已在转录水平表达。测定生长5-6个月的转基因杨树下部茎杆的Klason木质素含量，结果显示其中一个株系的Klason木质素含量比野生型对照下降17.9%，表明抑制杨树内源CCoAOMT基因表达可有效降低转基因植株的木质素含量。

分子调控咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）对木质素合成及植物生长发育的影响

本论文由两部分组成，一、构建来自小麦的COMT的反义表达载体，转化烟草，研究抑制内源COMT对植物木质素合成及其生长发育的影响;二、利用花粉管通道法，将正义和反义COMT基因转化小麦，获得转基因小麦，从而进一步分析。 一、 反义抑制COMT对植物木质素合成及其生长发育的影响 构建含有小麦的咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT）cDNA的反义表达载体, 利用农杆菌法转化烟草。 PCR, PCR-Southern 检测显示目的基因片段成功转入烟草基因组。处于营养生长期的转基因植株表型与对照没有明显差异;而发育成熟的转基因植株的植株矮化，茎部木质素含量与对照差异不大，木质素的组成S/G比下降，部分木质部细胞发生变形。我们还发现转基因烟草种子发芽率提高，移栽2个月的子一代转基因植株光合速率、蒸腾速率有所增强。结果表明通过反义抑制COMT将影响木质素合成,并在不同的发育阶段，影响着植物的生长发育。 二、 利用花粉管通道法获得转基因小麦 将构建好的含有Bar基因的正义和反义COMT表达载体利用花粉管法转化两个小麦品种（H4564和C6001），共获得转基因处理的种子1117颗，重新播种后，发育成苗分别为321株，总成苗率为28.7%。通过除草剂PPT筛选，分别获得PPT抗性植株31株。PCR检测抗性植株，获得PCR检测阳性植株5株，总阳性率为0.45%。阳性植株分别为H4564反义处理株1株，C6001的正义和反义处理株各2株。对小麦的植株高度，分蘖数等生理性状的分析发现，转基因小麦的分蘖数减少，植株高度降低。这些生理性状的改变与COMT基因转化的关系将有待于进一步验证。