MADS-box基因在水稻和太行花中的相关研究& SAGE 在水稻上应用的生物信息学分析

本论文主要涉及两部分内容：第一部分是水稻和太行花中MADS-box基因的相关研究，第二部分是水稻中SAGE技术的生物信息学分析。 MADS-box基因家族在花发育过程中起着重要的作用。水稻是单子叶植物的模式植物，其基因组序列的公布为在基因组水平上鉴定MADS-box基因提供了条件。根据已发表的水稻MADS-box基因序列，利用关键词搜索、HMMER分析、同源比较、系统进化树分析等手段，对GeneBank和TIGR水稻基因组注释中所有已知和未知的水稻MADS-box基因进行了分析。结果表明，水稻中有64个MADS-box基因编码不同氨基酸，其中已知cDNA序列的为43个。在64个基因中，有23个属于ABCDE类基因，并且其cDNA序列已知，其中的10个已有功能方面的研究。通过3’-RACE和筛选水稻花器官的cDNA文库，得到了一个A类基因片断（A5B2），两个E类基因片断（MW1，MW2）。这三个基因分别与OsMADS14，OsMADS7和OsMADS5相似或相同。禾本科植物花器官的起源，尤其是内外稃的起源仍存在疑问，A功能基因是否以及如何参与其形成成为问题的关键。初步原位杂交分析表明，OsMADS14在花发育的早期开始表达。在小穗原基发育过程中，OsMADS14在内外稃原基中有较强的表达。随着小穗的发育，OsMADS14在整个花序中都有表达。在小穗发育的后期，OsMADS14在胚珠中有较强的表达。OsMADS14的表达模式与FUL类基因一致，并且证明了其在花发育的后期仍然表达强烈，暗示其可能与胚珠发育有重要关系。 SEPALLATA基因被认为是花的特异因子，参与了花的四轮花器官的决定过程。在本文中，通过3’-，5’-RACE，从太行花花芽中克隆了一个MADS-box基因。该基因推导的的氨基酸序列含有典型的M，I，K和C四个结构域，与FBP2和SEP3的相似性较高，系统进化树分析表明该基因属于SEP3亚家族，于是将其命名为TrSEP3。TrSEP3首先在花分生组织中表达，然后在雌雄蕊原基及花瓣中表达;在成熟花中，TrSEP3仅在花瓣和雌蕊中表达。这种表达模式与其它的SEP-like基因有稍不同。TrSEP3拟南芥中过量表达后并未导致表型的改变，暗示其功能与拟南芥的SEP基因可能存在差异。选择压力分析显示TrSEP3受到了不显著的负选择压力。这些结果暗示TrSEP3的功能可能与其它的SEP-like基因有差别，值得进一步研究。 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression)是对比样品间转录谱的差异、发现新基因的有效的方法。tag mapping是将SAGE-tag与其转录本匹配的过程，其效率直接影响对转录谱的解释，该过程受多种因素影响。目前，对水稻tag mapping过程缺少详细研究，导致其效率不高。为了确定参考数据库和其它合适的条件，我们利用EST序列和基因组序列构建了不同的参考图谱，从全长cDNA数据库中提取虚拟的SAGE-tag，研究了参考图谱、锚定酶、tag长度以及匹配方法对tag mapping效率的影响，并比较了tag mapping的准确率。结果表明，用EST序列构建的参考图谱能够匹配大多数的SAGE-tag，并具有较高的准确率;利用迭代的方法，可以充分利用基因组序列。各种锚定酶之间的差别不明显，其中NlaIII， HpyCH4V 和 AluI 表现较好;17bp的tag比较适合水稻;而用双锚定酶和17bp的tag则可以显著提高tag mapping的效率和准确率。

