薄膜内杂质分布的分形特征

薄膜中总会存在一些杂质或者缺陷，杂质和缺陷密度的有限性导致了薄膜破坏的概率性。提出了不同尺寸杂质和缺陷分布的分形特征，分析了薄膜破坏概率与辐照激光功率密度的关系，计算结果与实验结果吻合得很好。得到了一种确定薄膜中最具危害性杂质的热学特性及分布密度的方法。同时提出了杂质的敏感尺寸范围（SSR）的概念，由此得到材料激光损伤阈值的新的确定表达式，该表达式反映的损伤阈值与激光脉宽的关系更加符合实验结果。

我国煤核中的种子和大羽羊齿的初步研究

本论文为申请理学博士学位论文。文章以种子（胚珠）为线索，详细描述8种不同类型的种子。其中之一与叶，叶轴和含有原位花粉的花粉器官连接，因此作为整体化石植物描述。 七种脱落的种子分属不同的器官属。其中，五种是新发现的，它们是;—个新属种一太原类紫杉（Parataxospermum taiyuanense gen.et sp.now.);二个新种—小肥籽（pachytesta parva sp.nov)和小柄肉籽（Ssr-cospermum petiolulatum sp.nov.);一个比较种—瘦冠籽（Stephanospemum cf. akenioides);一个未定种—双籽（Diplotesta ap.)。此外，订正了二个种—薄角籽（Cornucarpus tenucupsis(Halle))和小心籽（Cardiocarpus(?)minor(wang)) 同其它器官连接的种子，作为整体植物定命为，原始隐羽羊齿（新属、种）（Cryptogigantonoclea primitivagen．et sp．nov．）并根据其叶和叶脉类型该属归到大羽羊齿目(Gigantonomiales (= Gigantopterjdaies)。 根据描述，文章对上述各种植物的分类和系统发育分别进行了讨论。在这些讨论中作者祥细地阐述了分类的依据，评价了各种有关的系统发育的观点•并提出了一些新的见解。 为了深入地进行研究，作者改进了一些旧的研究手段，采用了某些新的研究方法．其中包括：1)利用计算机技术进行三维重建，复原了原始隐羽羊齿的小羽片和大部分种子的形态，此外还有少数种子的内部结构也被复原：2）用分支系统分析和图论方法对肥籽属的系统发育进行了重新，探讨：3)把扫描电镜和光学显微镜结合起来观察大孢子膜和花粉的结构，过去这些结构通常需要采用的超薄切片和透射电镜才能观察;4)改用无毒溶剂进行快速撕片，以避免损害人体;5)初步探索了一套制作定厚连续切片的方法。此外，文章还就大羽羊齿的系统位置，种子的分类，华夏植物群和其它植物群的比较，以及某些新技术的优劣进行了讨论。论文原文为英文，全文约合36万印刷符号，附有四十幅图版。 此外还有三个附录： 1)插图8幅;2）表9个.3)同图论分析有关的计算公式，原始数据和许算机计算结果。为了得到连续的三雏形象，还有一组由计算机复原的隐羊齿种子的连续旋转图象。本节译由英文翻译而成，但有些部分按中文习惯作了增删。

稻属的分子系统学研究

稻属（Oryza L）属于禾本科的稻族，主要分布于世界的热带和亚热带地区。一般认为稻属包括20个左右的野生种和2个栽培种，我国有4-5种。迄今为止，对于稻属中种的数目和划分;稻属中所包括的种类是否为一单系类群;各基因组之闻的关系和起源以及稻属的起源等等，学术界仍然存有争议。本文评述了稻属分子系统学研究的进展，研究中存在的问题以及对未来稻属系统学研究的展望。针对稻属的分子系统学研究中所存在的问题，运用核糖体DNA转录间隔区序列测定、随机扩增多态性DNA（RAD）和SSR-anchoredPCR等分子生物学的手段对稻属中全部23个种的来自中国和世界不同地区的材料开展了分子系统学的研究。所得主要结果如下： 1．对产于中国的三种野生稻和栽培稻的二个亚种的核糖体DNA第一转录间隔区进行了序列测定。 DNA序列分别用PAUP程序进行分支分析和用MEGA程序中的UPGMA和Neighbor-joining进行聚类分析，结果表明核糖体DNA转录间隔区序列适合于进行稻属的分子系统学研究。 2．用荧光自动测序法和人工同位素测序法测定了稻属23个种和4个外类群的转录间隔区的序列。所有的DNA序列用Clustal V程序排阵后，再用PAUP程序进行分支分析。结果表明： A．稻属中的23个种组成四个主要分支，分别相当于Vaughan(1989)的四个种复合体。 B．所有AA基因组的种都在一个分支中。除了O.meridionalis与其它种的关系相对较远外，AA基因组种间有一定程度的分化，但不大。 C．尽管BB、BBCC、CC、CCDD和EE基因组的种都在一个分支中，但它们之间的分化是较为明显的。O.australiensis与该分支中的其它种的关系相对较远。以上两个分支的关系较为密切，它们组成一个自然类群，是稻属的核心部分。 D．O.ridleyi与O.longiglumis非常近缘，它们组成一个分支。 E．O.meyeriana与O．granulata有非常密切的关系。O.brachyantha与O.meyeriana近缘，而与AA基因组的关系较远。O,schlechter/与Leersia hexandra近缘，而与稻属中其它种的关系较远。作为外类群的Porteresia coarctata与稻属的a brachyantha非常近缘，这有可能说明将它作稻属中的一员的观点是正确的。 3．用RAPD和ISSR技术对稻属23介种的36份材料以及Porteresia coar ctata和Leersia hexandra各1份材料进行PCR扩增。16个10-mer RAPD随机引物共扩增出368个多态条带，5个锚定SSR引物共扩增出1 16个多态条带。RAPD和ISSR扩增出的多态条带合在同一数据矩阵中，用NTSYS-pc程序进行聚类分析。得出的结果与ITS序列分支分析的结果相似。 A.从表征图上亦可区分出四个群。所有的AA基因组的种聚在一起，O.nivara与O.rufipogon的关系密切，两个种的界限不清楚，所以认为它们是一个种：O.rufipogon.。 B.分布于中国的O.officinalis与O.minuta非常近缘，而菲律宾的四倍体O.officinalis则与同是基因组的O.eichingeri和O.rhizomatis关系密切。EE基因组的O.australiensis与Officinalis群保持一种松散的联系。 C。具FF基因组的O.brachyantha与O.schlechteri近缘，它们与Porteresiacoarctata和Leersia hexandra关系的密切程度要大于它们与稻属其它种的关系。 D。最后讨论了RAPD和ISSR用予植物属内的系统发育研究存在的问题。本研究结果说明RAPD和ISSR适合于进行属内近缘种亲缘关系的研究。

