鼠尾藻的生理生态和繁殖生物学研究

鼠尾藻 [Sargassum thunbergii (Mert.) O’Kunte] 是北太平洋西部特有的一种暖温性大型经济褐藻，在我国沿海地区北起辽东半岛南至雷州半岛的硇州岛，都有广泛分布。鼠尾藻在食品和医药领域的应用开发在我国有悠久历史。近年来，随着水产动物养殖业迅速发展，其应用领域得到了进一步拓展，发现鼠尾藻是海参、鲍鱼等水产动物的优质天然饵料。 受海参和鲍鱼产业发展影响，鼠尾藻的市场需求量成倍增加。目前鼠尾藻的供应全部依赖自然资源。掠夺式的采收方式导致鼠尾藻的野生资源遭到了很大破坏，种群规模和数量不断减小，生态环境也发生了变化。近年来鼠尾藻供需矛盾已经非常突出，如何保护和有效利用该海藻资源已经成为海藻科研和产业界的一个重要话题。 以往对鼠尾藻的生态学和人工育苗技术方面的比较深入的研究工作很少，许多基础科学问题研究不够，人工繁殖技术没有很好地掌握，已经不能满足产业发展需求并限制了鼠尾藻应用价值的发挥。为此，有必要系统性研究鼠尾藻原生态环境、野生状态下生长发育的年际交替规律、鼠尾藻有性生殖过程、人工育苗方法途径、鼠尾藻吸收无机营养能力、以及在调控藻际菌群能力等基础科学技术问题，带动鼠尾藻饵料规模的良性健康扩大，并进一步推动海参和鲍鱼等水产业的发展。 本文以青岛汇泉角的鼠尾藻为基本实验材料，通过野外实地周年观察并结合实验室工作，对上述问题初步进行了初步探索，主要获得如下结果： （1）在青岛地区海滨岩石地带，全年都可观察到鼠尾藻藻体，藻体的形态大小和生理发育状况随季节变化表现出很大的差别性。夏季藻体黄褐色，初生分枝伸展，有次生分枝、生殖枝和气囊的发育，而冬季的藻体黑褐色，初生分枝粗短，没有次生分枝、生殖枝和气囊的发育。6月鼠尾藻出现有性生殖器官生殖托，到7月生殖托发育成熟，7月藻体最长，平均在50厘米左右，11月可观察到有性生殖和假根产生的幼苗。假根营养繁殖再生苗是鼠尾藻种群新苗源的主体，在维持种群自然繁衍和发展中起主导作用。 （2）有性生殖过程是鼠尾藻个体发育的大事件，精卵结合产生幼苗的潜力巨大，是开展未来规模化人工育苗的希望依托。鼠尾藻初生分枝长度和外形株间差异较大，每株鼠尾藻平均大约有20个初生分枝，约一半初生分枝可发育成熟，充分发育的初生分枝可产生30－50个次生分枝，每个次生分枝上又有大约20－30个生殖枝，每个生殖枝上生殖托数量一般为1－3个，雌托长度大多在3－5mm，雄托长度在10－15mm。生殖托的成熟度由基部向顶端递减。一个雌托排卵量平均为400多粒。以此计算，每株雌性鼠尾藻在生殖季节可产生200多万个卵。 卵从生殖窝孔排出后粘附于雌托表面，雄托排精时间稍晚于雌托挂卵时间，精子游动到卵周围与之结合完成受精过程。受精卵大约在受精后1小时分裂为两个大小相近的细胞，2小时后再进行第二次分裂，其中一个细胞横裂为两个细胞：一个细胞较大，另一个细胞较小，另一个细胞的分裂面与第一次分裂垂直，等分为两个细胞，随后细胞不断分裂。在受精后48小时左右，胚苗一端产生出假根。胚苗从雌托脱落的第一周内，尽管细胞数量增加较快，但新细胞体积减小，使得胚苗的体积增加不多。从第二周开始幼苗的体积出现明显的增加。此时，无机营养盐的有效补充对鼠尾藻幼苗培养长大是十分必要的。下海后的管理是保障幼苗成活的关键，此时常常发生脱苗现象。 （3）鼠尾藻对无机氮、磷都有较强的吸收能力，鼠尾藻从海水中吸收无机氮和无机磷的能力分别为75.1mg/kg/day和36.2mg/kg/day，鼠尾藻对氮、磷吸收的质量浓度比例接近5：1。 （4）鼠尾藻具有调节藻际微生物种群的能力，鼠尾藻对弧菌和总异养菌菌群都有一定程度的抑制作用，研究发现鼠尾藻抑制弧菌的能力存在种的差异，其中对鳗弧菌65#显示的抑制作用最强，鼠尾藻的抑菌能力的强弱还与其生理状态的好坏有显著关系。 通过上述研究结果，我们认为：鼠尾藻通过有性生殖过程培育种苗在理论上具有可行性，发展潜力很大。而解决幼苗后期培养中的脱苗问题、提高苗的成活率是下一步需要研究攻克的关键技术；假根营养繁殖再生苗源是维持该藻自然种群的主要方式，也是目前开展人工养殖获得健壮苗种的重要途径，连根采收方式对鼠尾藻野生资源破坏严重；建议野生鼠尾藻在7月底到8月初（水温27℃左右）采收（此时藻体生物量接近最大、并完成生殖过程），采用剪切方式保留假根和幼小的初生枝收获，该方式还可以应用到收获人工筏式养殖的鼠尾藻中，这对保证假根的完整性，大量获得下一个栽培季节的健壮新苗有实际意义；建议进一步开发鼠尾藻吸收富营养化物质、净化养殖环境水质的能力，以及对弧菌和总异养菌的抑制能力，建立海参、鲍鱼和鼠尾藻生态互补、环境友好的养殖模式，控制病害发生，提高水产品产量和质量。