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

太行花MADS-box基因克隆、表达模式及功能分析

基因的重复（duplication）及其功能的多样性（diversification）为生物体新的形态进化提供了原材料。重复的基因通过表达方式和（或）编码序列的改变而导致其亚功能化（subfunctionalization）和（或）新功能化（neofunctionalization），从而使这些重复基因有可能保留在生物体中，增添生物的遗传稳定性（robustness）和多样性。MADS-box基因在植物（特别是在被子植物）的进化过程中发生了大量的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征，以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。开展对MADS-box基因家族成员的序列结构、表达模式及编码蛋白的功能研究可以为这些同源基因在生物体中的可能命运提供很好的实验依据。本研究以我国特有的蔷薇科物种太行花做实验材料，通过3’ RACE和5’ RACE方法从太行花中克隆了7个MADS-box家族的基因。序列和系统进化树分析表明这7个基因分别与拟南芥的MADS-box基因AG、SHP（SHP1/2）、PI、AP1、FUL和SEP1以及与矮牵牛MADS-box基因PhTM6具有很高的同源性并聚为一支，从而将这7个MADS-box基因分别命名为TrAG（Taihangia rupestris AG）、TrSHP（Taihangia rupestris SHP）、TrPI（Taihangia rupestris PI）、TrAP1（Taihangia rupestris AP1）、TrFUL（Taihangia rupestris FUL）、TrSEP1（Taihangia rupestris SEP1）和TrTM6（Taihangia rupestris PhTM6）。针对克隆的这些基因，具体进行了以下几方面的研究： 第一，对TrAG和TrSHP两个MADS-box基因进行了研究，它们分别属于AG亚家族中旁系同源进化系euAG和PLE进化系的成员。通过原位杂交的方法分析了旁系同源基因TrAG和TrSHP的表达方式是否发生了分化;构建组成型表达载体转化野生型拟南芥，分析了TrAG和TrSHP的编码蛋白的功能是否发生了改变;并进一步通过酵母双杂交的方法比较了TrAG和TrSHP的相互作用方式是否发生了分化。原位杂交分析表明，TrAG和TrSHP主要在雄蕊、心皮和胚珠中表达。在花发育过程中，TrAG起始表达比TrSHP早，在随后将形成雄蕊和心皮原基的分生组织区域以及雄蕊原基中表达;然而直到雄蕊原基出现前未检测到TrSHP的表达。在雄蕊原基形成之后，TrAG和TrSHP在发育的雄蕊、随后将产生心皮原基的分生组织区域以及心皮原基中表达。在花发育的晚期，TrAG在发育的柱头、花柱以及胚珠中均有表达，而TrSHP仅在胚珠中表达。35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株表现出相似的表型，包括开花提前;莲座叶和茎生叶向腹卷曲、变小;花芽在时期13前即开放，萼片包裹不住花芽;萼片和花瓣分别被同源异型转化为心皮化和雄蕊化器官，并在萼片向腹面产生异位的胚珠;在茎生叶上产生柱头化的乳突和胚珠;子房弯曲;果实提前沿着开裂区裂开，暴露出胚珠。此外，也观察到35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株的一些表型差异，35S::TrAG转基因拟南芥植株花芽呈暗绿色，而35S::TrSHP转基因拟南芥植株花芽呈黄绿色;不同与35S::TrAG转基因植株表型的是，35S::TrSHP转基因拟南芥植株花被脱落受到了抑制，偶尔可以观察到花丝基部融合，果实变短、育性降低。酵母双杂交分析表明TrAG可以与TrSEP3相互作用，而TrSHP不能与TrSEP3形成异源二聚体。以上研究结果表明做为旁系同源基因，TrAG和TrSHP在表达方式上发生了改变，在蛋白编码序列上保持了其祖先的功能，但是编码序列的一些差异还是导致它们之间生化作用方式的不同和一定程度上的亚功能化。基于以上研究结果并结合先前报道的在拟南芥、金鱼草和矮牵牛等物种中旁系同源基因的表达和功能数据，我们提出在不同物种中旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余（redundant），但是也通过改变表达方式、编码蛋白的功能及蛋白相互作用方式呈现出不同形式的亚功能化和（或）新功能化。 第二，对TrPI基因的功能也进行了初步研究，它属于AP3/PI亚家族PI-like进化系的成员。原位杂交结果表明，TrPI主要在花瓣、雄蕊和胚珠中表达。显示出TrPI与拟南芥同源基因PI保守的表达模式。35S::TrPI转基因拟南芥植株莲座叶发生延迟、变小、并且第一至第三片莲座叶呈白色针状;莲座叶和茎生叶并不像野生型呈有规则的螺旋状排列;花序茎基部、中间或顶端发生2-3个分支;在茎生叶的叶腋内的花序抽出时间明显晚于野生型，并且很小甚至不能完全抽出而藏在叶腋内。低温条件下转基因植株莲座叶的表型更加明显，表现为莲座叶变为针状，无叶片，仅有叶柄结构。这明显不同于35S::PI转基因拟南芥植株的表型。此外，酵母双杂交分析表明TrPI自身可以形成同源二聚体。这种相互作用方式也不同与拟南芥中PI的相互作用方式。以上研究结果表明，TrPI可能与拟南芥PI具有保守的表达模式但编码的蛋白可能获得了新的功能。 第三，构建了一个AP1-like基因（TrAP1）的过量表达载体，转化野生型拟南芥植株，通过反向遗传学分析了TrAP1的功能。35S::TrAP1转基因拟南芥植株开花提前;花序以两朵花终止，形成terminal flower的表型;偶尔可以观察到雄蕊转化为花瓣化的器官;莲座叶呈黄绿色并且其边缘呈锯齿状。酵母双杂交分析表明TrAP1蛋白自身可以形成同源二聚体。这些结果表明TrAP1可能与拟南芥同源基因AP1具有保守的功能。

盐角草（Salicornia europaea L.）SePSY和SeLCY基因克隆及功能分析

盐角草（Salicornia europaea L.）是一种叶片退化而茎肉质化，不具有盐腺和盐囊泡的真盐生植物，可以在1020 mM NaCl下生存。其特殊的形态适应特点使其成为研究植物抗盐性的良好实验材料。但目前与盐角草抗盐机理相关的生理和分子方面的研究还非常有限。本文以盐角草为材料，首先探讨了盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡的影响，在此基础上进一步克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶，八氢番茄红素合成酶（SePSY）和番茄红素β-环化酶（SeLCY）基因，并进行了功能分析。该研究对于了解类胡萝卜素在植物抗盐性中所起的作用具有重要意义。 盐分和渗透胁迫对其光合作用和渗透平衡影响的实验结果表明：200 mM NaCl是盐生植物盐角草生长的最适盐浓度，在该盐度下盐角草中叶绿素a/b的比值和光饱和点升高，植株的光合作用表现出增强的效应，植株生长最佳。而27％ PEG-6000所模拟的渗透胁迫显著降低了盐角草中叶绿色a/b的比值，抑制其光合作用和生长。200 mM NaCl下，Na+的含量显著增加，但脯氨酸含量保持不变，说明Na+对盐角草渗透平衡的作用要强于脯氨酸。同时盐角草中液泡H+-ATPase（V-H+-ATPase）活性增强，而盐角草Na+/H+逆向转运蛋白基因（SeNHX1）在盐分和渗透胁迫下却表现为组成型表达;我们因此推断在盐分胁迫下，Na+的吸收是由于液泡H+-ATPase活性的增强，而不是诱导SeNHX1基因的表达。同时Na+的吸收可能进一步诱导了与光合作用相关基因的表达。 盐分对植物的影响涉及植物体内包括光合作用和活性氧代谢在内的多个代谢过程。在植物中，类胡萝卜素是植物捕光天线复合体（LHC）和光系统反应中心叶绿素结合蛋白的重要组成部分。植物体内类胡萝卜素能够清除植物叶绿体，线粒体和过氧化物体在电子传递过程中产生的活性氧。同时类胡萝卜素是植物激素ABA的前体。200 mM NaCl虽然增加了盐角草细胞的渗透势，但并没有对其造成氧化胁迫和离子毒害，相反提高了其光合能力。类胡萝卜素作为植物活性氧的淬灭剂和光系统的组成成分，可能在盐角草抗盐机理中发挥着比较重要的作用。在过去的十年中，类胡萝卜素研究大多集中在其生物合成和提高作物中类胡萝卜素含量方面，可是，在植物对非生物逆境（如氧化和盐分胁迫）的适应机制中，类胡萝卜素合成途径究竟发挥什么作用目前还不是很清楚。为了了解盐角草中类胡萝卜素合成途径在植物逆境的适应机制中所发挥的作用，本文采用RACE的方法克隆了盐角草类胡萝卜素合成途径中的两个关键酶基因 SePSY和SeLCY，将它们构建到植物表达载体SN1301中，转化拟南芥，并对它们进行了初步的功能分析。 研究发现盐角草SePSY基因全长1655 bp，编码419个氨基酸，推测分子量为47.2 kDa，等电点为8.92。其蛋白在1-65个氨基酸处有一个信号肽。在1-19和242-264氨基酸处有2个跨膜区。盐角草SeLCY基因全长1937 bp，编码498个氨基酸，推测分子量为56.1 kDa，等电点为8.41。其蛋白在1-37个氨基酸处有一个信号肽。在79-96，367-385和454-474氨基酸处有3个跨膜区。SePSY和SeLCY基因过量表达均促进转基因拟南芥的生长，转SePSY基因拟南芥次生根数目比野生型拟南芥明显增多。SePSY和SeLCY基因的过量表达还使转基因拟南芥对百草枯的抗性得到提高;SePSY基 因的过量表达增强了植株体内抗氧化保护酶过氧化物酶（POD），超氧化物歧化酶（SOD）活性，但过氧化氢酶 （CAT）的变化不显著;转SeLCY基因株系POD，SOD，CAT的活性都有所增强，但转SePSY基因株系中POD活性明显高于 转SeLCY基因株系。转SePSY和SeLCY基因拟南芥叶片中丙二醛（MDA）和H2O2含量均降低，但转SePSY基因株系中MDA和H2O2含量明显低于转SeLCY基因株系。说明转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性得到了提高，同时使得光系统II（PSII）和细胞膜的结构和功能不被破坏。而转SePSY基因株系对盐分和氧化胁迫的抗性明显高于转SeLCY基因株系。SePSY和SeLCY基因的过量表达还提高了转基因拟南芥的光合效率，气孔导度和Fv/Fm比值。 SePSY和SeLCY基因转化拟南芥及其功能分析的初步结果表明，SePSY和SeLCY基因的过量表达提高了转基因拟南芥对体内活性氧（ROS）的清除能力，增强了拟南芥的光合能力，进而提高了拟南芥的抗盐性。

