三叶木通花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物最关键的创新（innovation）性状。在被子植物的不同类群中，其形态多种多样，尤其以基部真双子叶植物的花形态最为丰富。大量的系统发育分析表明，在核心真双子叶植物起源之前，几个与花发育相关的MADS-box基因亚家族均发生了大尺度的基因重复事件。因此，在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，并且它们经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。基部真双子叶植物，作为基部被子植物和核心真双子叶植物之间的过渡类群，对于我们理解被子植物花的进化，揭示核心真双子叶植物花的起源以及基部真双子叶植物花多样性分化的分子机制非常重要。本文以基部真双子叶植物三叶木通为研究材料，着重进行了以下研究工作： 1. 花器官发生过程的观察。三叶木通的花为雌雄同序的单性花。而且，根据成熟花的形态，三叶木通的雌花和雄花都只有一轮花被器官，即三个花瓣状的萼片。扫描电镜的观察结果表明：1）在花器官的发生和发育过程中，在萼片和雄蕊原基之间，确实没有花瓣原基或另一轮萼片原基发生。2）雌花和雄花都是以两性花的方式发生发育的。3）单性花是由于在花发育的最后阶段，雌花中雄蕊或者雄花中心皮的退化而产生的。 2. 花发育相关基因的克隆。应用5’/3’ RACE的方法，我们从三叶木通不同发育阶段的混合花芽中共分离到九个与花发育相关的MADS-box基因： AktFL1、AktFL2、AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3、AktPI、AktAG1、AktAG2和AktSEP3。 3. A类MADS-box基因的进化。由于A类基因在进化过程中序列结构的改变，再加上取样的限制，使得A类基因间的进化历史一直不能被很好的理解。因此，本文对A类基因的研究从构建该基因亚家族的系统发育树开始。主要结果如下：1）通过扩大在基部真双子叶植物和被子植物其它重要类群的取样，我们的系统发育树基本上反映了现存被子植物的系统发育关系。2）核心真双子叶植物的A类基因由三个分支组成：euFUL、euAP1和AGL79，它们是通过发生在核心真双子叶植物起源之前的两次几乎同时的基因重复事件产生的。3）在基部真双子叶植物中，山龙眼目、毛茛目和黄杨科的A类基因各形成一支。而且，在这些类群内，发生了多次小尺度的独立的基因重复事件。4）来自单子叶植物的FUL-like基因明显地构成一个单系，并且包括三个分支：OsAMDS14、OsMADS15和OsMADS18。它们是由于两次不连续的基因重复事件产生的。5）不同类型的A类基因产物在C末端拥有不同的保守基元。6）从基因组结构上看，所有的A类基因都拥有八个外显子和七个内含子。7）通过对三叶木通中两个FUL-like型基因（AktFL1和AktFL2）表达式样的观察，我们发现它们在叶原基和发育早期的花原基以及发育着的花器官中都有表达。此外，A类基因表达式样的进化分析结果表明被子植物中该类基因的祖先可能具有广泛的功能，既在营养器官中表达又在生殖器官中表达 。 4. B类基因表达式样的保守性和多样性。通过对B类基因的系统发育和表达式样分析，得到以下结果：1）三叶木通中的三个paleoAP3基因是通过两次基因重复事件产生的。2）在木通科或木通属内，PI型基因并没有发生基因重复事件。3）RT-PCR结果表明，AktAP3_1在雌花中的表达量比雄花中高，而AktAP3_2则在雄花中的表达量比雌花中高。AktAP3_3和AktPI在雌花和雄花中的表达水平相似。4）原位杂交分析显示这些基因在发育着的雄蕊和心皮中表达。此外，AktAP3_3和AktPI还在萼片中表达，可能参与花瓣状萼片的发育。 5. 三叶木通C/D和E类基因的序列结构和表达分析。通过序列结构分析，我们发现，与其它被子植物AG同源基因编码的MADS-domain蛋白一样，AktAG1和AktAG2在MADS结构域的N末端都拥有一段氨基酸序列的延伸，AktAG1为20个氨基酸;AktAG2为7个氨基酸。原位杂交分析表明AktAG1和AktAG2主要在发育着的雄蕊和心皮中表达，说明它们具有决定生殖器官发育这一保守的功能。 AktSEP3属于AGL9型的E类基因。该基因在所有花器官中都有表达，说明和其它被子植物的E类基因一样，AktSEP3在三叶木通中对于所有花器官的发育都是必需的。 6. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用。在前面工作的基础上，我们首次对三叶木通中上述MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）AktSEP3的C末端具有转录激活功能。2）三个AktAP3蛋白与AktPI蛋白都能够形成异源二聚体，但是它们之间的作用能力并不相同。3）AktSEP3蛋白可以与AktFL1、AktPI、AktAG1和AktAG2形成异源二聚体，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性。4）AktFL1与AktPI、AktSEP3和AktAG2也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。 综合以上结果，我们探讨了三叶木通花发育的分子机制。在三叶木通的三轮花器官中，与拟南芥等模式植物相似的是：E类（AktSEP3）基因在每一轮花器官中都起作用;此外，A类（AktFL1）和B类（AktAP3_3和AktPI）基因在花瓣状的萼片中有不同程度的表达，类似于拟南芥的第二轮;B类（AktAP3_1、AktAP3_2、AktAP3_3和AktPI）和C/D类（AktAG1和AktAG2）基因在雄蕊的发育过程中起作用;C/D类（AktAG1和AktAG2）基因对心皮的发育起作用。与拟 南芥等模式植物不同的是：1）虽然原位杂交分析表明，AktFL1、AktAP3_3、AktPI和AktSEP3都在花瓣状的萼片中有 不同程度的表达，但是它们的蛋白质产物AktFL1与AktSEP3和AktAP3_3与AktPI都只能形成较弱的异源二聚体。而 且，根据我们的研究结果，在三叶木通中没有找到euAP1型的A类基因，只有两个FUL-like型的A类基因。它们的功能 与核心真双子叶植物中的euFUL型基因相似。因此，AktFL1很可能与其它调控因子共同作用负责花分生组织的形成;AktFL1/AktAG2则可能在花发育的后期起作用。那么，三叶木通花瓣状萼片的发育是否需要AktFL1/AktSEP3和 AktAP3_3/AktPI的参与，还是另有其它转录因子的参与，仍然需要更深入的研究。2）虽然在三叶木通中，雄蕊的发 育同样需要B、C/D和E类基因的参与，但是由于小尺度的基因重复事件，在该物种中只拥有三个paleoAP3型基因，而没有euAP3型基因。而且，由于复制拷贝间的亚功能化，AktAP3_1/AktPI主要参与雌花的发育过程;而AktAP3_2/AktPI主要参与雄花的发育过程。

