青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

青蒿素生物合成相关基因对烟草遗传转化的研究

　　青蒿素是存在于中药青蒿(Artemisia annua L.)中的一种含有过氧桥的倍半萜内酯化合物，是中国科学家研发出的当今最有潜力的抗疟药剂，较传统抗疟药很少或无毒副作用，因此青蒿素的生产备受人们关注。目前，青蒿素的生产主要以植物提取为主，但由于青蒿植株中青蒿素的含量很低（约占干重的0.01%～0.8%），从而导致青蒿素价格昂贵，使许多贫困地区的疟疾患者无法得到医治，故提高青蒿植株中青蒿素的含量或扩大青蒿素的来源，降低生产青蒿素的成本具有重要的意义。　　 　　本论文基于扩大青蒿素的来源和提高青蒿植株中青蒿素含量的目的，开展了以下两方面的工作： 一、紫穗槐二烯在烟草中组合生物合成的研究 　　紫穗槐二烯合酶（amorpha-4,11-diene synthase，ADS）是青蒿素生物合成的关键酶之一，为了能在烟草中合成青蒿素的前体，本研究将青蒿的紫穗槐二烯合酶基因置于CaMV 35S启动子控制下，通过根癌农杆菌介导转入烟草（Nicotiana tobacum L.），并获得了转ADS基因烟草植株。经PCR及Southern杂交分析表明，ADS基因已经整合到转基因烟草基因组中；RT-PCR及对转基因烟草中ADS酶活性和产物中紫穗槐二烯和植物甾醇的测定分析，进一步证明整合的ADS基因在转录、翻译水平上均已经表达。上述结果表明，利用基因工程将青蒿素生物合成途径的关键酶基因导入植物，转基因植物中能够合成青蒿素的前体，这一研究结果为利用转基因植物生产青蒿素或其前体奠定了基础。 二、青蒿鲨烯合酶双链干涉基因对烟草的遗传转化研究 　　鲨烯合酶（squalene synthase, SQS）是甾醇类生物合成分支途径的关键酶之一，利用RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)抑制目标基因表达的技术已日趋成熟。本文根据植物中hpRNA(hairpin RNA)的原理，在与烟草SQS同源性高达80％的青蒿ASQS序列的5/端保守区选择622 bp作为构建RNAi的序列，借助中间克隆载体，经过三次亚克隆，最后形成含ASQS－RNAi表达盒的双元表达载体pART27－ASQS，并转入农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的烟草叶盘转化法，共获得了12棵转基因植株。转基因植株经过PCR和PCR-Southern blotting 检测，证实外源ASQS基因已经导入烟草中，并已经成功整合到烟草基因组中；通过RT-PCR分析说明，转基因烟草中SQS基因的表达已被成功抑制，部分转基因植株中内源SQS的干扰效果高达90％以上。对SQS的直接产物鲨烯和最终产物植物甾醇的检测显示，转基因烟草的植物甾醇和鲨烯的含量明显低于对照。本实验的结果为下一步将此RNA干扰载体导入青蒿，抑制青蒿中ASQS基因的表达，从而提高青蒿素的含量提供了可能。