青蒿素生物合成相关基因的功能分析及遗传转化研究

从中国传统药用植物青蒿（Artemisia annua L.）中提取的青蒿素及其半合成衍生物如蒿甲醚等是一类新型的抗疟特效药，特别是对抗氯喹的恶性疟疾和脑型疟疾有很好的疗效。由于青蒿素在植物中的含量极低，使得其价格很高，特别是对于亚非拉等第三世界国家来说。因此如何提高青蒿素的产量成为近年来研究的热点。各种传统的育种、生理生化手段和细胞培养技术均未取得较好的结果，因此，利用植物基因工程技术提高青蒿素产量已成为研究的重点之一。 本论文围绕青蒿素的生物合成途径开展了以下的工作： 一、中药青蒿紫穗槐二烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 利用RT-PCR方法，从中药青蒿高产株系001中克隆到的中药青蒿紫穗槐二烯合酶(ADS) cDNA, 其推测编码蛋白与前人报道的有两个位点的突变。将其开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，构建N端携带有HIS6表达标签的紫穗槐二烯合酶重组表达载体pETADS。将pETADS转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta -D-thiogalactoside)诱导重组紫穗槐二烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组紫穗槐二烯合酶可以催化FPP向紫穗槐二烯的转化。体外酶促动力学分析表明，两个位点的氨基酸突变，并没有影响到青蒿紫穗槐二烯合酶的催化活性。基因组DNA杂交表明，紫穗槐二烯合酶基因在001株系基因组中至少有4个拷贝。 二、中药青蒿鲨烯合酶的大肠杆菌表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿鲨烯合酶cDNA(AF302464) 开放阅读框的3'末端截短99 bp，插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的鲨烯合酶重组表达载体pETSSA。将pETSSA转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thio galactoside)诱导重组鲨烯合酶的表达。表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（含FPP和NADPH），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示重组鲨烯合酶可以催化FPP向鲨烯的转化。青蒿鲨烯合酶的功能鉴定，为进一步利用反义或RNAi技术限制甾类生物合成，从而提高青蒿中的青蒿素含量提供了基础。 三、中药青蒿法呢醇合酶原核表达、纯化与功能鉴定 将经RACE方法克隆到的中药青蒿倍半萜合酶cDNA ( AF304444) 开放阅读框插入到原核表达载体pET30a(+)的NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点之间，构建N端和C端均携带有HIS6表达标签的重组表达载体pET30SESQ。将pET30SESQ转入大肠杆菌BL21(DE3)， IPTG (Isopropyl-beta-D-thioga lactoside)诱导蛋白表达，表达产物经镍琼脂糖柱纯化。纯化蛋白加入酶促反应体系（FPP），GC-MS分析酶促反应体系的正己烷萃取物，结果显示此重组酶可以催化FPP向法呢醇的转化。 四、中药青蒿FPS、ADS双功能酶基因的构建、表达与功能鉴定 将青蒿素生物合成途径中催化两步连续反应的酶：法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶的基因进行融合，经大肠杆菌表达后鉴定融合蛋白的功能，结果表明融合蛋白具有了双功能酶活性。进一步将融合酶基因转入酿酒酵母中，发酵后检测紫穗槐二烯的含量，并与同时转入法呢基焦磷酸合酶和紫穗槐二烯合酶单个基因的酵母、单独转入紫穗槐二烯合酶基因的酵母进行了比较，结果表明，转入双功能酶的酵母发酵获得的紫穗槐二烯含量要比两个对照酵母高，这表明，获得的双功能酶的催化效率要比两个单独酶的催化效率高。 五、过量表达青蒿紫穗槐二烯合酶对青蒿中青蒿素及其前体物含量的影响 利用根癌农杆菌介导，将青蒿紫穗槐二烯合酶转入青蒿株系001，分子检测证明，紫穗槐二烯合酶整合到了青蒿基因组中并在mRNA水平得到了高效表达。部分转基因青蒿的青蒿素含量有明显增加，最多的比001株系提高了41%。青蒿酸和二氢青蒿酸含量测定表明，转基因青蒿株系的青蒿酸和二氢青蒿酸含量最多的比对照分别提高了47%和79%。这些结果表明，紫穗槐二烯合成在青蒿素生物合成途径中是一个限速步骤，同时，也显示青蒿酸或二氢青蒿酸的进一步转化也可能是青蒿素生物合成中下游的限速步骤。