金粟兰花发育相关基因的结构、功能和进化研究

花是被子植物区别于其它植物大类群的最重要的特征，其形态多种多样。花的发育取决于一个复杂的涉及到多个基因和过程的调控体系，因此花的起源和多样化过程实际上可以理解为这个调控体系的进化过程。在被子植物的不同物种中，花发育相关基因的组成并不相同，且经历了不同的进化历史，这意味着这些基因可能以不同的方式调控花的发育。相对于核心真双子叶植物相对稳定的花形态结构而言，基部被子植物的花具有丰富的多样性。因此，对基部被子植物花发育相关基因的研究对于我们理解被子植物花的进化非常重要。 金粟兰科（Chloranthaceae）是基部被子植物的代表类群之一。与研究得比较深入的模式植物相比，花被、雄蕊或雌蕊的缺失，使得该科植物的花比较简单。因此对该科植物中花发育基因的研究不仅有助于揭示花的起源以及花多样性分化的分子机制，还将为认识花部构造简单化的机制提供资料。本文以金粟兰（Chloranthus spicatus）为实验材料，取得了以下研究结果： 1.花发育相关基因的克隆 应用5’/3’RACE的方法，我们从金粟兰不同发育阶段的混合花芽中克隆到了与花发育相关的MADS-box基因：CsPI、CsAG1和CsAG2。 2. 两个A类MADS-box基因表达式样的对比分析 在营养分生组织向生殖分生组织的转变中，花原基的形成，以及随后雄蕊、心皮、花粉、胚珠和胚囊的发育中，CsAP1-1和 CsAP1-2基因均表达。唯一不同之处在于，在花发育成熟期，CsAP1-1在外珠被也有表达，而CsAP1-2在外珠被处没有表达，而只在内珠被处表达。这一结果反映了基因重复事件发生后，两个基因在功能上也有了一些分化。 3. B类基因功能的保守性和多样性 通过转基因实验和蛋白质相互作用研究对B类基因的功能和作用方式进行了研究，得到以下结果：1）金粟兰CsAP3基因的C末端的点突变所造成的paleoAP3基元的部分缺失对该基因的功能没有决定性的影响;2）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3所编码蛋白的C末端以及paleoAP3基元，与拟南芥euAP3型基因AtAP3所编码蛋白的C末端以及euAP3基元没有功能上的不同;3）金粟兰paleoAP3型基因CsAP3与拟南芥euAP3型基因AtAP3 的主要功能存在一定差异，前者主要参与雄蕊形成，而后者既参与雄蕊的形成也参与花瓣的形成; 4）CsPI基因所编码的蛋白可以与AP3类蛋白相互作用进而影响花瓣的形成，因此该基因在功能上是保守的。 4. 金粟兰CsAG1基因的序列结构和功能分析 通过序列结构分析发现，CsAG1属于C类基因，具有保守的AG I基元和AG II基元。过量表达实验分析表明CsAG1的功能与A类基因的功能是相拮抗的。 5. 各类MADS-domain蛋白间的相互作用 在前面工作的基础上，我们首次对金粟兰中各类MADS-domain蛋白间的作用方式进行了研究。酵母双杂交结果表明：1）C末端的完整性对于MADS-domain蛋白二聚体的形成没有影响; 2）去掉M区的CsAP3蛋白与CsPI蛋白都能够形成异源二聚体，同时它们又可以各自形成同源二聚体; 3）E类蛋白既可以和A类或C类基因产物相互作用，也可以同AP3和PI型蛋白相互作用，充分体现了E类基因产物作用式样的保守性; 4）金粟兰中，FUL-like型基因所编码的蛋白CsAP1-1与CsSEP3和CsAG1也能形成异源二聚体，这与核心真双子叶植物的euFUL型蛋白在作用式样上是非常相似的。然而，金粟兰CsAP1-1蛋白不能形成同源二聚体。 综合以上结果发现，在无花被的金粟兰中，仍然存在着A、B、C/D、E类花发育相关的基因。这些基因的功能与核心真双子叶植物中同类基因的相比，有些是保守的，比如CsPI基因可以参与花被的形成;但也有一些是不同的，比如CsAP3基因主要参与雄蕊形成而非花被形成过程。由此可以看出被子植物花器官的发育是一个非常复杂的调控过程，不同植物中的调控机理及进化历程可能是不同的。