褐藻多酚羟基测定及抗氧化性质研究

羟基是褐藻多酚结构特征，以往只以间苯三酚为标准物对褐 藻多酚中总羟基用FD法进行测量，核磁共振研究表明褐藻多酚中除间三羟基外还含有连三羟基（Ragan, et al, 1986），连三羟基的测量与它所占总羟基工比例是探讨褐藻多酚构效关系的基础，此类研究未有报道；关于褐藻多酚的抗氧化性，只有增重法和过氧化值法对其进行研究的报道，而关于抗氧化机理未有报道。采用FAS法、FD法对鼠尾藻（Sargassum. thunbergii)、海黍子(Sargassum. kjellmanianum)、裙带菜(Undaria pinnatifida)、海带(Laminaria japonica)中褐藻多酚连三羟基与总羟基含蓄量的比例进行了研究，结果依次为24.4%、25.6%、1.7%和2.6%;采用DPPH体系、羟基自由基体系、烷基自由基引发的亚油酸氧化体系、超氧阴离子自由基体系对海黍子高分子量褐藻多酚抗击氧化性质进行了研究，发现其清除DPPH活性、清除羟基自由基活性、抑制烷基自由基引发的亚油酸氧化的活性分别为77%、27%和21%，但它不具有清除超氧阴离子自由基的能力。褐藻多酚具有供氢能力且其连三羟基的供氢能力大于间三羟基，清除羟基自由基与其苯环提供的羟基自由基加成位点的数量有关。对褐藻多酚抑制A_3钢腐蚀进行了电化学研究，发现褐藻多酚可使海水中A_3钢腐蚀电位转正并与工作电极附近的溶解氧反应减缓腐蚀。本研究表明褐藻多酚的抗击氧化性与其羟基结构的苯环提供的羟基自由基加成位点的数量有直接关系。