水稻AP2/EREBP转录因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析

AP2是一个大的转录因子家族，因其成员含有一个60-70 个氨基酸残基的保守结构域即AP2结构域而得名，它们的功能涉及植物花的发育以及植物对生物或非生物逆境的应答反应。根据它们所含的AP2 结构域的数目，这个家族可分为AP2亚家族和EREBP 亚家族。 AP2亚家族成员含两个AP2结构域，EREBP 亚家族成员含一个AP2结构域。一般来说，AP2 亚家族的成员主要参与植物发育过程的调控;EREBP 亚家族成员则主要参与对逆境的应答反应。按照它们响应外界刺激的类型和AP2结构域中结合顺式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亚家族又可分为ERF和CBF/DREB两大类群，ERF 类主要响应生物类逆境的诱导，CBF/DREB类则响应干旱、低温等非生物胁迫的刺激。 根据AP2保守结构域搜索，水稻基因组中一共有147个AP2/EREBP成员，但其中功能得到证实的还非常有限。为了解更多AP2基因在植物生长发育过程中的功能，我们先从水稻基因组数据库中搜索到含有AP2/EREBP 结构域的推测基因序列，选择其中40个扩增并成功扩增出31个，将这些DNA片段点在尼龙膜上，然后用水稻叶片cDNA 作模板标记探针，与固定在膜上的推测基因杂交。杂交结果作为选择基因进行功能分析的重要依据。 OsDRE就是我们选择进行研究的一个表达较强的基因。首先，通过RACE 克隆得到OsDRE 的cDNA全长 1589bp，它编码318个氨基酸。Blast 搜索和保守结构域序列比对分析以及进化树分析显示它是一个新的ERF 基因。RT-PCR分析表明该基因在水稻各种组织中表达量比较一致，而且，OsDRE 既不对植物生长物质如乙烯，水杨酸（SA），茉莉酸甲酯（MJ），脱落酸（ABA），赤霉素（GA3），油菜素内酯（BR）的诱导起反应，同样也不响应环境因子如低温、干旱条件的处理。这些结果说明OsDRE是一个不响应胁迫相关因素的诱导的、组成型表达的水稻基因。用OsDRE的非保守区域构建的RNAi 载体转入水稻后未能使转基因水稻产生异常表型，然而，OsDRE在水稻和拟南芥中的过量表达都导致转基因植物出现植株矮小、开花延迟、生长周期延长以及育性降低等表型，说明OsDRE对生长和发育的影响在水稻和拟南芥中是一致的。 基于以上原因，我们选择在遗传分析方面有明显优势的拟南芥作为材料，对OsDRE基因功能进行研究并得出以下结论：（1）瞬时表达和随后的过量表达证明OsDRE定位于细胞核中，过量表达OsDRE引起转基因植株的生长周期变长、抽苔时间延迟和抽苔时莲座叶的数量增多;（2）过量表达OsDRE通过一种不影响细胞数量的方式抑制了细胞的膨胀从而导致植物器官以致整个植株变小，而且，在此过程中部分器官的形态也受到了影响;（3）OsDRE过量表达能激活已知位于乙烯信号途径下游的基因表达并且转基因植株幼苗在黑暗中出现下胚轴及根缩短变粗的现象，提示OsDRE 可能部分参与了乙烯信号途径下游的反应。 除此之外，我们还初步分析了另一个EREBP基因，并将其命名为OsRAF。氨基酸序列分析表明该基因与大麦的RAF 基因在蛋白水平上相似性最高。Northern 杂交结果进一步显示，与RAF 一样，OsRAF 也是根中优势表达的基因，并且它的表达量在乙烯或低温的诱导下增加。对转基因植株的观察和瞬时表达表明OsRAF 定位于细胞核中。 综上所述，对水稻基因OsDRE 和OsRAF的分析表明， OsDRE是一个新的ERF基因，它不受乙烯等因素的诱导并且过量表达该基因导致转基因植株出现细胞膨胀受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中优势表达并受乙烯和低温的诱导，目前，与之相关的功能研究正在进行。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE得到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

复苏植物牛耳草Boea hygrometrica耐旱复苏过程中LEA基因表达调控及功能研究

本实验室以复苏被子植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica (Bunge) R Br，牛耳草）为实验材料，利用cDNA微阵列技术，筛选到2个LEA蛋白的cDNA片段。它们在干旱条件下表达水平增加一倍以上。在上述基础上，通过5’-RACE的方法扩增得到这两个LEA基因的全长cDNA，BhLEA1和BhLEA2，发现二者编码蛋白均与玄参科复苏植物Craterostigma plantagineum中的第4组LEA蛋白pcCC2具有最高的同源性。PCR扩增得到的基因组序列中发现BhLEA1和BhLEA2在靠近5’端处各有一内含子，分别为97和171bp。利用tail-PCR和inverse-PCR扩增得到BhLEA2的1215bp的启动子序列，其中含ABRE、W-box、HDEs、MYB、MYC、和生长素响应元件等。两个基因在不同胁迫、激素等处理下都有诱导表达。构建过量表达载体, 转化烟草。筛选T2代的纯合体植株进行抗旱试验，测定了干旱过程中的土壤和叶片含水量，PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm、SOD和POD酶的活性及蛋白质降解程度，发现BhLEA1和BhLEA2过量表达的烟草抗旱性有明显提高，与野生型相比，叶片含水量和光系统Ⅱ活性下降慢、SOD和POD活性增高、蛋白质降解减少。Western blot检测发现在干旱时，野生型烟草的RbcL、LHCⅡ和PsBO蛋白明显降解，而转基因植物的几乎没有降解，或者降解较少，说明BhLEA的过量表达可以在一定程度上抑制干旱诱导的蛋白质降解。这些结果表明，BhLEA基因可能直接或间接地在牛耳草干旱过程中参与了保护蛋白质的作用，为牛耳草叶片的复苏提供了基础。