中药青蒿萜类代谢物谱分析及青蒿素生物合成的研究

青蒿素是从中药青蒿，学名黄花蒿（Artemisia annua L.）植物地上部分分离出的抗疟疾有效单体，为一种倍半萜内酯类化合物，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。青蒿素生物合成途径及其调控机制仍不完全清楚，本论文采用GC-MS 和GC×GC-TOFMS 方法对青蒿萜类代谢物谱进行检测，用多维统计学方法对检测结果进行整理和比较分析，研究青蒿素生物合成及其与青蒿中其他萜类代谢的关系，取得了以下结果： 一、通过GC×GC-TOFMS 方法对青蒿挥发油成分进行分析，共鉴定出303 种组分。其中挥发油中相对百分含量大于1%的10 种组分中有9 种为萜类化合物，含量接近总挥发油的50%。在相对百分含量大于0.1%的49 种成分中，有30 种萜类化合物。有27 种相对百分含量大于0.1%的成分首次在青蒿挥发油中报道，其中包括10 种萜类化合物。 二、利用GC-MS 方法分析了青蒿001 和SP18 两个青蒿素高产株系不同生长时期萜类代谢物谱，结果表明：青蒿中萜类化合物在不同时期合成和积累是动态变化的，萜类化合物的种类和数量在营养生长期随生长时间的延长而提高，在营养生长后期和现蕾前期达到最高水平，进入生殖生长后随生长时间的延长而迅速降低。通过多维统计PLS-DA（Partial Leasted Square Discriminant Analysis） 分析，确定001 中有17 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中15 个为萜类化合物。SP18 中有18 个化合物的含量在不同生长时期有明显变化，其中16 个为萜类化合物。青蒿素，青蒿酸，二氢青蒿酸，青蒿素B 都是含量变化明显的标记物。其中青蒿酸和二氢青蒿酸含量在营养生长后期达到最高水平，进入生殖生长后迅速下降，而青蒿素和青蒿素B 在整个检测时期含量变化相对较小，在营养生长时期含量已经较高，在现蕾前期含量稍有上升，进入现蕾期后有所下降，本研究确定现蕾前期为代谢物谱分析最佳取样时期，并为药材采收提供指导。 三、不同基因型青蒿代谢物谱研究表明，青蒿素高产株系SP18 和001 代谢物表现出一定的差异，通过多维统计PLS-DA 分析，共找出了22 种在两种基因型中差异明显的化合物，其中包括倍半萜化合物12 种，单萜化合物3 种，三萜化合物4 种。SP18 特征化合物为樟脑和两个未鉴定倍半萜化合物，而001 特征化合物是龙脑和β-法呢烯。另外两种基因型中青蒿素及相关前体化合物的积累模式差异明显，SP18 中二氢青蒿酸和青蒿素含量高，而青蒿酸和青蒿素B 含量极低；001 中二氢青蒿酸和青蒿素含量相对SP18 要低，但青蒿素B 和青蒿酸含量比SP18 要高。该结果表明在青蒿素高产株系中，青蒿素含量与二氢青蒿酸的含量呈正相关，结合Brown 等的活体标记研究结果分析，从二氢青蒿酸到青蒿素的转化可能是青蒿素合成的限速步骤。 四、利用GC×GC-TOFMS 方法对转基因青蒿萜类代谢物谱进行了分析，共对200 个左右化合物峰进行PLS-DA 和OSC-PLS (Orthogonal Signal Correction–Partial leasted Square)多维统计分析，结果表明：青蒿萜类代谢物谱在外源基因转入后发生显著变化，与对照株系相比均呈现显著差异。其中过量表达Amorpha-4,11-diene 合酶基因（ads）株系中青蒿素及相关化合物变化最明显，而过量表达FPP 合酶基因（fps）株系中青蒿素及相关化合物变化相对较小，在受到调控而成为差异标记物的化合物中，70%是倍半萜类化合物。 五、考察了外源茉莉酸甲酯对青蒿素生物合成的影响，结果表明：300 μM 外源茉莉酸甲酯能提高青蒿素含量，在处理后第8 天青蒿素含量提高38%。青蒿萜类代谢物谱研究表明，茉莉酸甲酯不仅可以诱导青蒿中青蒿素的合成，还能诱导很多化合物，特别是倍半萜和三萜类的合成。OSC-PLS 分析结果找出了9 个处理后含量明显提高的标记物，其中6 个倍半萜化合物，3 个三萜化合物。标记物鲨烯含量提高了67%，另一个未鉴定出结构的倍半萜提高了60%，这些化合物可能与青蒿素有着类似的调控机制，而外源喷洒茉莉酸甲酯可以作为提高青蒿素产量的有效途径之一。