几种作物非叶器官结构和功能的研究

本论文以小麦、水稻等几种重要经济作物为材料，应用透射电镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜以及氧电极，低温荧光等生理技术手段，对作物非叶器官的结构和主要生理特性进行了较全面和系统的研究。其中，比较分析了非叶器官叶绿体超微结构的差异，测量了非叶器官的放氧和低温荧光等生理指标，尝试从结构与功能相结合的角度，探讨非叶器官在提高作物产量中所起的重要作用。 首先以不同品种的小麦为实验材料，对其主要非叶器官－茎秆，从解剖结构、木质素含量、以及抗倒伏的力学特性等方面做了详细的比较研究。结果表明：高产小麦品种茎秆的秆壁厚度、茎截面积、机械组织厚度及细胞层数、维管束与其韧皮部的截面积等，均明显优于一般小麦品种。在茎秆薄壁组织细胞、机械组织细胞（厚壁组织细胞）和维管束的木质素含量上，高产品种也显著高于对照品种。另外，通过分析证明，小麦植株抗倒伏的能力与其茎秆高度、直径和髓腔直径等均有密切关系。因此，在超高产小麦品种的选育上，重视外源基因的引进，改进茎秆的结构特性及提高其木质素含量，可能是一个重要的选育方向。 气孔是植物器官吸收CO2 和放出O2 的主要通道，对光合作用的强弱有着决定性的作用。因此，对非叶器官表面气孔的研究显得尤为重要。通过对几种作物非叶器官气孔频度、气孔大小和气孔指数的研究，结果发现，非叶器官的气孔频度均较对应功能叶低;而气孔大小和气孔指数则变化较大。另外，本文还着重讨论了非叶器官气孔频度对作物光合作用的影响，并提出了在非叶器官中可能存在与此相适应的未知的光合类型 叶绿体是作物进行光合作用的场所，通过对小麦、水稻非叶器官及功能叶叶绿体超微结构的比较研究，发现非叶器官单个光合细胞中叶绿体的数量较少，体积也较小。其中小麦芒和颖片有发育较好的叶绿体结构，其基粒数可达普通叶的水平，但比旗叶少;外稃和穗轴都有完整的基粒跺叠，只是跺叠的数量较少;而内稃基粒少，基粒内囊体跺叠不整齐。随着小麦芒的衰老过程，其中叶绿体的数量也随之减少，并且这种减少的趋势在旗叶中先发生。非叶器官中叶绿体超微结构的这种变化和差异，暗示着非叶器官可能在作物的不同发育时期，对籽粒有重要作用。 通过对非叶器官和功能叶光合特性的比较研究，发现不同种作物非叶器官具有与功能叶不同的光合特性。在436nm 激发光下，非叶器官的F686／F734 明显高于旗叶;若以放氧为标准，比较功能叶和非叶器官的光合活性，发现以叶绿素为单位，非叶器官的放氧速率与旗叶相当，或甚至高于旗叶;以单穗为单位，最高可相当于旗叶的28％。另外，比较不同发育时期芒和旗叶的放氧速率，发现芒在作物的衰老后期，仍保持较高的光合活性。

太行花TrMADS3基因的结构、功能和进化研究

休眠是温带多年生植物的特性之一。为了适应温带地区寒冷的冬季，多年生植物的分生组织通常在秋末冬初进入休眠状态，这样有利于它们在低温下的存活。因此，温带多年生植物的生长和开花具有季节性。植物的生长发育需要与季节的交替变化同步，才能适应环境，保证繁殖成功。多年生植物通过“生长－休眠－生长”的循环过程适应温带地区寒冷的冬季。休眠既有利于植物存活又可调节开花时间。因此，探索温带多年生植物休眠过程的分子调控机理具有重要的应用价值。 太行花（Taihangia rupestris）是蔷薇科仙女木族的一种多年生草本。它生长在海拔1000到1200米的温带山区。太行花需要两个生长季节才能开花，这一点与模式植物拟南芥、水稻不同。在第一个生长季节花芽诱导，花序发育到秋末冬初时进入休眠状态;过冬花序包裹在叶柄基部，接近土壤表面;到了第二个生长季节，花进一步发育完全，开花结果。休眠过程对太行花花序的存活以及来年的开花时间控制非常关键，对这个过程的调控基因的研究不仅有助于理解太行花休眠的分子机制，还将为其它经济植物在这个方面的研究提供资料。 本研究以太行花为研究材料，从它的过冬花序中分离得到了一个MADS-box基因，分析了它的序列结构、系统发育关系、表达式样和功能，探讨了FLC亚家族基因在太行花这种多年生植物和一年生、两年生植物之间发生的表达功能分化。主要研究结果包括： 1. 从太行花的过冬花序中分离出了TrMADS3基因。氨基酸序列分析结果表明它是MIKCc型MADS-box基因，系统发育分析结果表明TrMADS3与FLC类基因聚在一起。 2. 实时定量PCR和RT-PCR实验显示TrMADS3在冬季休眠期太行花的花序、根、叶中广泛表达。从十月底到一月底的冬季低温期户外太行花植株中TrMADS3表达量比同期温室植株的表达量高，也比夏季户外植株的表达量高。对温室植株进行低温处理能明显上调TrMADS3的表达量，而短光照、干旱、高盐和脱落酸（ABA）处理对TrMADS3的表达影响不明显。 3. 用原位杂交的方法分析了TrMADS3的表达式样。营养器官中，TrMADS3在营养顶端分生组织、叶原基、幼叶边缘细胞中表达量高;生殖器官中，TrMADS3在侧生分生组织、花序原基、花原基、幼苞片、萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、心皮原基、发育中的雄蕊、心皮中表达量高。TrMADS3的表达模式反映了TrMADS3调控营养生长和不同阶段的花序、花发育过程。 4. TrMADS3在拟南芥中异位表达不影响拟南芥开花时间。在高盐和干旱胁迫条件下，TrMADS3异位表达能够明显提高转基因拟南芥后熟种子的萌发率。 5. 建立了太行花的组培体系。 综上所述，TrMADS3属于FLC进化支，这一亚家族基因还未在多年生植物中报道。TrMADS3在太行花休眠期表达量很高。在实验控制条件下，一至两周低温能够明显促进TrMADS3表达量的上调。低温处理后回到生长温度的太行花在一月内依然保持较高的TrMADS3的表达。原位杂交实验显示TrMADS3在营养和生殖分生组织中表达量高。TrMADS3在拟南芥中异位表达促进后熟种子在高盐和干旱胁迫下萌发。因此，我们推测TrMADS3具有响应低温调节太行花休眠期营养和生殖分生组织活性的功能。在一、二年生植物中分离的FLC-like基因响应春化作用，具有抑制花芽诱导的保守功能，这些基因在营养器官中表达，受春化作用调节，对应一、二年生植物的成花诱导受春化作用促进的过程，但TrMADS3在太行花营养和生殖器官中均表达，对应太行花花芽诱导后营养和生殖器官均进入休眠状态的生理特性，因此，我们推测FLC-like基因有可能在太行花这种温带多年生植物和一、二年生植物之间发生功能分化。