羊草cDNA文库的构建及果聚糖水解酶的分离与鉴定

羊草(Leymus chinensis(Trin.) Tzvel.)又称碱草，隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。作为一种兼具重要经济价值和生态价值的优良牧草，羊草受到了广泛的关注。但长期以来，对羊草的研究主要集中在生态学、生殖生物学方面，在分子生物学方面知之甚少。为了保存羊草基因资源，并在基因水平上研究羊草生物代谢的调控机理，本研究采用羊草根、叶片混合后做为材料，构建cDNA文库，并对文库中部分基因序列进行了分析。同时从中克隆获得羊草果聚糖水解酶全长基因并对这些基因进行了深入的生物信息学分析、转化毕赤酵母研究初步确定其功能，为深入了解羊草代谢的分子机制提供理论依据。主要结果如下： 1. 成功地构建了羊草根、叶混合cDNA文库，原始文库滴度达到4×106 pfu/ml，扩增文库滴度接近1011 pfu/ml ，重组率达97% 。PCR检测插入片段，均在0.5 kb到3 kb之间，l kb以上占68%。从文库中检测到了TC、γ-TMT、FEH基因，文库覆盖度达到要求且为PCR筛选文库提供了可能。 2. 随机挑取经检测过的597个单克隆进行测序，去除插入片段小于和污染序列后，获得了584条高质量的序列。所有584条EST序列与NCBI的核酸数据库比对时，有30.99%的EST序列与己知序列有很大的同源性：而与蛋白质数据库进行比对时，有61.27%的EST序列与已知序列有很大的同源性。核酸比对中，有32.87%的序列为未知功能新基因，而蛋白质比对结果只有11.27%的序列为未知功能新基因。其中获得5条全长基因。 3. 文库中测序得到果聚糖水解酶（FEH）片段，依据其核酸、蛋白序列，以羊草根茎为材料，结合果聚糖水解酶基因的保守序列设计引物，通过 RACE 方法，获得羊草果聚糖水解酶基因 Lc 1-FEH 的全长序列（2040bp），包含一个 1803bp 的开放阅读框，采用生物信息学方法对该基因编码蛋白质进行功能分析，该基因编码的氨基酸序列具有明显的果聚糖水解酶类蛋白特征(NDPNG，FRDP 和[WEC (V/P)D] 结构域)，其分子量为 66.8kD，等电点 pI 为 5.49，是一种酸性蛋白质。同源性分析结果表明Lc1-FEH与单子叶植物小麦、大麦和黑麦草细胞壁类酵素酶同源性最高，分别为89％、87％ 和72％。运用实时定量方法对Lc 1-FEH表达量在羊草发育各时期及不同逆境处理下进行测定，结果发现，幼苗中以叶中表达量最低，根茎中表达较高，成苗中花梗中的表达量最高；Lc1-FEH在转录水平明显受碱、ABA、SA及低温胁迫诱导，随着胁迫时间延长，表达量迅速增加，到达到最大值，之后表达水平逐渐降低，在盐、干旱的诱导下的表达量迅速降低。 4. 羊草果聚糖水解酶Lc1-FEH基因在毕赤酵母中的高效表达 将pMD-Lc1-FEH 质粒经双酶切后构建果聚糖酵母表达载体 pPICZα- Lc1-FEH 。将重组表达载体线性化后电击转化毕赤酵母Pichia pastoris X33，经抗生素 Zeocin 和酵母 PCR 筛选获得高效表达酵母工程菌。毕赤酵母表达的果聚糖水解酶蛋白经SDS-PAGE 分析表明Lc1-FEH表观分子量为 67 kD 左右。其最适反应 pH 值为 5.5，在 pH 值为 4.5~6.5 的范围内能保持较高的酶活力；表达Lc1-FEH的最适反应温度为 30 ℃；在温度在 20～30℃度范围内有较高的酶活。 Lc 1-FEH能够水解含有β-2，1糖苷键类型果聚糖：蔗果四糖、菊粉、6-蔗果三糖；而对β-2，6糖苷键类型果聚糖：6-蔗果三糖、新蔗果三糖、细菌类果聚糖及蔗糖基本不具水解活性。

酵母拮抗菌和外源水杨酸对核果类果实抗病相关基因的诱导表达

在果实采后贮藏过程中，病原真菌的侵染会引起果实腐烂，造成巨大的经济损失。利用生物和非生物因子诱导果实抗病性，已经成为采后病害防治领域的一个研究热点。本文主要利用RT-PCR和RACE技术克隆果实抗病相关基因，通过分子杂交和蛋白羰基化免疫检测技术，研究了外源SA和酵母拮抗菌诱导果实抗病性机理，结果表明： 1. 通过优化RNA提取方法，能从含有多糖的冬枣、葡萄、甜樱桃、桃、番茄等果实中提取到质量较好的RNA，用于RT-PCR和Northern杂交。 2. 采用RT-PCR和RACE方法，从甜樱桃果实克隆了两个抗氧化相关基因CAT2（Genbank：EF165590）和GPX（Genbank：EF165591）和两个PR基因GLU-1（Genbank：EF177487）和GLU-3（Genbank：EF177488)。其中CAT2全长cDNA序列为1479 bp，编码492个氨基酸；GPX全长cDNA序列为513 bp，编码170个氨基酸；GLU-1全长cDNA序列为1050 bp，编码349个氨基酸；GLU-3部分cDNA序列为454 bp，编码141个氨基酸。 3. 酵母拮抗菌Pichia membranaefaciens处理不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低果实贮藏期间青霉病（Penicillium expansum）的发生，并且对低成熟度果实的病害防治效果更为明显。酵母拮抗菌的抑病机理与减轻了甜樱桃果实蛋白羰基化程度，诱导了果实抗氧化酶基因（CAT和GPX）和PR基因（GLU-1）的表达和提高了抗氧化酶（CAT和GPX）和β-1,3-葡聚糖酶的活性有关。 4. 四种酵母拮抗菌P. membranaefaciens, Cryptococcus laurentii, Candida guilliermondii和Rhodotorula glutinis处理桃果实，可显著降低贮藏期间的褐腐病（Monilinia fructicola）。这是由于酵母拮抗菌能抑制病原菌侵染造成的氧化胁迫和蛋白羰基化。此外，酵母拮抗菌处理还能显著诱导CAT、POD、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性及相应基因的表达。 5. 水杨酸（SA，2 mM）处理采后不同成熟度的甜樱桃果实，能显著降低青霉病的危害。其抑病机理与SA处理能减轻P. expansum侵染引起的果实蛋白羰基化程度，显著提高CAT、GPX和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达和相关的酶的活性有关。而2 mM的SA处理对P. expansum的生长没有直接抑制作用。 6. 水杨酸（SA，2 mM）与P. membranaefaciens（1×108 CFU/ml）配合处理能显著降低低温贮藏期间桃果实的褐腐病，并能提高几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和POD的活性和相关基因的表达。另外，2 mM的SA对拮抗菌P. membranaefaciens的生长没有影响，但能够抑制病原菌M. fructicola的孢子萌发和菌丝扩展。

Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制分析

Ⅰ 虎杖聚酮类化合物生物合成相关基因的克隆及功能分析 虎杖 (Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc) 属于蓼科蓼属多年生草本植物，在中国和日本民间曾被广泛用于动脉粥样硬化、高血压、咳嗽、化脓性皮肤炎以及淋病的治疗，具有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰等功效。而在现代医学上最令人瞩目和具有发展前景的是其在抗肿瘤、心血管保护、抗氧化方面的作用，相关疗效主要来自于虎杖中结构迥异、种类丰富的聚酮化合物及其衍生物资源。这些聚酮类化合物主要包括蒽醌、大黄素、大黄素-甲醚、大黄酚、芪类以及类黄酮化合物等。其中，大部分聚酮类化合物生物合成途径机制尚不明确，但可以肯定的是植物类型III聚酮合酶type III polyketide synthases (PKSs) 在这些聚酮化合物的生物合成起始反应中行使着关键的作用。因此，除了我们所熟悉的类黄酮化合物、芪类化合物之外，进一步分离和分析虎杖中其它重要聚酮类化合物生物合成所涉及的类型III聚酮合酶基因的是非常值得期待的。 目前，已经有14个植物类型III PKS基因被克隆和功能分析。植物类型III PKS的共同特征包括基因结构、序列相似性、保守的活性中心、酶学性质以及共同的催化机制等。显花植物（裸子植物和被子植物）中，植物类型III PKS的基因结构绝对保守，除了一个早期报道的金鱼草（Antirrhinum majus）查尔酮合酶chalcone synthase (CHS) 含有第二个内含子外，迄今为止所有已知的植物类型III PKS基因均含有一个内含子且该内含子位置保守。有趣的是，在本研究中，两个含有3个内含子的类型III PKS基因从虎杖中被分离，且两个基因3个内含子的位置完全保守，这是三内含子类型III PKS基因首次得到分离。除了新奇的基因结构外，体外功能分析显示上述两个基因还具有特殊的酶学性质和功能。 本论文围绕上述2个三内含子基因开展了以下工作： 虎杖中一个由三内含子基因编码的新型类型III聚酮合酶 一个类型III PKS的cDNA及其相应的基因（PcPKS2）从药用植物虎杖中被克隆。序列分析结果表明，PcPKS2的开放阅读框被3个内含子分隔，这是一个出人意料的发现，因为截至到目前为止，除了金鱼草一个CHS基因外，所有已知的类型III PKS基因均在固定位置上含有一个内含子。除了特殊的基因结构外，PcPKS2显示了一些有趣的特性：(i) CHS“守卫”苯丙氨酸——Phe215和Phe265在PcPKS2中双双缺失，它们分别被亮氨酸和半胱氨酸取代;(ii) 体外功能分析结果表明，当酶促反应体系的pH值为6.5-8.5时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS2高效地合成丁烯酮非环化产物——4-香豆酰甘油酸内酯（4-coumaroyltriacetic acid lactone (CTAL)）为主产物，而丙烯酮非环化产物bis-noryangonin (BNY) 以及苯亚甲基丙酮为副产物;而当酶促反应体系的pH值为9.0时，PcPKS2高效地合成苯亚甲基丙酮为主产物，而CTAL、BNY为副产物。另外，除了上述3种产物外，在不同的pH条件下，还有痕量的柚皮素查尔酮能被检测到。此外，在4-香豆酰辅酶A（4-coumaroyl-CoA）的类似化合物中，除了4-香豆酰辅酶A外，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS2接受作为起始底物。PcPKS2不接受脂肪酰辅酶A——异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS2基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，在根茎和幼叶中，PcPKS2表达量很高，而在根中无表达。叶中的PcPKS2的表达受病原菌诱导，但不受伤诱导。 虎杖中一个编码双功能类型III聚酮合酶的三内含子基因的鉴定 显花植物中，所有已知的类型III PKS 基因均含有一个内含子且位置绝对保守。本研究中，综合运用PCR技术，从富含聚酮类化合物的植物虎杖中克隆得到一个类型III PKS 基因（PcPKS1）及其cDNA。序列分析结果表明，PcPKS1含有3个内含子。系统发育分析结果表明，PcPKS1与其它植物的CHSs归为一类。然而，体外功能分析结果表明，当酶促反应体系pH值为7.0时，大肠杆菌中过表达的重组PcPKS1高效地合成柚皮素查尔酮（naringenin）为单一产物;而当pH值为9.0时，苯亚甲基丙酮（p-hydroxybenzalacetone）几乎为重组PcPKS1的唯一产物。后续的研究表明，与典型的CHSs相比，PcPKS1具有另外一些不同的特点：在pH值为9.0时（PcPKS1的苯亚甲基丙酮合成活性最适pH值），在4-香豆酰辅酶A的类似化合物中，只有feruloyl-CoA能够被PcPKS1接受作为起始底物。与CHSs展现出的对脂肪酰辅酶A宽泛的底物特异性不同，在不同的pH条件下，PcPKS1不接受异丁酰基辅酶A（isobutyryl-CoA）、异戊酰基辅酶A（isovaleryl-CoA）以及乙酰辅酶A（acetyl-CoA）作为起始底物。以上数据指出重组PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶。Southern blot杂交结果表明，在虎杖基因组中存在2-4个PcPKS1基因的拷贝。Northern blot杂交结果表明，PcPKS1可能在防御病原菌和草食动物方面起着重要作用。PcPKS1和PcPKS2共同从虎杖中被分离的事实极有可能暗示了苯丁烷类化合物（phenylbutanoid）及其衍生物存在于虎杖中。 Ⅱ 高山红景天酪醇生物合成代谢途径机制研究 高山红景天（Rhodiola sachalinensis A. Bor）是景天科（Crassulaceae）红景天属多年生草本植物，作为一种适应原性中草药在中国的应用史已经超过800年。最近红景天提取物作为一种重要的商业药用制剂资源，其应用遍及欧洲、亚洲和美国，其主要治疗范围包括抗变应性和消炎，提高心理机敏性等。目前已经非常明确，红景天甙（salidroside）和甙元酪醇（tyrosol）是红景天属植物的主要功效成分，主要分布于这类植物的根中并且具有抗缺氧、抗疲劳、延缓衰老、预防紫外线辐射伤害等功效。红景天甙为酪醇8-O-β-D葡萄糖甙，是酪醇在葡萄糖基转移酶UDP-glucosyltransferase (UGT) 的催化下糖基化后形成的，可以认为是酪醇在植物体内的贮存形式。酪醇作为一种重要的活性分子，同样存在于橄榄树和葡萄酒中。 虽然已经非常明确酪醇来自于莽草酸代谢途径，然而其具体的生物合成途径及其调控仍不明确。总结以往的报道，在酪醇的生物合成上主要存在两种观点：一是酪醇可能来自于苯丙烷代谢途径产生的4-香豆酸（4-coumaric acid）前体;二是来自于酪氨酸的酪胺（tyramine）可能是酪醇生物合成的直接前体。我们的工作兴趣主要围绕着鉴别高山红景天中的酪醇生物合成途径展开： 高山红景天内源苯丙氨酸解氨酶PALrs1的过表达对红景天甙积累的影响 红景天甙是来自于药用植物高山红景天的一种适应原性新型药物，其生物合成途径可能起始于苯丙氨酸或酪氨酸。由于高山红景天野生植物资源的匮乏和相对含量很低，阐明红景天甙的生物合成途径对于增加红景天甙的供给至关重要。在我们以前的工作中，运用cDNA末端快速扩增技术（RACE），一个编码苯丙氨酸解氨酶phenylalanine ammonia-lyase (PAL)的cDNA从高山红景天中被克隆，命名为PALrs1。在本研究中，PALrs1置于35S启动子+Ω增强子序列的控制下通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化回高山红景天。PCR 和 PCR–Southern blot分析结果表明，PALrs1已经整合到了转基因植物的基因组上。Northern blot杂交结果表明，PALrs1已经获得在转录水平上的高水平表达。与预期的结果相同，高效液相色谱High-performance liquid chromatography (HPLC)测定结果显示PALrs1的过表达引起4-香豆酸含量增长3.3倍。然而，与之相反的是，酪醇和红景天甙含量与对照相比反而分别下降4.7和7.7倍。此外，我们发现PALrs1的过表达造成酪氨酸含量下降2.6倍。这些数据暗示着PALrs1的过表达和4-香豆酸的积累并不能促进酪醇的生物合成。酪醇，作为一种苯乙烷类衍生物并非来自苯丙氨酸，而酪氨酸含量的下降则极有可能是酪醇生物合成和红景天甙积累大规模下降的直接原因。