药用野生稻复合体（稻属）的分子系统发育与进化研究

稻属（Oryza L.）隶属于禾本科（Gramineae）Ehrhartoideae亚科的稻族（Oryzeae），包括两个栽培种（亚洲栽培稻O. sativa和非洲栽培稻O. glaberrima）和大约20多个野生种，广布于热带亚洲、非洲、大洋洲、中美洲和南美洲。药用野生稻复合体（O. officinalis complex）是稻属中最大、也是最复杂的一个复合体，共包括9个种，含有5种染色体组类型（B、C、BC、CD 和E）。作为栽培稻品质改良的重要基因库，药用野生稻复合体在稻属中具有重要的地位。但是，相似的形态和重叠的地理分布使部分物种的分类和鉴定一直较为困难;种内染色体组构成和倍性的不同更增加了分类鉴定的复杂性。这种情况阻碍了对这些野生稻遗传优势的有效利用。另外，由于物种间断分布和缺乏明确的二倍体亲本等原因，药用野生稻复合体内的异源多倍体起源一直存在争议。本文通过细胞核乙醇脱氢酶基因（Adh）和nrDNA的内转录间隔区（ITS）限制性片段长度多态性（RFLP）分析;叶绿体matK 基因、trnL 内含子和trnL-trnF 基因间隔区、核基因Adh和GPA1以及核糖体DNA ITS片段等序列比较的方法，对药用野生稻复合体中染色体组和物种的鉴定、种间系统发育关系，以及异源多倍体CCDD物种的起源和多倍体ITS的分子进化等进行了研究。主要研究结果如下： 1． 利用核Adh 基因限制性片段长度多态性，检测了来自国际水稻研究所基因库的64份药用野生稻复合体的样品。结果证明，所有O. rhizomatis样品都是含C染色体组的二倍体，所有O. minuta样品都是含BC 染色体组的四倍体。但是，种子库中鉴定为O. officinalis、O. punctata和O. eichingeri的样品中，同时都发现了含C染色体组的二倍体和含BC染色体组的四倍体。四倍体的O. officinalis只在印度分布，而且曾被描述为另一个种O. malampuzhaensis。 四倍体的O. punctata，也被一些学者称为O. schweinfurthiana，被发现和其二倍体一样分布广泛。值得注意的是，有两个曾被作为O. officinalis 四倍体的样品实际上是含有CD染色体组的物种O. latifolia。我们的结果增进了对国际水稻研究所种子库中部分野生稻样品染色体组构成的理解, 纠正了以往对药用野生稻复合体样品的错误鉴定，为今后进一步研究和利用这部分资源提供了种质编目的重要基础。 2． 对稻属中代表不同地理分布区的、含CD染色体组的11个样品（包括77个克隆）的ITS片段进行了测序。基于这些ITS序列的限制性片段长度多态性，提出一个快速而可靠的区分稻属CD 染色体组物种的方法。这个方法的具体步骤是：（1）利用通用引物扩增ITS 片段;（2）利用限制性内切酶FokI和/或DraⅢ消化PCR扩增产物;（3）用1%的琼脂糖胶电泳并根据消化产物的片段长度多态性来区分不同物种。 3． 利用包括两个叶绿体片段（matK和 trnL-trnF）、nrDNA内转录间隔区（ITS）和三个核基因（Adh1、Adh2和GPA1）的同源序列分析，探讨了药用野生稻复合体中二倍体物种和它们所代表的染色体组之间的系统发育关系。独立和合并的基因系统发育树都显示了一致的结果，即C染色体组和B染色体组的亲缘关系要比它们和E染色体组的近。三个含C染色体组的二倍体中，O. officinalis 和O. rhizomatis表现出较近的亲缘关系。值得注意的是，在O. eichingeri种内，尽管基于多基因的数据支持来自斯里兰卡的样品和来自非洲的样品聚成一个分支，但是较低的支持率表明, 两个地区的样品之间存在着较高的遗传分化。 4． 稻属中含CD染色体组的物种特产于拉丁美洲，包括O. alta、 O. grandiglumis 和O. latifolia。由于具有相同的染色体组类型、相似的形态特征和重叠的地理分布，这3个物种间的系统发育关系一直存在争论。另外，因为美洲大陆上没有含C和D染色体组的二倍体物种存在，对这些含CD染色体组物种的可能起源也有不同的假设被提出。使这个问题更具挑战性的是，尽管开展了世界范围的收集，至今仍没有找到含D 染色体组的二倍体物种。在本研究中，代表含C、CD和E染色体组以及含G染色体组的外类群共7个物种，共15份样品的2个叶绿体片段（matK和trnL-trnF）和3个核基因（Adh1，Adh2 和 GPA1）部分片段被测序。基于简约法、距离法和最大似然法的系统发育分析都充分支持含CD染色体组的物种起源于一次杂交事件的推论，并且显示，在物种形成时，含C染色体组的物种（O. officinalis 或O. rhizomatis 而非O. eichingeri）可能承担了母本，而含E染色体组的物种（O. australiensis）则可能承担了父本。另外，CCDD物种间非常一致的系统发育关系表明，非常大的分歧存在于 O. latifolia 和其它两个种（O. alta和O. grandiglumis）之间，这个结果倾向于将后两个种处理为同种或同种下不同分类群。 5． 基于178个克隆序列比较，探讨了ITS在稻属多倍体中的致同进化及其系统学意义。研究发现稻属异源四倍体的ITS存在不同形式的进化方式：首先，非洲BBCC四倍体O. eichingeri和O. punctata 的ITS片段同时保留了双亲拷贝，而且系统发育研究表明，二倍体的O. eichingeri和O. punctata 可能是这两个四倍体的直接祖先;其次，亚洲四倍体O. malampuzhaensis和O. minuta 的ITS仅定向保留母本ITS拷贝;另外，美洲CCDD四倍体的ITS序列发生了双向致同进化，即O. alta和O. grandiglumis的ITS位点一致化成C染色体组类型，而O. latifolia一致化成 D/E 染色体组类型。我们的研究进一步表明在利用ITS片段进行系统发育分析时，特别是涉及异源多倍体时必须慎重。 6． 利用栽培稻的微卫星引物，对含B/C染色体组的6个物种，157个体的SSR位点进行扩增。结果在这些亲缘关系稍远的野生稻中得到7个SSR位点，其中5个位点表现出多态性。比较BB、CC和BBCC物种SSR位点的每位点平均等位基因数A、多态位点百分率P和期望杂合度He ，3项指标发现，四倍体物种的遗传多样性，总体上要高于二倍体物种;二倍体物种内部，O. officnalis的遗传变异最大。另外，以遗传相关性为标准，讨论了B/C染色体组物种间的系统发育关系，同时推测了现存二倍体物种和4个BBCC四倍体物种的遗传关系。