辽河三角洲植被结构、功能及其驱动机制

辽河三角洲优越的植被生态系统维系着多种生态功能，使该地区成为全国著名的商品粮基地、造纸原料基地和旅游基地。但是，气候变化和人为干扰使得辽河三角洲的植被结构发生了显著变化，影响到植被功能的发挥。 为了应对气候变化和人为干扰对辽河三角洲植被造成的不利影响，本论文围绕植被结构和生产功能，从空间和时间方面，重点阐述了辽河三角洲植被的结构及其驱动机制；辽河三角洲植被生产功能及其驱动机制。 采用的研究方法包括遥感解译、样带调查和全面调查。通过遥感解译方法获取各植被类型的面积、分布及其变化信息，以研究植被的空间分布格局及其变化。通过样带调查方法，获取植被类型、土壤和水文等信息，并结合规范对应分析和偏相关分析等，研究植被空间分布格局的驱动机制。通过全面调查方法，获取植被净第一性生产力、粮食产量、土壤和水文等信息，并结合地理信息系统(GIS)的插值分析和相关分析等，研究植被生产功能的空间分布格局及其驱动机制。主要结论如下： 1. 植被组成和空间格局：辽河三角洲植被主要由自然湿地植被、人工湿地植被、自然旱地植被、人工旱地植被四大植被类型组成。其中，面积最大的3种植被是玉米、水稻和芦苇。四大植被类型以双台子河口为中心，基本上呈现半环状分布格局。 2. 植被空间格局变化：1988～2006年辽河三角洲植被空间格局发生了显著变化，主要植被类型分布趋于集中，形成了一些较大的斑块，而不是离散和破碎。从面积上看，水稻是面积增加最多的植被类型；玉米是面积减少最多的植被类型。从变化速率看，水稻、玉米和芦苇的变化幅度都较大，分别为33.2%、-16.1%和-23.2% 。 3. 植被空间格局形成机制：辽河三角洲植被分布格局不是由气候因子决定的，而是由土壤因子决定。土壤可溶性盐是决定植被分布格局最重要的环境因子，其次是土壤含水量。 4. 植被生产功能：辽河三角洲植被具有极高的生产力。其中，玉米、水稻和芦苇3种主要植被的地上净第一性生产力分别为30,485、18,248和17,440 kg/(ha•a)。玉米和水稻单位面积粮食产量也非常高，分别为14,813和10,365 kg/(ha•a)。 5. 植被生产功能年际变化：辽河三角洲植被生产力存在明显的年际波动。1992～2005 年间玉米和水稻粮食产量呈现显著的年际波动；1949～1990 年间芦苇产量不仅存在较明显的年际波动，而且呈现非常显著的增加趋势。 6. 植被生产功能年际变化的驱动机制：气候因子是玉米和水稻粮食产量年际变化的主要驱动因子，气候因子对玉米和水稻粮食产量的影响远远大于人为因子（农业人口、施肥量、灌溉面积）的影响。气候因子和人为因子对芦苇产量年际变化的影响都非常显著。在气候因子中，年日照数是驱动玉米产量年际波动的主导气候因子；年降水量是驱动水稻产量年际波动的主导气候因子；年蒸发量是驱动芦苇产量年际波动的主导气候因子。 7. 植被生产功能空间格局：植被地上净第一性生产力存在显著的空间差异，表现为一种环形空间分布格局，三角洲中部较低，四周地区较高。这种空间分布格局表明，在辽河三角洲，植被地上净第一性生产力最高的不是湿地植被，而是周围旱地植被。 8. 植被生产功能空间格局的形成机制：土壤含水量和海拔是驱动辽河三角洲植被生产力空间格局的主要因子；土壤盐度、土壤pH和土壤容重对植被生产力的空间格局影响不大。土壤营养元素(氮、磷、钾) 对植被生产力的空间格局几乎没有影响。