马尾藻种群遗传及早期发育的研究

本研究运用RAPD和ISSR两种分子标记技术，对采自山东半岛4个不同地理位置的鼠尾藻（Sargassum thunbergii）和海黍子（S. muticum）种群进行了遗传多样性和遗传结构的研究，从而对其种群间的地理隔离、基因流动水平及其影响因素做出估计和判断，为马尾藻自然资源的保护和开发提供依据。在室内对鼠尾藻有性生殖幼苗的早期发育和生长进行了研究，了解其繁殖生物学特性，为鼠尾藻人工种苗的培育提供依据。主要研究结果如下： 对4个鼠尾藻（S. thunbergii）地理种群的遗传多样性研究中，筛选出了28条RAPD 引物和19条ISSR引物，分别扩增产生了174和125个位点。选用的三种不同指标，即多态位点比率（P％，percentage of polymorphic loci），平均预期杂合度（H，the expected heterozygosity）和 Shannon's 信息多样性指数（I，Shannon's information index），均可反映出鼠尾藻种群内部的遗传多样性呈较低水平。而群体间遗传距离（D，Nei’s unbiased genetic distance）矩阵和固定化指数（FST,the fixation index）矩阵均反映出群体间高度的遗传分化。通过分子变异分析（AMOVA，Analysis of molecular variance）来区分来自种群内部和种群之间的遗传变异，揭示出多数的遗传变异（57.57% 或59.52%）来自于鼠尾藻种群之间。另外，Mantel分析表明，4个鼠尾藻种群间的遗传分化与地理距离呈正相关（r>0.5），遵循传统的IBD（isolation by distance）模式，UPGMA（unweighted pair group method with arithmetic averages）聚类分析也反映出相似的结果。 对4个海黍子（S. muticum）地理种群遗传结构的研究中，筛选出的24条RAPD 引物和19条ISSR引物分别扩增出164和122个位点。遗传多样性评估结果表明，海黍子种群内部存在较低或者中等水平的遗传多样性，而D矩阵和FST 矩阵均显示种群间存在高水平的遗传分化。并且，发现D和FST 矩阵在RAPD和ISSR分析中均具有高且显著的相关性。AMOVA分析显示，种群之间的遗传变异高于种群内部。Mantel分析和UPGMA聚类分析均发现海黍子种群间的遗传分化遵循IBD模式，即与地理隔离呈正相关（r>0.6）。 并且，RAPD和ISSR分析的结果高度一致（r>0.9，P<0.05），均揭示4个海黍子种群之间存在高度的遗传分化。 对鼠尾藻有性生殖幼苗早期生长发育的研究结果表明，其早期发育过程属于马尾藻科（Sargassaceae）中典型的“8核1卵”型。在一定条件下培养两个月后，产生了1～2个小叶，幼苗的长度达2～3毫米。生长实验发现，温度（10, 15, 20, 25℃）和光照强度（9, 18, 44, 88 µEm-2s-1）对培养第一周幼苗的生长均有显著的影响（ANOVA, P<0.01）。在两个月的培养中，幼苗对温度和光强的耐受范围较宽，在10℃～25℃，9～88 µEm-2s-1条件下均可生长，最适温度和光强为25℃，44 µEm-2s-1；低温（10℃）对幼苗的生长有显著抑制。不同光质对幼苗生长的影响显著（P<0.01），相同光强条件下，蓝光和白光相比较，蓝光显然不能满足鼠尾藻幼苗早期生长的需要。

两种海洋生物次生代谢产物的研究

本论文对多指软珊瑚（Sinularia numerosa）和鼠尾藻（Sargassum thunbergii）两种海洋生物的化学成分进行了研究，对从其中分离得到的大部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 多指软珊瑚采自海南三亚，样品经冷冻干燥并粉碎后用丙酮浸泡提取得到提取物；鼠尾藻采自山东青岛沿岸，样品干燥后用乙醇提取，将提取物先后用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相提取物。 采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、重结晶以及半制备HPLC等手段分离得到38个化合物。利用各种现代波谱技术（IR、UV、MS、HR-MS、1D-NMR、2D-NMR等），确定了其中27个化合物的结构。其中，从多指软珊瑚中得到30个化合物，鉴定了其中得19个化合物，包括2个新的西松烷二萜类化合物（化合物SN1，命名为Numerolides A；化合物SN2，命名为Numerolides B）、1个新的甾醇类化合物（化合物SN3，命名为Gorgost-3β, 7β-diol）以及15个首次从该种中报道的化合物。从鼠尾藻中分离鉴定了8个化合物，包括植醇、岩藻甾醇、2个单萜类化合物、1个环戊烯酮类化合物及3个不饱和长链化合物，这些化合物皆为首次从该种中报道。对大部分化合物作了针对人肝癌细胞株SMMC-7721体外细胞毒活性和抗菌活性筛选，所测样品均未显示针对SMMC-7721的细胞毒活性，而化合物SN15具有中等强度的抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性，化合物SN19有促进金黄色葡萄球菌生长的活性。