谷子和甘蔗C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其转基因水稻光合效率的提高

水稻是我国重要的粮食作物之一，它是一种典型的C3植物。与其它C3作物不一样的是，水稻的生长需要相对较高的温度和充足的阳光照射。然而高温和高光强的生长环境更加适合于C4植物的生长，更加有利于发挥C4植物高光合效率的特点。因此本论文希望将C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入水稻，获得一种更加适合高温和高光强生活环境的“C4型”水稻，这对于提高水稻的产量，满足人口增长对粮食需求具有重大意义。 本论文从C4植物谷子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，获得了具有自主知识产权的基因克隆，并将它们导入粳稻品种中花8号，进而对转基因材料的光合生理特性进行了研究。结果如下： 首次从谷子中得到了ppc基因两个cDNA克隆，分别命名为Mppc1和Mppc2。前者是一个C3型的ppc基因，它可能属于在根中特异表达的C3-2型ppc基因;后者是在绿色叶片中大量表达的C4型ppc基因。它们所编码的蛋白的氨基酸残基数分别为961和964，序列同源性为82.5%。C4型PEPC多出的3个氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我们得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非编码区，2895bp的编码区和256bp的3'非编码区。 首次获得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名为Sppc。它包括95bp的5'非编码区、2886bp的编码区，和224bp的3'非编码区。 利用所克隆的基因，分别连上强组成型启动子Ubiquitin启动子和强光调控启动子Rubisco小亚基启动子后，再插入两个标记基因不同的表达载体pCB和pPCB的多克隆位点中，构建了八个含有外源ppc基因的植物表达载体pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C4型ppc 核基因的载体pCB-ZMppc，共有9个载体。利用农杆菌介导法进行了水稻的转化，各个载体都获得了大量的转基因植株。对标记基因潮霉素磷酸转移酶基因hpt和磷酸甘露糖异构酶基因pmi以及导入的目的ppc基因的PCR扩增检测，结果显示绝大多数转基因植株都能扩增出目的片段，而未转化的植株则没有扩增产物。对部分转基因水稻的Southern和Western杂交以及RT-PCR分析都表明，无论从DNA水平、mRNA水平，还是从蛋白质水平上都证明外源ppc基因都成功地导入了水稻，并获得了正确的表达。 对各载体转基因植株PEPC活性大规模的测定表明，转入玉米完整C4型PEPC核基因（有内含子）的水稻表现出极大的表达效率，大多数转基因材料的PEPC活性为对照的10-20倍，其活性最高可达到对照的44倍。转入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表达的效率很低，多数材料活性增加仅为对照的2-5倍，但也有极少数材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亚基启动子控制的ppc基因在水稻的表达活性要略高于Ubiquitin启动子控制的ppc基因。以上结果说明ppc基因的内含子在其转录或mRNA的稳定上起着重要作用。 对部分转基因材料气体交换特征的研究发现，随着转基因水稻PEPC活性的增加，净光合速率也有逐渐增加的趋势。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三个单株净光合速率比对照增加了39.8%、13.7%和28.6%，而它们的PEPC活性比对照分别增加了21.2、21.9和23.6倍。 转PEPC水稻的净光合速率与气孔导度具有显著的相关性。这说明表达的外源ppc 基因产物PEPC参与了转基因水稻的气孔运动，使气孔开放程度增加。更有意义的是过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率，这就增加了其耐旱能力。在光抑制条件下转基因水稻也具有更高的光合能力。这些特征表明转ppc基因的水稻比对照更加适合于水稻高温高光强和干旱的原生环境。