高等植物光系统II捕光天线结构与功能的研究

高等植物光系统II的捕光天线蛋白（LHC II）在光能的吸收、传递和调节激发能在两个光系统之间的分配以及维持类囊体膜的垛叠等方面都起着重要的作用，因而得到了广泛的研究。目前普遍认为LHC II在植物体内是以三聚体的形式存在并行使功能的，但也有研究者发现了单体和寡聚体等多种形式的LHC II。本论文以菠菜为研究对象，采用改进的方法从类囊体膜中提取纯化了LHC II三聚体，对膜脂和色素在三聚体形成和蛋白空间结构中的影响，以及不同聚集态LHC II组成、结构和功能的差异进行了较系统的研究。此外，还将Lhcb2基因反向插入到烟草中，利用转基因植物来研究其生理功能。获得了如下结果： 1，采用改进的方法从菠菜类囊体膜中分离纯化了LHC II。与改进前比，其流程可以缩短2小时且产率也有明显的提高。SDS变性电泳和Triton X-100非变性电泳的检测结果表明，此样品纯度较高，是由三条分子量分别为29KD、28KD和26KD的多肽组成的异质三聚体。同时样品的吸收光谱和荧光光谱分析结果也与前人的报道一致。 2，分析了LHC II三聚体中的膜脂和脂肪酸组成及含量。与PSII相比，LHC II含有相同的四种膜脂：MGDG、DGDG、PG和SQDG。但LHC II中PG的含量是PSII的两倍，说明PSII中的PG主要富集在外周天线区域。同时PG中含有特异的反式十六碳一烯酸，且含量很高。用专一消化PG上Sn-2位脂肪酸链的磷脂酶A2（PLA2）处理LHC II三聚体，然后再加入PG重组的方法证明了含十六碳一烯酸的PG在三聚体结构的维持中起着至关重要的作用。去掉PG后， LHC II三聚体的结构受到了影响，部分解聚成了单体，同时其光谱特性也发生了变化，表现为叶绿素b分子的吸收峰及其激发的荧光发射峰都明显下降。回加PG则可使解聚的单体又重新聚集成三聚体。 3，分别用电洗脱和蔗糖密度梯度离心两种方法分离了LHC II三聚体、二聚体和单体。两者比较，电洗脱对样品的破坏较大，而蔗糖密度梯度离心更加温和，对蛋白上结合的色素影响不大。系统研究了不同聚集态LHC II的组成和光谱特性后发现，三种聚集态的LHC II有相同的多肽组成，并且都结合着5种色素，但是色素的含量差异较大。二聚体和单体中，叶绿素b和类胡萝卜素分子的含量比三聚体的低很多，此外，单体叶绿素a分子的含量也明显减少。对三种聚集态LHC II的各种光谱特性进行分析的结果表明，由于叶绿素b和类胡萝卜素分子含量较少，二聚体和单体中叶绿素b和类胡萝卜素的吸收均有所下降，而且从类胡萝卜素到叶绿素b以及从叶绿素b到叶绿素a的能量传递效率都低于LHC II三聚体，总体表现为三聚体 > 二聚体 > 单体。此外，不同单体之间叶绿素a到叶绿素a的能量传递也被破坏。推测三种聚集态LHC II在吸能、传能和结构上的差异，可能是植物适应不同外界环境的一种调控机制。 4，模拟体内过程，在体外将大肠杆菌中表达的Lhcb2蛋白和色素进行重组，以此来研究色素与蛋白组装过程中蛋白二级结构和色素结合状态的变化。结果表明色素在脱辅基蛋白的体外重折叠中至关重要。在与色素重组的过程中，蛋白二级结构中-螺旋含量逐渐上升并最终接近天然水平，而无规卷曲逐渐减少。从光谱的变化可以看出，色素分子与蛋白的结合经历了一个由无序到有序的过程，色素蛋白复合物的光谱信号由弱变强，重组得到的样品与天然LHC II十分相似。 5，为了更好地研究LHC II异质三聚体中单体可能具有的独特生理功能，建立了Lhcb2基因的反义抑制植物表达载体pBI-antiLhcb2，用根癌农杆菌介导法转化烟草，获得了转基因植株。酶切和PCR鉴定证明，Lhcb2基因已经成功地插入到烟草里。进一步的分子鉴定和生理生化功能分析还在进行中。

Cloning of bradykinin precursor cDNAs from skin of Bombina maxima reveals novel bombinakinin M antagonists and a bradykinin potential peptide

Bombinakinin M (DLPKINRKGP-bradykinin) is a bradykinin-related peptide purified from skin secretions of the frog Bombina maxima. As previously reported, its biosynthesis is characterized by a tandem repeats with various copy numbers of the peptide and sometimes co-expressed with other structure-function distinguishable peptides. At present study, two novel cDNAs encoding bombinakinin M and its variants were cloned from a cDNA library from the skin of the frog. The encoded two precursor proteins are common in that each contains three repeats of a novel 16-amino acid peptide unit and one copy of kinestatin at their N- and C-terminal parts, respectively. They differ in that the first precursor contains two copies of bombinakinin M and the second one contains one copy of a novel bombinakinin M variant. Bombinakinin M was found to elicit concentration-dependent contractile effects on guinea pig ileum, with an EC50 value of 4 nM that is four times higher than that of bradykinin (1 nM). Interestingly, the synthetic peptide (DYTIRTRLH-amide), as deduced from the 16-amino acid peptide repeats in the newly cloned cDNAs, possessed weak inhibitory activity on the contractile effects of bombinakinin M, but not on that of bradykinin. Furthermore, the newly identified bombinakinin M variant (DLSKMSFLHG-Ile(1)-bradykinin), did not show contractile activity on guinea pig ileum, but showed potentiation effect on the myotropic activity of bradykinin. In a molar raito of 1:58, it augmented the activity of bradykinin up to two-fold. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

Composition and evolution of the V2r vorneronasal receptor gene repertoire in mice and rats

Pheromones are chemicals produced and detected by conspecifics to elicit social/sexual physiological and behavioral responses, and they are perceived primarily by the vomeronasal organ (VNO) in terrestrial vertebrates. Two large superfamilies of G protein-coupled receptors, V1rs and V2rs, have been identified as pheromone receptors in vomeronasal sensory neurons. Based on a computational analysis of the mouse and rat genome sequences, we report the first global draft of the V2r gene repertoire, composed of similar to 200 genes and pseudogenes. Rodent V2rs are subject to rapid gene births/deaths and accelerated amino acid substitutions, likely reflecting the species-specific nature of pheromones. Vertebrate V2rs appear to have originated twice prior to the emergence of the VNO in ancestral tetrapods, explaining seemingly inconsistent observations among different V2rs. The identification of the entire V2r repertoire opens the door to genomic-level studies of the structure, function, and evolution of this diverse group of sensory receptors. (c) 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.

Motilin and ghrelin gene experienced episodic evolution during primitive placental mammal evolution

Motilin and ghrelin, members of a structure-function-related hormone family, play important roles in gastrointestinal function, regulation of energy homeostasis and growth hormone secretion. We observed episodic evolution in both of their prehormone gene sequences during primitive placental mammal evolution, during which most of the nonsynonymous changes result in radical substitution. Of note, a functional obestatin hormone might have only originated after this episodic evolution event. Early in placental mammal evolution, a series of biology complexities evolved. At the same time the motilin and ghrelin prehormone genes, which play important roles in several of these processes, experienced episodic evolution with dramatic changes in their coding sequences. These observations suggest that some of the lineage-specific physiological adaptations are due to episodic evolution of the motilin and ghrelin genes.