高山松的二倍体杂种起源-来自三个基因组的证据

利用松科植物特殊的遗传体系（叶绿体基因组一父系遗传、线粒体基因组—母系遗传、核基因组一双亲遗传），我们对高山松及其两个亲本种进行了广泛的群体取样，通过线粒体基因nadl、叶绿体基因rbcL和trnL-F基因间区以及低拷贝核基因4CL的序列分析或PCR-RFLP分析，为高山松同倍体杂种起源假说提供了翔实的遗传学证据，同时在个体水平上探讨了高山松不同群体的遗传组成、群体遗传结构、基因交流方向、群体建立过程以及杂种基因组的进化。具体结果如下： 1．细胞质基因组分析 1)线粒体基因nudl分析 本研究对油松、高山松和云南松的19个群体、295个个体的线粒体基因nadl的一个内含子进行了序列分析或PCR-RFLP分析，共检测到3种线粒体DNA单倍型-A、B和C。油松所有的取样群体仅含单倍型A;除BX群体外，所有的云南松群体仅含单倍型B; 10个高山松群体中，5个群体固定单倍型A，4个群体固定单倍型B，1个群体(ZD)分布有A和B两种单倍型。2)叶绿体rbcL基因分析 对同一组群体的rbcL基因进行序列分析或PCR-RFLP分析，共检测到两个变异位点和三种叶绿体单倍型（TT、TC和GC）。TT和GC分别是油松和云南松种特异性叶绿体单倍型，而在高山松群体里则三种单倍型均有分布，而且TC单倍型广泛地分布在7个杂种群体中，该单倍型很可能来源于点突变或第三个已灭绝的亲本。rbcL基因检测到的高山松群体分化系数很高(Gst=0.533)。 3)叶绿体trn L-F区序列分析 叶绿体trnL-F分子标记检测到的不同单倍型的差异主要是由引物“e”下游120碱基处一个多聚T结构的长度变异所致（叶绿体SSR位点）。10个高山松群体中共检测到5种叶绿体单倍型，其中两种主要的单倍型(9T和11T)分别为油松和云南松的种特异性单倍型，其他单倍型均为非典型单倍型。群体遗传结构分析表明：杂种群体表现最高的遗传多样性，而且trnL-F分析得到的高山松群体的分化系数也很高( Gst=0.443)。 总之，对高山松、油松和云南松的同一组群体取样进行的细胞质基因组分析表明：高山松群体分布有油松和云南松种特异性的线粒体和叶绿体单倍型，该细胞质DNA单倍型的地理分布为假说“高山松为油松和云南松的的二倍体杂种”提供了翔实的遗传学证据。油松和云南松在不同的杂种群体中分别做父本和母本，即两亲本在杂交过程中发生了双向基因交流。群体遗传结构分析发现高山松群体表现最高的遗传多样性，而且群体间的分化系数很高。不同的杂种群体在遗传组成上的差异表明他们经历过不同的建立和进化历史。从线粒体和叶绿体单倍型的地理分布可以看出杂种群体的建立曾经历强烈的奠基者效应和回交。青藏高原的隆升对高山松的起源、杂种群体的适应辐射以及保持产生了重要的影响。川西南和滇西北作为青藏高原的东边边界，很可能是当初云南松和油松分布的重叠区及杂交地带，即高山松的起源地。 2．核基因4CL分析 对高山松、油松和云南松的19个群体、32个个体的低拷贝核基因4CL进行了克隆及序列分析，获得的78条序列可分为两种类型（类型A和类型B）。这两种类型明显的差别是类型A相对于类型B在内含子区有- 20bp的缺失。以华山松的3条序列为外类群，对得到的78条序列进行基因谱系分析，发现所有的序列分成明显的两支，分别对应于类型A和类型B，而且每一支均包含三个种的部分序列，表明4CL基因在这三个种分化之前就已发生重复。另一个明显的特点是某个种的一条序列与另一个种的序列比其与同种的其他序列关系更近，可能因基因交流（杂交和渐渗）、非共祖、致同进化和重组等进化事件所致。三种松树中共检测到4CL基因序列的两种类型和六个亚类型，高山松群体中没有发现杂种独特的类型或亚类型。高山松和云南松共享三种序列亚类型以及最多的序列多态性，表明这两个种之间曾存在广泛的基因交流。