大豆种子低温吸胀相关基因的分离与蛋白变化的研究

大豆 (Glycine max (L.) Meer.)是人们日常生活中不可缺少的食品，也是一种非常重要的油质、蛋白资源。目前根据大豆种子吸胀阶段对低温敏感性的不同，可将其划分成3种生态型：低温非敏感型、低温敏感型及中间型。对于低温非敏感型的种子来讲，4℃下吸胀24小时对其发芽率影响很小，而敏感型种子萌发率不超过5%。我国属于温带大陆性气候，大豆播种后由于温度波动而造成一部分种子不能萌发，最终导致减产甚至绝产的现象普遍存在。高产是育种工作的主要目标，提高逆境胁迫的适应能力是高产的前提和基础，所以从分子角度研究种子吸胀非常必要，一方面能够挖掘新的基因资源，另一方面为今后育种工作提供必要的理论依据。 本试验以此为立足点，低温吸胀非敏感型大豆品种 (Z22)为材料，利用cDNA-AFLP方法及蛋白质技术分离与低温吸胀相关的基因及蛋白，得到结果如下： 第一，本试验成功的分离出4个受低温诱导的基因，半定量RT-PCR方法进一步验证了这4个基因在种子吸胀24小时内受低温诱导。 第二，利用RACE方法成功的得到2个完整的全长基因，在NCBI数据库中查找后发现其中1个基因为新基因，命名为SCHI基因 (SCHI：Soybean chilling-induced gene)。SCHI全长为390bp，编码分子量大约为14.2KD的蛋白；另外一个基因是已知基因，其同源序列已经在其他的物种中得到分离。由于此基因与核糖体蛋白L34高度同源，所以把把这个基因命名为SOL34 (Soybean L34)。 第三，利用半定量RT-PCR方法对基因表达模型进行分析，结果表明：SCHI在种子低温吸胀18～24小时期间诱导表达量最高，而当种子低温吸胀24小时后转入常温下，其表达量在常温下18小时左右迅速下降；ABA (100μM)、PEG (30%，10000)及NaCl (250mM)能够诱导SCHI的表达，在诱导表达量上，ABA和PEG诱导效果最明显，而NaCl能够微弱的诱导此基因表达；对不同生态型的大豆品种而言，低温吸胀过程中，SCHI在非敏感型种子中的表达量高于敏感型种子，但非敏感型和中间型之间没有差别；另外，SCHI在大豆胚轴中是诱导型表达，在叶片和根尖中则是组成型表达。SOL34的表达在萌发前24小时内被低温诱导，但在不同生态型之间没有差别。SOL34在胚轴和根尖中受低温诱导，在叶片中是组成型表达。 第四，SCHI能够在原核生物中表达出相应蛋白，诱导表达蛋白的分子量在26-29KD，大约为理论值的2倍，说明在大肠杆菌中被表达的蛋白以2聚体形式存在。另外低温试验结果表明SCHI能够提高菌落忍耐短时间-20℃低温的能力。 第五，利用双元表达载体把SCHI转入拟南芥植株，经过低温、干旱和盐胁迫后，转基因植株的成活率均高于野生型植株。超表达SOL34的拟南芥植株降低了对低温的耐性；而抑制拟南芥中L34的表达反而提高了植株对低温的抗性。 第六，本试验利用蛋白质等有关试验检测了大豆种子低温吸胀时蛋白质发生的变化。从吸胀 (4℃和22℃下24h)后的大豆胚轴中成功鉴定出上调蛋白点25个，下调蛋白点15个。其中有参与能量代谢反应 (占10%，例如柠檬酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等)、细胞生长与分裂相关反应 (20%，例如LEA蛋白和种子成熟蛋白PM26)、胁迫反应 (10%，如乙醇脱氢酶)、种子宿命和贮藏蛋白 (20%，大豆球蛋白)等蛋白在此过程中发生了变化，暗示种子萌发前期低温吸胀过程中多种代谢发生变化。细胞生长变缓、能量代谢增强、胁迫代谢蛋白的高表达以及贮藏蛋白降解速度减慢等变化都有利于种子在吸胀过程中度过低温环境，为以后的生长作好准备。

Identification and molecular cloning of a novel neuromedin U analog from the skin secretions of toad Bombina maxima

Amphibian skin contains rich neuropeptides. In the present study, a novel neuromedin U (NmU) analog was isolated from skin secretions of Chinese red belly Load Bombina maxima. Being 17-amino acids long, its primary structure was established as DSSGIVGRPFFLFRPRN-NH2, in which the C-terminal 8-residue segment (FFLFRPRN) is the same as that of rat NmU, while the N-terminal part DSSGIVGRP shows a great sequence variation compared with those of NmU peptides from different resources. The peptide, named Bm-NmU-17, was found to elicit concentration-dependent contractile effects on smooth muscle of rat uterus horns. The cDNA Structure of the peptide, as obtained by a 3'-RACE strategy and subsequently cloning from a skin cDNA library, was found to contain a coding region of 438 nucleotides. The encoded precursor is composed of 145 amino acids with a single copy of Bm-NmU-17 located towards the C-terminus. The sequence of the peptide is preceded by a dibasic site (Lys-Arg) and followed by the sequence of Gly-Arg-Lys, providing the sites of cleavage and releasing of the mature peptide. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

腐生型眼虫Astasia longa 两种TIM 同工酶cDNA的克隆和分析

　利用3′2 RACE 和5′2 RACE 技术, 从腐生型眼虫长变胞藻( Astasia longa) 克隆了磷酸丙糖异构酶 ( TIM) 的两个同工酶cDNA 全序列。分析表明: 它们分别编码定位于细胞质的胞质型TIM (cTIM) 和定位于质 体的质体型TIM (p TIM) ; 后者的N 端具有引导该酶定位到质体中去的典型“前导序列”。根据这些事实我们推 测腐生型眼虫A . longa 质体中可能存在功能性的TIM , 并进一步认为该质体可能不只是一般意义上的“叶绿体 退化的残迹”, 而仍是一种至少有TIM 参与其代谢活动的功能性细胞器[动物学报50 (3) : 414 - 419 , 2004 ] 。