Two-component model for the interstellar scattering in direction to the Vela pulsar

This paper discusses a rigorous treatment of the refractive scintillation of pulsar PSR B0833-45 caused by a two-component interstellar scattering medium. It is assumed that the interstellar scattering medium is composed of a thin screen ISM and an extended interstellar medium. We consider that the scattering of the thin screen concentrates in a thin layer presented by a delta function distribution and that the scattering density of the extended irregular medium satisfies the Gaussian distribution. We investigate and develop equations for the flux density structure function corresponding to this two-component ISM geometry in the scattering density distribution and compare our result with that of the Vela pulsar observations. We conclude that the refractive scintillation caused by this two-component ISM scattering gives a more satisfactory explanation for the observed flux density variation of the Vela pulsar than does the single extended medium model. The level of refractive scintillation is strongly sensitive to the distribution of scattering material along the line of sight. The logarithmic slope of the structure function is sensitive to thin screen location and is relatively insensitive to the scattering strength of the thin screen medium. Therefore, the proposed model can be applied to interpret the structure function of flux density observed in pulsar PSR B0833-45. The result suggests that the medium consists of a discontinuous distribution of plasma turbulence embedded in the Vela supernova remnant. Thus our work provides some insight into the distribution of the scattering along the line of sight to the Vela pulsar.

三种两栖类动物皮肤和脑中活性多肽结构、功能与多样性分析

两栖动物是最原始的陆生脊椎动物，分布比较广泛。无尾目两栖动物现有3000 多种，它们皮肤裸露、光滑，为适应广泛的栖息地和生态条件，已进化出各种有效的皮肤防御系统。抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs）作为两栖类先天防御系统的重要组成部分，在皮肤分泌液中含量异常丰富。我们以来源于云南省普洱市景东县的铃蟾科微蹼铃蟾（Bombina microdeladigitora）和楚雄州双柏县雨蛙科华西雨蛙（Hyla annectans）为实验材料，对其皮肤分泌液中抗菌肽的分子多样性并对其结构和功能进行研究。微蹼铃蟾皮肤抗菌肽多样性非常丰富，我们从单一个体中克隆得到了64 条编码不同抗菌肽的cDNA 序列，其中有两条序列只编码Maximin 一种抗菌肽，其余 62 条均编码Maximin 和Maximin H 两类抗菌肽。这64 条cDNA 序列共编码44 种Maximins 和30 种Maximin Hs，其中有32 种Maximins 和20 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽，其余和铃蟾属其它种中发现的抗菌肽具有相同的序列。除了皮肤外，两栖动物的脑也是抗菌肽的丰富资源库。我们分别从微蹼铃蟾和大蹼铃蟾（B. maxima）脑中得到了大量新的抗菌肽cDNA 序列。其中从微蹼铃蟾脑中克隆到21 条新的cDNA序列，共编码16 种Maximins 和10 种Maximin Hs，其中7 种Maximins 和4 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽。从大蹼铃蟾脑中克隆到39 条新的cDNA 序列，编码27 种Maximins 和20 种Maximin Hs，其中16 种 Maximins 和12 种Maximin Hs 为新鉴定的抗菌肽。在以上新鉴定的抗菌肽中，Maximins 均为阳离子抗菌肽，Maximin Hs 中除以前鉴定的Maximin H5 外，尚有十余种阴离子抗菌肽。抗菌肽碱基转换/颠换（R=s/v）分析表明，RMaximin<1 而RMaximin H>1，说明这两种抗菌肽碱基转换和颠换发生的几率并不相同，Maximin 间差异主要由碱基颠换引起，而Maximin H 则主要由碱基转换引起。种间进化分析表明，大蹼铃蟾和微蹼铃蟾的遗传距离较近，而它们与欧洲花铃蟾（B. variegata）的遗传距离均较远。种内各部分遗传距离差异较大。与信号肽和酸性间隔肽相比，成熟肽的遗传距离明显增大，其中Maximin 的进化速度比Maximin H 更快。抗菌肽Maximin 和Maximin H 种内、种间均存在正选择（ω>1），而信号肽和酸性间隔肽在分化过程中没有正选择（ω<1），说明Maximin 和Maximin H 经受着达尔文正选择驱动的快速进化，是抗菌肽多样性产生的根本原因。这与抗菌肽参与最终的生物防御功能，从而增加物种对环境的适应是一致的。功能研究发现，有些微蹼铃蟾Maximins 抗菌肽是多功能分子，不但对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌起抗菌作用，而且还具有很强的抗氧化功能。脑中抗菌肽基因的大量表达也预示着抗菌肽可能在神经信号传导中起一定作用。用基因克隆方法我们从微蹼铃蟾皮肤得到大量缓激肽前体序列，由1-4 个拷贝的Bombinakinin 或1-4 个拷贝的Bombinakinin 和1 个拷贝的Bombinakinin-GAP 组成。这与大蹼铃蟾皮肤中缓激肽前体由1-8 个拷贝的Bombinakinin 或1-8 个拷贝的Bombinakinin 和1 个拷贝的Bombinakinin-GAP 组成有所不同。按同样方法，我们从大蹼铃蟾脑中也得到了三条缓激肽前体序列，其中两条含有6 个 Bombinakinin 拷贝，另一条含2 个Bombinakinin 拷贝。通过比较只含Bombinakinin 和同时含有Bombinakinin 和Bombinakinin-GAP 的前体cDNA 序列后发现， 前者序列中缺失了一段碱基序列TGCGGGTA， 从而导致移码突变， 终止了 Bombinakinin-GAP 的表达。通过生物化学的手段从微蹼铃蟾皮肤分泌液中分离到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂BMSI1，与铃蟾属其它种中的胰蛋白酶抑制剂具有很高的相似性。根据已有铃蟾属丝氨酸蛋白酶抑制剂cDNA 序列设计引物，以皮肤cDNA 为模板，扩增丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因序列，结果得到两条不同的序列。这两条前体序列与铃蟾属其它两栖动物皮肤中的丝氨酸蛋白酶抑制剂具有高度相似性（>70%），而且它们都含有10 个半胱氨酸残基。BMSI1 对五种丝氨酸蛋白水解发色底物的抑制活性测定表明，BMSI 1 能抑制胰蛋白酶和凝血酶的水解活性，其K(i)分别为0.02 μM 和0.15 μM。通过随机筛选cDNA 文库的方法，我们从大蹼铃蟾脑中得到了一条完整的 Somatostatin（SST）序列，根据该序列，我们在大蹼铃蟾和微蹼铃蟾脑cDNA 文库中筛选到两条变异体序列SST-L(Leu11-SST-14)和SST-R(Arg14-SST-14)。功能研究表明，这两种变异体具有和SST 相似的生物学功能，可抑制肿瘤细胞增殖、抑制细胞因子释放以及具有一定的镇痛作用。从大蹼铃蟾和微蹼铃蟾脑中得到了阿片肽前体POMC 和Proenkephalin 的 cDNA 序列，序列比对发现与东方铃蟾具有较高的同源性。从华西雨蛙皮肤cDNA 中克隆得到两类活性多肽，命名为Annins。其中一类为抗菌肽类似肽，共11 条序列，编码单一的成熟肽序列，其信号肽与雨蛙科信号肽具有很高的同源性，但酸性间隔肽和成熟肽相差较大。其成熟肽由15-17 个氨基酸残基组成，活性分析表明无抗菌和抗氧化作用，但在较高浓度时对部分细菌和多种细胞有促进生长作用，推测可能在使伤口快速愈合方面起重要作用；另一类编码具有2 个拷贝的成熟肽序列，成熟肽由5 个氨基酸残基组成，具有一定的镇痛活性，其镇痛机理可能是拮抗bradykinin 作用。