独花兰和扇脉杓兰的传粉生态学

兰科植物精巧的花部结构及其独特的传粉机制为自然选择理论和异花受粉优势学说提供了强有力的证据。开展兰科植物的传粉生态学研究对进一步探讨植物进化中的一些关键问题（如生殖隔离、物种形成、适应和繁育系统进化等）具有重要意义。本文通过对独花兰 (Changnienia amoena) 和扇脉杓兰 (Cypripedium japonicum) 两种兰科植物进行植物与传粉者之间关系、种内形态变异、花粉散布等方面的研究，探讨其适应进化方式、传粉系统的进化趋势，同时为开发适用的分子标记，在独花兰中初步摸索和探讨了微卫星标记的分离。主要研究结果如下： 1. 濒危植物独花兰的传粉生态学 在神农架2个地点进行了连续2年的野外观测和实验。结果表明，独花兰是一种自交亲和、需要昆虫传粉的欺骗性植物。在2个地点独花兰的传粉者种类不同，在龙门河三条熊蜂 (Bombus (Diversobombus) trifasciatus) 是主要传粉者，在关门山仿熊蜂 (B. (Tricornibombus) imitator) 是唯一的传粉者。尽管它们出现的丰度和觅食行为不同，但其传粉行为和携粉部位非常相同，因此，可以看作是一个功能群（functional group）。从种群水平上看，开花个体的分布式样不是显著的偏斜曲线图，传粉者的有效访问主要集中在开花的前、中期。由于没有花蜜，传粉者在花内停留的时间很短，花粉块输出和传粉发生在熊蜂劳而无获的访问、退出花时。自然条件下，独花兰的结实率很低，只有6%-12%，并呈现明显的年份和地点变化。传粉者限制是结实率低的主要原因。与同亚族近缘种布袋兰相比，分布于中国中部的独花兰受冰期的影响很小，其传粉环境相对稳定，在进化历史中，形成了一种稳定的传粉系统。本研究结果纠正了前人对独花兰繁殖方式的错误认识，并为其保护策略的制订提供了重要资料。 2. 独花兰种群大小、传粉者访问和花粉流 为了检验独花兰种群大小、空间格局与传粉者访问之间的关系，连续2年对10个独花兰种群的花粉块输出和输入进行了统计分析，同时对花粉块进行标记研究其散布式样。结果显示，花粉块输出比例与种群大小之间关系在2003年呈显著负相关，但在2004年这种负相关关系不显著。尽管独花兰的空间分布格局在不同种群不同，但传粉者的访问除了在有蜂巢的种群为聚集式访问外，其余种群内均为随机访问式样。花粉块的散布式样呈尖峰态分布，多数花粉块散布很短的距离，少数散布较远。花粉块的平均散布距离在龙门河为7.3 m，在关门山为10.6 m。由于各种群之间相隔很远，种群之间花粉块交流受到限制，很少有种群外的花粉块输入。花粉块传递只在种群内近缘个体中进行，有可能导致种内遗传或形态分化。 3. 独花兰种内形态变异及其适应意义 对庐山、新宁和神农架3个地点15个独花兰自然种群的形态变异进行了研究，探讨了形态多样性水平和地理变异式样及其可能的适应机制。结果表明，在物种水平上独花兰形态性状存在丰富的变异。单因素方差分析显示3个地区间多个形态性状存在极显著差异（P<0.01），UPGMA聚类分析也表明这3个地区分别形成明显不同的分支，说明3个地区种群植物形态已经出现分化。在神农架地区，龙门河和关门山两个地点间出现明显的形态分化，而这两个地点的传粉者在形体大小表现出显著差异。适合度与形态性状之间的相关性分析显示，独花兰种内形态分化是以传粉者为媒介的自然选择作用的结果。移栽实验显示，本地传粉者对本地和移栽种群花的访问表现出一定的选择性。 4. 扇脉杓兰的传粉生态学研究 与独花兰同域分布、花期不遇的扇脉杓兰是杓兰属的一个特殊类群，具有典型“Japonicum”型唇瓣类型。对神农架6个种群连续两年野外观测和实验结果表明，扇脉杓兰是一种自交亲和、需要昆虫传粉的欺骗性植物。在种群水平上开花个体的分布式样呈显著的偏斜曲线图，在短时间内迅速到达盛花期。扇脉杓兰的传粉者是三种熊蜂，其访问频次很低，访问时间很短，有效访问主要集中在开花的前、中期。自然结实率只有4.3％－8.5％，人工授粉实验证明，传粉者限制是结实率低的主要原因，且传粉者限制程度在花期不同阶段和不同地点存在差异。对欺骗性植物聚集生长、开花有利于吸引传粉者这一假说进行检验，结果显示，克隆群丛大小与传粉者有效访问（花粉块输出比例）呈弱负相关关系。聚集生长的结实率与分散生长的没有显著差异，说明繁殖成功与开花个体的密度无关。扇脉杓兰的花粉集结为未蜡质化的花粉块，是杓兰属中粘质花粉和蜡质花粉块的中间进化类型。传粉生态学和形态学证据显示C. acaule和扇脉杓兰是东亚-北美间断分布的姐妹种对。 5. 独花兰微卫星位点的分离 为了深入研究独花兰种群的基因流和交配系统，用Dynabeads和选择性杂交法分离微卫星位点、筛选引物。首先将基因组DNA用合适的内切酶消化为400-1000 bp大小的片段，然后用生物素标记的简单重复寡核苷酸序列做探针与其杂交，杂交复合物用抗生链霉素蛋白包裹的磁珠吸附，经过一系列洗脱、沉淀，得到富含重复片段的DNA，然后在进行克隆、测序，利用SSR两侧翼区设计引物，经过多态性分析可得到微卫星标记。结果显示，35个克隆序列中18个（51.4％）含有重复片段（SSRs），说明用Dynabeads富集效率明显高于传统方法。到目前为止所得引物共4对。这一实验方法的探索为以后分离杓兰属等兰科植物微卫星位点、进而进行群体遗传学研究奠定了一定的基础。