褐藻两个光系统的色素-蛋白质复合物的分离及特性研究

以褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)、萱藻(Scytosiphon lomentarius)、海蒿子(Sargassum confusum)、叉开网地藻(Dictyopteris divaricata)、海带(Laminaria japonica)、囊藻(Colpomenia sinuosa)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、水云(Ectocarpus confervoides)为材料，对其色素-蛋白质复合物的分离技术及其特性进行了系统研究。通过对裙带菜色素-蛋白质复合物分离技术及其影响因素的研究，确立了褐藻的PAGE分离方法。采用Tris-Gly电泳分离系统，以非离子去污剂DMG或DIG为增溶剂(DMG: Chl=20: 1, DIG: Chl=50: 1, 4 ℃增溶1 h)，10%的分离胶浓度，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为30: 0.8,从裙带菜中成功地分离出8条含色素的蛋白质复合物带。采用Anderson命名系统，以高等植物菠菜为参照，将其命名为CPIa, CPI, CPa, LHC_1, LHC_2, LHC_3, LHC_4和LHC_5。游离色素较少。通过对三种褐藻的色素-蛋白质复合物的表观分子量测定、光谱学研究以及对裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽组成分析，揭示了褐藻各种色素-蛋白质复合物的特征。CPIa是褐藻分子量较大的PSI复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。CPI是褐藻的PSI核心复合物，为P700-叶绿素 a-蛋白质复合物。CPa是褐藻的PSII复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。其余5条为捕光色素-蛋白质复合物，LHC_1和LHC_3是墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物，LHC_2, LHC_4和LHC_5是叶绿素 a/c-蛋白质复合物。根据裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽分析结果并与高等植物比较，提出褐藻PSI和PSII的结构模型。褐藻PSI和PSII的反应中心多肽与高等植物相同，捕光复合物明显区别。褐藻LHCI和LHCII的多肽组成相同，都是由单一的20 kDa多肽组成。褐藻叶状体、叶绿体、类囊体膜和PSI复合物的77 K 荧光发射光谱具有特异性，缺少高等植物PSI特征的730 nm 荧光峰。叶状体的77 K 荧光发射光谱按荧光主峰的波长分为两种类型，一种类型的荧光主峰在690 nm，另一种类型的在705-720 nm。三种褐藻PSI复合物的77 K 荧光发射光谱相同，有两个分别们于680 nm和715 nm 的发射峰。褐藻的77 K 荧光特异是由PSI的结构决定的。根据褐藻PSI复合物的荧光特性以及去污剂增溶动力学分析结果，推动F715来自褐藻核心色素-蛋白质复合物，F680来源于PSI复合物中的捕光复合物。褐藻PSI复合物中缺少高等植物发射730 nm 荧光的LHCIb复合物的能量传递模型。