金环蛇抗菌肽cathelicidin-BF的纯化、基因克隆、结构与功能分析及抗菌机理研究

Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，Cathelicidins是动物体内一个具有多功能的抗菌肽家族，目前仅在哺乳类、鸟类、爬行类和鱼类中有发现。Cathelicidins具有广谱的抗微生物活性，不但对普通革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌以及病毒具有非常强的活性，而且对许多临床耐药微生物同样具有作用。除此之外，cathelicidins具有许多其他生物学活性，如对多种免疫细胞具有趋化作用、诱导肥大细胞脱粒和组织胺释放、调节巨噬细胞转录、促进伤口愈合、诱导血管发生、诱导变异细胞系细胞凋亡和淋巴细胞活化等。 金环蛇（Bungarus fasciatus）属于眼镜蛇科（Elapinae）环蛇属（Bungarus），是一种具有前沟牙的毒蛇，广泛分布于我国广东、广西、福建、江西、海南及云南南部。 在本论文中，我们对金环蛇体内cathelicidins家族抗菌肽cathelicidin-BF进行了一系列研究。 通过凝胶过滤、阳离子交换和反相高压液相三步从金环蛇蛇毒冻干粉中分离纯化得到金环蛇cathelicidins家族抗菌肽，命名为cathelicidin-BF。Edman降解法测定其氨基酸序列为KFFRKLKKSVKKRAKEFFKKPRVIGVSIPF，由30个氨基酸残基组成，ESI-MS测得其分子量为3637.5 Da。 构建了金环蛇毒腺cDNA文库，从中克隆得到了编码cathelicidin-BF前体的cDNA序列。该cDNA序列长度为750 bp，由此推断出的cathelicidin-BF前体由191个氨基酸残基组成，包括信号肽区、保守的cathelin区和成熟肽区三部分。用RT-PCR的方法对cathelicidin-BF的组织表达情况进行了研究，结果表明cathelicidin-BF在金环蛇胃、气管、皮肤、肌肉、心脏、肾脏、肺、脑、小肠、脾脏、肝脏、卵巢、毒腺中均有表达，但各组织表达量存在差异。进化分析表明，金环蛇cathelicidin-BF与鸭嘴兽CATH-3在系统进化树中独立成簇，表明金环蛇与鸭嘴兽有着一定的亲缘关系，这为鸭嘴兽在动物进化中分类地位的确定提供了参考资料。 对cathelicidin-BF可能具有的各种生物学活性进行了研究。Cathelicidin-BF具有广谱的抗微生物活性，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和真菌均有活性，其中包括大量临床分离耐药菌株。Cathelicidin-BF对革兰氏阴性细菌的活性要强于革兰氏阳性细菌，此外对白色念珠菌、毕赤酵母和一些腐生性真菌也具有活性。Cathelicidin-BF的抗氧化活性、溶血活性、凝集素活性、丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂活性、细胞毒性、抗肿瘤活性均不明显。Cathelicidin-BF具有很强的肥大细胞脱颗粒活性。以上结果表明cathelicidin-BF在金环蛇抵御外界病原微生物侵袭的先天免疫反应中可能发挥了重要作用。 利用多种实验方法对cathelicidin-BF的结构和抗菌机理进行了研究。CD和NMR的实验结果表明，在亲水环境中，cathelicidin-BF为无规卷曲的构象；在疏水或模拟细菌细胞质膜的环境中，cathelicidin-BF的N-末端区域具有典型的两亲性α-螺旋构象。杀菌动力学实验结果表明，cathelicidin-BF杀菌作用极其迅速，在浓度大于1×MIC时，在1 min内即可杀死所有细菌，且其杀菌作用是致死性的。扫描电镜结果表明，经过cathelicidin-BF处理的细菌细胞形状发生明显改变，细胞膨胀变形，表面出现大量囊泡状结构。大量细菌细胞破裂溶解，内容物外泄。综合以上结果我们推测：cathelicidin-BF在亲水的环境中为无规卷曲的结构，当通过静电相互作用吸附到细菌细胞质膜上后，由于环境疏水性的增加其N-端转变为两亲性的α-螺旋构象。Cathelicidin-BF的疏水侧插入到细菌细胞质膜内部，亲水侧暴露于细菌细胞质膜表面。随着结合到细菌细胞质膜上的cathelicidin-BF分子不断增加，细菌细胞质膜内陷，最终在细菌细胞质膜上形成孔洞。细菌细胞内容物大量外流，最终导致细菌细胞的死亡。 通过体外和体内多个实验对cathelicidin-BF进行了初步的药理学和药效学研究。Cathelicidin-BF在血清中稳定性较差，容易被血清中各种蛋白酶降解。一定浓度的盐离子能够增强cathelicidin-BF的抗菌活性。动物模型实验表明，cathelicidin-BF对多种细菌引起的小鼠皮肤感染具有很好的治疗效果。Cathelicidin-BF本身所具有的特点及动物模型实验中表现出的极佳的治疗效果使其成为外用抗菌药物开发的优良模板。