松科nrDNA 的进化研究Evolution of nuclear ribosomal DNA in Pinaceae

核核糖体DNA（nrDNA）已被作为一个重要的标记，用于推断很多分类等级上的系统发育关系。相对于在被子植物中的快速致同进化，nrDNA在裸子植物中的致同进化速率低，且ITS和5S-NTS区有着较大的长度变异，这种现象在松科植物中尤为明显。在本研究中，我们克隆并测定了银杉属的5S rDNA以及冷杉属、银杉属、雪松属、油杉属、长苞铁杉属、金钱松属与铁杉属的ITS序列。基于获得的新数据，再结合前人报导的其它属的数据，我们探讨了如下四个问题： （1）松科 nrDNA ITS1 亚重复单位的组成、分布及进化;（2）ITS1区的长度变异与亚重复单位数目的关系以及它们的系统学意义;（3）松科ITS1的二级结构特征;（4）银杉5S rDNA编码区及非转录间隔区的结构特征。主要研究结果如下： 1. ITS区的序列分析ITS区的克隆及序列分析发现：（1） 松科ITS1的长度变异范围为 944-3271 bp, 这是目前已报导的真核生物中属间ITS变异最大的类群之一;（2） 所有松科植物的ITS区域都包含亚重复单位，亚重复单位的数目从2到9，并且这些亚重复单位可分为两种类型，即不含保守核心序列（5’-GGCCACCCTAGTC ） 的长亚重复单位（LSR）和含上述保守核心序列的短亚重复单位（SSR）;（3） ITS1区的巨大长度变异主要归因于亚重复单位的数量变异; （4） ITS1区的GC含量与 它的序列长度和亚重复单位的数目有一定关系，并能够提供一些系统发育信息，特别是支持云杉属、松属和银杉属三者具有很近的亲缘关系。 2. ITS1亚重复单位的系统发育分析为了研究亚重复单位的进化关系，我们用最大似然法和最大简约法构建了松科ITS1亚重复单位的系统发育树。结果表明：（1）在ML和MP树中可发现有共同的五个分支; （2） 银杉比松科其它属拥有更多的SSR，且该属的所有9个SSR在系统树中构成一个单系支，表明它们是在银杉属内发生重复的;（3）一些SSR在属间和种间具有同源性，可为nrDNA ITS 的进化历史以及松科的系统发育 研究提供重要信息;（4）亚重复单位的多次重复以及伴随的重组可能是导致LSR 和SSR在松科不同属中分布式样不同的原因。 3. 松科ITS1的二级结构 用 Mfold 3.2 软件对松科所有11个属的ITS1区进行了二级结构预测，共获得了563个最低自由能折叠。结合以前关于松科二级结构的报导，我们分析的结果表明：（1） 松科ITS1的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成;（2） 构象的复杂性与亚重复的数目呈正相关;（3）配对的亚重复单位通常在保守核心区（5’-GGCCACCCTAGTC ） 处有部分重叠，并且构成一个长茎，而其它的亚重复单位通常会自身折叠，且保守核心区的部分出现在发夹结构的环中。 4. 银杉5S rDNA 序列分析 我们对来自银杉不同群体的3个个体的5S rDNA进行了克隆，共获得 45 条序列，分析结果表明：（1） 绝大多数银杉5S rDNA编码区长度为120 bp, 以GGG 开头，以CTC结尾，编码区出现的碱基替代主要为转换;（2） 银杉与其它裸子植物相比，5S rDNA基因编码区具很高的相似性（90-99%）; （3）间隔区含有一个poly-C和一个poly-T结构、两个TC丰富区以及五个GC丰富区。根据长度和序列特征，银杉的5S rDNA间隔区可分为三种类型：Type A 长751-764 bp，Type B 长770-807 bp （含一个32 bp的插入），Type C 长581-594 bp; （5）长间隔区（Type A，Type B ）中含有两个148-175 bp的串联亚重复单位，该亚重复单位与短间隔区（Type C ）中的一段143 bp的序列具有较高的相似性（56.0-66.8%）。 5. 银杉5S rRNA的二级结构 Mfold 3.2 预测结果表明：（1）银杉5S rRNA二级结构包括5个双螺旋区（干区）（Ⅰ-Ⅴ）、2个发夹结构环区（C和D）、3个中间环区（B1、B2 和 E）和1个铰链区（A）, 铰链区为三个双螺旋的结合处;（2） 二级结构中的环区通常比双螺旋区更加保守;（3）在5个双螺旋中，I 和 IV 区有较高的碱基替代率。