中药青蒿紫穗槐二烯合酶基因表达及调控的研究

青蒿素是从我国传统药用植物中药青蒿（Artemisia annua L.）中提取的新型抗疟特效药，其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径。目前，青蒿素生物合成的组织部位及其调控机制仍不完全清楚。紫穗槐二烯合酶（amorpha-4， 11-diene synthase, ADS）作为青蒿素生物合成分支途径的第一个关键酶，催化倍半萜化合物的通用前体法呢基焦磷酸环化，生成紫穗槐二烯。本论文通过对ADS 表达特性的分析，研究了青蒿素生物合成的组织特异性及其调控机制，主要研究结果如下： 一．紫穗槐二烯合酶基因启动子功能的研究 从青蒿高产株系001 中克隆得到了2850 bp 的ADS 启动子调控区。通过比较5’RACE 的测序结果与启动子序列，确定转录起始位点位于翻译起始位点上游44 bp，TATA 盒下游27 bp。该启动子序列包含的顺式作用元件有脱落酸应答元件(ABRE )、乙烯应答元件(ERE)、生长素应答元件(AUXRE）等植物激素反应元件，以及低温应答元件（LTRE）、高温应答元件（HSE）等与逆境有关的反应元件，还有与真菌诱导有关的W-box 元件等。将不同长度ADS 启动子与报告基因GUS 融合，构建了植物表达载体，通过农杆菌介导的方法获得稳定整合的转基因烟草。经过组织化学、GUS 荧光活性检测及RT-PCR 分析，发现该启动子的转录活性很低，无法通过GUS 染色进行观察。GUS 荧光活性检测及RT-PCR 结果表明，转录起始位点上游346 bp 是ADS 基础表达所必需的。高温、低温、干旱、水杨酸、茉莉酸甲酯等处理均能促进青蒿中ADS 的表达，而脱落酸和乙烯的作用效果较小，与启动子序列分析的结果并不完全一致。 二．紫穗槐二烯合酶基因表达特性的研究 以青蒿高产株系001 为材料，在基因和蛋白水平揭示了ADS 的表达特性。RT-PCR 和Western 分析结果表明，ADS 在幼叶和花蕾中大量表达，在老叶和完全开放的花中表达量很低，而在青蒿的根和茎中几乎检测不到ADS 的表达。石蜡切片和整体原位杂交的结果表明，ADS 在顶端分生组织、叶原基及分泌腺毛中表达，在非分泌的T 型腺毛中不表达。当叶片完全展开后，ADS 只在分泌腺毛中表达，而且随着叶片的生长和老化，ADS 的表达量逐渐减少。另一个非常有趣的发现是同一叶片上的分泌腺毛，有些有ADS 的表达，有些则没有。用强光、低温、高温和水杨酸等因素处理后，有ADS 表达的分泌腺毛的比例没有明显的变化。 三．外源水杨酸促进青蒿素的生物合成 研究了外源水杨酸对青蒿素生物合成的影响，结果表明：1 mM 水杨酸处理后，青蒿叶片中的游离态水杨酸含量快速增加，处理后4 h 达到 0.79 μg g-1 FW，是对照的3.5 倍。外源水杨酸能够抑制青蒿中过氧化氢酶活性，提高抗坏血酸过氧化物酶活性，并通过对抗氧化酶活性的抑制引起青蒿体内活性氧水平的迅速升高。在处理后4 h，青蒿中H2O2 和O2-的含量分别达到对照的2.1 倍和2.4 倍。青蒿素含量在水杨酸处理后的前8 h 缓慢升高，随后升高的速度增加。外源水杨酸处理后8 h 和96 h，青蒿素含量分别达到9.1 mg g-1DW 和13.9 mg g-1DW，比对照高21.7%和75.8%。处理后8 h，青蒿酸的含量没有明显变化，随后开始增加。处理后16 h，青蒿酸的含量达到3.6 mg g-1DW，比对照高90%， 随后继续升高，至96 h 达到4.98 mg g-1 DW，比对照高127%。二氢青蒿酸的含量在处理后的8 h 内有所下降，随后缓慢升高。处理后8 h，二氢青蒿酸的含量降低了23.3%，随后二氢青蒿酸的含量开始升高，在处理后96 h，达到7.4 mg g-1DW，比对照高72.1%。外源SA 处理提高了青蒿素及其前体的总含量，在处理后1、2、4 天分别比对照提高了1.3、1.5 和1.8 倍。Northern 结果表明，水杨酸强烈诱导了青蒿素生物合成基因HMGR、ADS 的表达，但是对FPS、CYP71AV1 的诱导作用较小。这些研究结果表明，外源水杨酸至少通过两条途径诱导青蒿素的生物合成：一是通过诱导活性氧的产生促进二氢青蒿酸向青蒿素的转化；二是上调部分青蒿素生物合成相关基因的表达。根据这一研究成果，在青蒿田间栽培中，可以在收获前通过喷施水杨酸来快速、有效和低成本地提高青蒿素产量。