两株海藻内生真菌次生代谢产物及其生物活性研究

海洋微生物拥有丰富多样的次生代谢途径，其中海洋生物内生真菌次生代谢产物研究日益受到天然产物化学界的重视。本论文以菌丝体生物量、发酵产物重量、抗菌与细胞毒活性、薄层色谱分析结果以及高效液相色谱分析结果等为评价依据对采自青岛沿海的13株海藻内生真菌在四种液体培养基上的静置发酵产物进行了综合评价，并从中选择了黑曲霉Aspergillus niger EN-13（分离自褐藻囊藻Colpomenia sinuosa）和杂色曲霉A. versicolor EN-7（分离自褐藻鼠尾藻Sargassum thunbergii）两株真菌进行了30升规模发酵（分别采用GPYM培养基和PDB培养）和化学成分的研究，对分离得到的大部分化合物进行了初步的生物活性筛选。 发酵提取物采用常规的硅胶柱层析、反相硅胶柱层析，凝胶Sephadex LH-20柱层析、制备薄层层析、半制备高效液相色谱以及重结晶等分离手段，得到单体化合物。利用各种现代波谱技术(IR、UV、EI-MS、FAB-MS、HR-ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR、DEPT、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等)并结合化学方法从两种菌株发酵提取物中鉴定了55个化合物的结构。其中从菌株A. niger EN-13分离鉴定了31个化合物，发现9个新化合物，包括2个鞘酯类化合物（AN-1~2）、3个萘并-γ-吡喃酮类化合物（AN-3~5）、3个苯乙基取代的α-吡喃酮类化合物（AN-17, AN-19~20）和1个甾体Diels-Alder加成产物（AN-21），另有1个新的天然环二肽（AN-27）被分离鉴定；从菌株A. versicolor EN-7分离鉴定了24个化合物，发现2个新化合物，为蒽醌AV-12与AV-17，另外，从前一菌株（A. niger EN-13）中鉴定的2个新鞘酯类化合物（AN-1~2）在A. versicolor EN-7中也被再次分离到。 对大部分单体化合物进行了抗菌活性、DPPH自由基清除活性和细胞毒活性测试。结果显示新化合物AN-1、AN-5和AN-20具有弱或中等强度的抑制白色念珠菌生长的活性，AN-4、AN-5、AN-21显示了弱或中等强度的抑制黑曲霉生长的活性，AV-12、AV-17显示了弱的抑制大肠杆菌生长的活性。在DPPH自由基清除活性筛选中，AN-5显示了中等强度的活性，其EC50为109.3 mM，与阳性对照BHT相近（EC50为81.8 mM）。其它部分已知化合物在抗菌和DPPH自由基清除活性的筛选中也显示了弱或中等强度的活性。在针对人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的体外细胞毒活性筛选中，所测样品均未显示显著活性。

Sorption and desorption of Cu and Cd by macroalgae and microalgae

The sorption and desorption of Cu and Cd by two species of brown macroalgae and five species of microalgae were studied. The two brown macroalgae, Laminaria japonica and Sargassum kjellmanianum, were found to have high capacities at pHs between 4.0 and 5.0 while for microalgae, optimum pH lay at 6.7. The presence of other cations in solution was found to reduce the sorption of the target cation, suggesting a competition for sorption sites on organisms. Sorption isotherms obeyed the Freundlich equation, suggesting involvement of a multiplicity of mechanisms and sorption sites. For the microalgae tested, Spirulina platensis had the highest capacity for Cd, followed by Nannochloropsis oculata, Phaeodactylum tricornutum, Platymonas cordifolia and Chaetoceros minutissimus. The reversibility of metal sorption by macroalgae was examined and the results show that both HCl and EDTA solutions were very effective in desorbing sorbed metal ions from macroalgae, with up to 99.5% of metals being recovered. The regenerated biomass showed undiminished sorption performance for the two metals studied, suggesting the potential of such material for use in water and wastewater treatment. (C) 1998 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

Determination of chemical species of iodine in some seaweeds .1.

The chemical species of iodine in seven marine algae Codium fragile, Ulva pertusa, Monostroma nitidum, Gracilaria confervoides, Sargassum Kjellmanianum, Dictyopteris divaricata and Laminaria japonica were studied using neutron activation analysis combined with chemical separation. The contents of total iodine, water-soluble iodine, soluble organic iodine, I- and IO3- were determined. The results indicate that the chemical species and contents of iodine in various algae are remarkably different. The highest iodine content of 734 mg/kg (wet basis) was found in Laminaria japonica, with 99.2% of the total iodine being water soluble. The iodine contents of the other six algae are lower and soluble iodine makes up 16-41% of the total. In the aqueous leachate, iodine is mainly I-, which amounts to 61-93% of total water-soluble iodine; the percentages of organic iodine making up 5.5-37.4%, while the contents of IO3- are the lowest, 1.4-4.5%. This result suggests that the mechanism of iodine enrichment is different for various algae and that its bioavailability varies as well. (C) 1997 Elsevier Science B.V.