Isolation and characterization of microsatellite markers for the endangered Taxus yunnanensis

Eleven polymorphic microsatellite loci were characterized for the endangered conifer Taxus yunnanensis. Eight loci were isolated through SSR-anchored PCR, one locus was developed by cross-species amplification tests, while the last two loci were obtained

Mouse Toxicity of Anabaena flos-aquae from Lake Dianchi, China

Some species of the genera Anabaena can produce various kinds of cyanotoxins, which may pose risks to environment and human health. Anabaena has frequently been observed in eutrophic freshwater of China in recent years, but its toxicity has been reported only in a few studies. In the present study, the toxicity of an Anabaena flos-aquae strain isolated from Lake Dianchi was investigated. Acute toxicity testing was performed by mouse bioassay using crude extracts from the lyophilized cultures. The mice exposed to crude extracts showed visible symptoms of toxicity and died within 10-24 h of the injection. Serum biochemical parameters were evaluated by the use of commercial diagnostic kits. Significant alterations were found in the serum biochemical parameters: alkaline phosphatase (AKP), gamma-glutamyl transpepticlase (gamma-GT), aspartate amino transferase (AST), alanine amino transferase (ALT), AST/ALT ratio, total protein content, albumin content, albumin/globulin (A/G) ratio, blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (Ssr), and total antioxidative capacity (T-AOC). Histopathological observations were carried out with hematoxylin and eosin (HE) stain under light microscope. Severe lesions were seen in the livers, kidneys, and lungs of the mice injected with crude extracts. The alterations of biochemical parameters were in a dose-dependent manner, and the severities of histological lesions were in the same manner. Based on biochemical and histological studies, this research firstly shows the presence of toxin-producing Anabaena species in Lake Dianchi and the toxic effects of its crude extracts on mammals. (C) 2008 Wiley Periodicals, Inc. Environ Toxicol 24: 10-18, 2009.

Development of EST-SSRs by an efficient FIASCO-based strategy: A case study in rare minnow (Gobiocyrpis rarus)

Type I markers are useful for comparative mapping and other genetic analyses, but relatively difficult to develop. In the present study a microsatellite (SSR)-enriched cDNA library was constructed for the first time using the fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO) method in a small fish, Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus). A total of 97.4% of the expressed sequence tags (ESTs) contained targeted CA-repeats, in which 29 unique EST-SSRs were identified. Ten out of the 28 loci for which primer pairs were designed were polymorphic with alleles ranging from three to seven (mean 4.50). Some of these EST-SSRs can be amplified in other species. These results proved that cDNA-FIASCO is an efficient way to isolate novel EST-SSRs in a fish.

Construction and characterization of a Lipotes vexillifer genomic DNA BAC library

We constructed a genomic DNA library for Lipotes vexillifer (L. vexillifer), the Baiji or Yangtze River dolphin, one of the most endangered mammals in the world. The library consists of 149,000 BAC clones, with an average insert size of 83 kb, representing approximately 3.4 haploid genome equivalents. PCR amplification of four known L. vexillifer genes yielded two to four positive clones each. To demonstrate the utility of this library, we isolated and sequenced the L. vexillifer alpha lactalbumin gene, which is a gene specific to mammals and one which has been widely used as molecular tool in phylogenetic analysis. We also end-sequenced 20 randomly selected clones, resulting in the identification of at least five new L. vexilliter genes, five SSR loci, and one SINE locus. These results suggest that this library is a valuable resource for candidate gene cloning, physical mapping, and genome sequencing of this important and threatened species.