川牛膝多糖的免疫活性及其水解活性片段分离研究

川牛膝多糖（CP）是从传统中药川牛膝（Cyathula officinalis Kuan）中提取的一种活性多糖，现代药理研究表明川牛膝多糖是川牛膝许多生物活性的物质基础。本实验室前期进行了川牛膝多糖的提取、分离、结构鉴定及其部分活性研究，发现川牛膝中多糖含量非常高，在对川牛膝多糖活性的初步研究中也证实了其具有免疫调节作用。我们为了进一步了解其免疫调节活性，并为构效关系的研究奠定基础，对其进行了如下研究： 1． 通过体外毒性检测、淋巴细胞增殖实验、NK细胞杀伤活性和腹腔巨噬细胞吞噬中性红活性测定，发现川牛膝多糖在10～300μg/mL浓度范围内，对细胞无毒性作用；能够促进LPS诱导的B淋巴细胞增殖(P<0.01)、增强NK细胞杀伤活性(P<0.05)和PMΦ吞噬中性红活性(P<0.01)，且随多糖浓度增高而增强；但其对ConA诱导的T淋巴细胞的增殖无促进作用(P>0.05)。 2． 通过正常小鼠体内淋巴细胞转化实验、迟发型变态反应分析、抗体生成细胞检测、碳粒廓清检测、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活性和NK细胞活性测定，发现川牛膝多糖在适应性免疫方面能够促进SRBC免疫小鼠体内的抗体生成细胞的生成（P<0.01）和增强DNFB诱导的DTH（P<0.05），但对ConA诱导的脾淋巴细胞增殖无促进作用（P>0.05）；在固有免疫方面能够提高小鼠碳粒廓清速率（P<0.05），PMΦ吞噬 CRBC 活性（P<0.01）和NK细胞杀伤活性（P<0.05）。同时还发现其对由环磷酰胺(Cy)引起的白细胞数下降具有很好的抑制作用（P<0.01）。 3． 为了获得结构明确、均一的保留活性的川牛膝多糖片段，为其作用机制、构效关系研究提供关键研究材料，我们开展了“保留免疫活性的最小片段”的分离制备的初步研究。建立并优化了川牛膝多糖的酸水解条件，发现在6%的样品浓度，0.025mol/L的硫酸浓度，65℃的水解温度，水解时间为8min的条件下可以得到一系列连续的多糖片段；采用Bio-Gel P2 分子筛柱层析分离得到5个级分，通过体外淋巴细胞增殖实验、NK细胞活性测定、腹腔巨噬细胞吞噬中性红实验发现其中的一个片段仍保留较强的免疫活性，并测得其分子量约为2057Da，为保留免疫活性的最小片段的进一步分离奠定了基础。 Cyathula officinalis Kuan is a commonly-used Traditional Chinese Medicine (TCM) with a wide range of pharmacological activities. Modern pharmacological researches showed the polysaccharide extracted from it (CP) is an important component for many bioactivities of this TCM. In the previous studies, we found CP showed significant immuno-regulative activities. In order to evaluate this activity systematically and lay foundations for revealling its immuno-regulative machanisms and the Structure -Function relationship, we carried out the following research works: 1． The in vitro immunoactivities of CP were evaluated by using normal mice immunocytes with respects to cytotoxicity, lymphocytes proliferation, NK activity and the ability of peritoneal macrophage phagocytizing neutral red. The polysaccharide showed no cytotoxicity below the concentration of 300 μg/mL, and could promote B lymphocytes proliferation (P<0.01), enhance NK activity (P<0.05) and the ability of peritoneal macrophage phagocytizing neutral red (P<0.01) at the concentration of 10-300 μg/mL. The above effects were positively correlated with the concentration of the polysaccharides. But it could not promote T lymphocytes proliferation (P>0.05). 2． The in vivo immunoactivities of CP were observed on normal mice through the following indices: splenic lymphocyte transformation efficiency, delayed-type allergy, antibody-forming cells activity (AFC), rate of carbon clearance, rate of peritoneal macrophage phagocytizing chicken red blood cell (CRBC) and NK activity, and its influence on the decline of the mouse leucocyte count induced by Cy. The polysaccharide at medium-dose enhanced delayed-type allergy （P<0.05）and NK activity（P<0.05） and increased the rate of carbon clearance（P<0.05）, AFC activity（P<0.01） and the rate of peritoneal macrophage phagocytizing CRBC（P<0.01）. The polysaccharides also effectively resisted the decline of the mouse leucocyte count induced by Cy（P<0.01）. However, it couldn’t increase the splenic lymphocyte transformation efficiency（P>0.05）. 3． Attempting to isolate and prepare the minimal fragments retaining activity with identical structure for further studying on immuno-regulative mechanism and Structure-Function relationship, we carried out the study on hydrolysis of CP, isolation of hydrolysed fragments, and the activity evaluation of the isolated fragments. CP with concentration of 6% was hydrolysed at 65℃ for 8 min with sulfuric acid of 0.025 mol/L，then the hydrolysate was separated using Bio-Gel P2 chromatography, 5 portions of fragments were obtained. The immunoactivities of these fragments were evaluated by using normal mice immunocytes with respect to lymphocytes proliferation, NK activity and ability of peritoneal macrophage phagocytizing neutral red. One fragment with relative molecular mass of 2057Da was found retaining immunoactivity.

土壤剖面营养元素运移的模拟研究及其装置

简要论述了土壤营养元素运移、循环研究的概况与主要研究内容 ,介绍了土壤剖面养分运移模拟试验装置的构造功能与使用方法 ,并对这一研究的发展趋势作了分析

农业科技园区的战略定位与发展模式

本文论述了我国农业科技园区建设的战略定位及其结构功能 ,针对目前农业科技园区发展的现状 ,提出了新阶段农业科技园区的体系构建、战略选择与发展模式