A genetic map of large yellow croaker Pseudosciaena crocea

Genetic linkage maps were constructed for large yellow croaker Pseudosciaena crocea (Richardson, 1846) using AFLP and microsatellite markers in an F-1 family. Five hundred and twenty-three AFLP markers and 36 microsatellites were genotyped in the parents and 94 F-1 progeny. Among these, 362 AFLP markers and 13 SSR markers followed the 1:1 Mendelian segregation ratio (P > 0.05). The female genetic map contained 181 AFLP and 7 microsatellite markers forming 24 linkage groups spanning 2959.1 cM, while the male map consisted of 153 AFLP and 8 microsatellite markers in 23 linkage groups covering 2205.7 cM. One sex linked marker was mapped to the male map and co-segregated with the AFLP marker agacta355, suggesting an XY-male determination mechanism and this may be useful in the breeding of monosex populations. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

基于安全状态域的网络评估模型

将基于攻击图的评估与依赖标准的评估相结合,提出了一种基于安全状态域(security state region,简称SSR)的网络安全评估模型(security-state-region-based evaluation model,简称SSREM).该模型将攻击的影响分为攻击能力改变和环境改变,通过两者之间的因果关系建立数学模型,提出了安全状态域趋向指数的概念,借助Matlab进行攻击趋势的曲面拟合,进而进行安全状态域的划分和网络的安全性评估.实验结果表明,依据SSREM进行的评估能够通过安全状态城和安全状态域趋向指数反映网络进入不同状态的难易程度,对网络安全性量化评估具有借鉴意义.

A linkage map of common carp (Cyprinus carpio) based on AFLP and microsatellite markers

P>Common carp (Cyprinus carpio) is an important fish for aquaculture, but genomics of this species is still in its infancy. In this study, a linkage map of common carp based on Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP) and microsatellite (SSR) markers has been generated using gynogenetic haploids. Of 926 markers genotyped, 151 (149 AFLPs, two SSRs) were distorted and eliminated from the linkage analyses. A total of 699 AFLP and 20 microsatellite (SSR) markers were assigned to the map, which comprised 64 linkage groups and covered 5506.9 cM Kosambi, with an average interval distance of 7.66 cM Kosambi. The normality tests on interval map distances showed a non-normal marker distribution. Visual inspection of the map distance distribution histogram showed a cluster of interval map distances on the left side of the chart, which suggested the occurrence of AFLP marker clusters. On the other hand, the lack of an obvious cluster on the right side showed that there were a few big gaps which need more markers to bridge. The correlation analysis showed a highly significant relatedness between the length of linkage group and the number of markers, indicating that the AFLP markers in this map were randomly distributed among different linkage groups. This study is helpful for research into the common carp genome and for further studies of genetics and marker-assisted breeding in this species.

中国卧龙自然保护区不同海拔川滇高山栎(Quercus aquifolioides)群体的遗传变异

海拔梯度造成的环境异质性，如崎岖的地形、复杂的植被结构以及花期延迟等可能会极大地影响到物种的形态和遗传变异格局。理解物种形态和遗传变异的海拔格局对于物种多样性的管理和保护是非常重要的。尽管植物群体遗传学是一个飞速发展的研究领域，然而与海拔相关的形态变异、遗传变异及群体间遗传差异的研究却很少。到目前为止，还不清楚遗传变异与海拔之间是否必然的相关性。 川滇高山栎是一种重要的生态和经济型树种，广泛分布于中国西南的四川、西藏、贵州和云南省的高海拔地区，在保持水土、调节气候方面起着十分重要的作用。尽管主要受阳光限制而仅分布于阳坡，但其海拔梯度范围较大，表明川滇高山栎对不同的环境具有很强的适应性。本文通过叶型及生理响应、微卫星分子标记和扩增性片段长度多态性方法，试图探索川滇高山栎叶沿海拔梯度的形态和生理响应及其沿海拔梯度的遗传变异格局，为川滇高山栎的保护和利用提供进一步的遗传学理论依据和技术指导。 对叶形、含氮量及碳同位素的试验结果表明，平均比叶面积、气孔密度、气孔长度和气孔指数等气孔参数随海拔的升高呈非线性变化。在海拔大于2800 m时，川滇高山栎的比叶面积、气孔长度和气孔指数都随海拔升高而降低，但是在海拔小于2800 m时，这些指标都随海拔的升高而增大。相对而言，单位叶面积的含氮量和碳同位素则表现出相反的变化模式。另外，比叶面积是决定碳同位素沿海拔梯度变化的最重要参数。本研究结果表明，海拔2800 m附近是川滇高山栎生长和发育的最适地带，在这里生长的植物叶片厚度更薄、气孔更大、叶碳同位素值更小。 利用六对微卫星引物对五个不同海拔川滇高山栎群体遗传多样性进行研究，结果表明，群体内表现出较高的遗传多样性，平均每位点等位基因数11.33个，平均期望杂合度达0.820。群体间差异较小，分化仅为6.6％。聚类分析也并没有显示出明显的海拔格局。然而低频率等位基因却与海拔呈显著性正相关(R2=0.97, P < 0.01)，表明在高海拔处，川滇高山栎以更多的稀有基因来适应恶劣的环境条件。本试验结果表明由海拔梯度形成的选择性压力对川滇高山栎群体的遗传变异影响并不明显。 为了进一步探讨川滇高山栎群体遗传变异与海拔之间的相互关系，我们还对其进行了扩增性片段长度多态性分析。结果表明：(1)随海拔的升高(从群体WL2到群体WL5)，群体内遗传变异降低，而群体间遗传差异增加；(2)低海拔群体WL1表现出最低的遗传变异性(HE = 0.181)，同时与其余四个群体间呈现出最大的遗传差异性(平均FST = 0.0596)；(3)在除去低海拔群体WL1后，Mantel检测表明群体间遗传距离与海拔距离之间表现出正相关性。另外，研究结果还表明，遗传变异受生境条件(过度的湿热环境)及人为干扰(火烧、砍伐和放牧)的影响，这一点至少在低海拔群体WL1上发生了作用。 通过叶形态、生理及DNA分子水平的研究，结果表明叶形态特征和碳同位素与海拔紧密相关，与海拔之间呈非线性变化，海拔2,800 m附近是川滇高山栎生长和发育的最适地带。海拔梯度在一定程度上会影响到川滇高山栎群体的遗传变异结构，但在这样一个狭窄的地理分布区域里，这种影响并不足以导致群体间较大的遗传分化。同时生境条件及人为干扰也是影响遗传变异的限制性因子，不容忽视。 Altitudinal gradients impose heterogeneous environmental conditions, such as rugged topography, a complex pattern of vegetation and flowering delay, and they likely furthermore markedly affect the morphological and genetic variation pattern of a species. Understanding altitudinal pattern of morphological and genetic variation at a species is important for the management and conservation of species diversity. Although plant population genetics is a fast growing field of research, there are only few recent investigations, which analyzed the genetic differentiation and changes of intra-population variation along altitudinal gradients. At present, it is still unclear whether there are some common patterns of morphological and genetic variation with altitude. Quercus aquifolioides Rehder & E.H. Wilson, which is an important ecological and economical endemic woody plant species, is widely distributed in the Yunnan and Sichuan provinces, Southwest China. Its large range of habitat across different altitudes implies strong adaptation to different environments, although it is mainly restricted to sunny, south facing slopes. It plays a very important role in preventing soil erosion, soil water loss and regulating climate, as well as in retaining ecological stability. In this paper, we tried to understand the altitudinal pattern of morphological and genetic variation along altitudinal gradients through the experiments of leaf morphological and physiological responses, microsatellite analysis and AFLP markers. In leaf morphological and physiological responses experiment, we measured leaf morphology, nitrogen content and carbon isotope composition (as an indicator of water use efficiency) of Q. aquifolioides along an altitudinal gradient. We found that these leaf morphological and physiological responses to altitudinal gradients were non-linear with increasing altitude. Specific leaf area, stomatal length and index increased with increasing altitude below 2,800 m, but decreased with increasing altitude above 2,800 m. In contrast, leaf nitrogen content per unit area and carbon isotope composition showed opposite change patterns. Specific leaf area seemed to be the most important parameter that determined the carbon isotope composition along the altitudinal gradient. Our results suggest that near 2,800 m in altitude could be the optimum zone for growth and development of Q. aquifolioides, and highlight the importance of the influence of altitude in research on plant physiological ecology. Genetic variation and differentiation were investigated among five natural populations of Q. aquifolioides occurring along an altitudinal gradient that varied from 2,000 to 3,600 m above sea level in the Wolong Natural Reserve of China, by analyzing variation at six microsatellite loci. The results showed that the populations were characterized by relatively high intra-population variation with the average number of alleles equaling 11.33 per locus and the average expected heterozygosity (HE) being 0.779. The amount of genetic variation varied only little among populations, which suggests that the influence of altitude factors on microsatellite variation is limited. However, there is a significantly positive correlation between altitude and the number of low-frequency alleles (R2=0.97, P < 0.01), which indicates that Q. aquifolioides from high altitudes has more unique variation, possibly enabling adaptation to severe conditions. F statistics showed the presence of a slight deficiency of heterozygosity (FIS=0.136) and a low level of differentiation among populations (FST=0.066). The result of the cluster analysis demonstrates that the grouping of populations does not correspond to the altitude of the populations. Based on the available data, it is likely that the selective forces related to altitude are not strong enough to significantly differentiate the populations of Q. aquifolioides in terms of microsatellite variation. To further elucidate genetic variation pattern of Q. aquifolioides populations under sub-alpine environments, genetic variation and differentiation were investigated along altitudinal gradients using AFLP markers. The altitudinal populations with an average altitude interval of 400 m, i.e. WL1, WL2, WL3, WL4 and WL5, correspond to the altitudes 2,000, 2,400, 2,800, 3,200 and 3,600 m, respectively. Our results were as follows: (i) decreasing genetic variation (ranging from 0.253 to 0.210) and increasing genetic differentiation with altitude were obtained from the WL2 to the WL5 population; (ii) the WL1 population showed the lowest genetic variation (HE = 0.181) and the highest genetic differentiation (average FST = 0.0596) with the other four populations; (iii) the positive correlation was obtained using Mantel tests between genetic and altitude distances except for the WL1 population. Our results suggest that altitudinal gradients may have influenced the genetic variation pattern of Q. aquifolioides populations to some extent. In addition, habitat environments (unfavorable wet and hot conditions) and human disturbances (burning, grazing and felling) were possible influencing factors, especially to the low-altitude WL1 population. The present study shows that there were close correlations between morphological features and carbon isotope composition in our data. This indicates that a coordinated plant response modified these parameters simultaneously across different altitudes. Around 2,800 m altitude there seems to be an optimum zone for growth and development of Q. aquifolioides, as indicated by thinner leaves, larger stomata and more negative d13C values. All available evidence indicates altitudinal gradients may have influenced the genetic variation pattern of Q. aquifolioides to some extent. Decreasing genetic variation and increasing genetic differentiation with altitude was obtained except for the WL1 population. And the environment of habitats and human disturbances were also contributing factors, which impact genetic variation pattern, especially to the low-altitude WL1 population.