五数苣苔(Bournea leiophylla)次生辐射对称花形成的分子机制和进化发育生物学研究

被子植物中，花对称性进化的一个重要方面就是从两侧对称向次生辐射对称的演化。唇形目是被子植物中以两侧对称花为主的类群，次生辐射对称花频繁发生。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草(Antirrhinum majus)和少数其他种外，从两侧对称花向次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳川鱼(Linaria vulgaris)中，腹部化反常整齐花的形成各自是由于CYC和LCYC的沉默所引起，这些基因沉默分别是由于转座子插入和DNA广泛甲基化所导致。在豆科(legumes)中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在所有五个花瓣均有表达，这相似于金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花。然而，自然界中起源于不同的两侧对称花支系的许多次生辐射对称花好像并不是因为简单的花对称性基因功能丢失或者获得。因此，以模式植物突变体表型特征的分子机制作为研究出发点，通过对自然发生的次生辐射对称花进行详细研究探讨，有可能揭示两侧对称花向次生辐射对称花转变的新的演化途径，包括花对称性发育过程中不同基因的参与以及他们的表达在时间上的变化等。 苦苣苔科(Gesneriaceae)是唇形目(Lamiales sensu lato)其他类群的姊妹群, 以较弱的两侧对称花为特征，并拥有相当数量的次生辐射对称花种类;该科所拥有的辐射对称花属在唇形目所有科中占的比例最大。在苦苣苔科中，五数苣苔(Bournea leiophylla)是次生辐射对称花类群中具有两侧对称痕迹的代表类群，其花的发育过程显示出五数苣苔花经历了由花器官发育早期的两侧对称向成熟时期辐射对称的形态转变。这种发育模式暗示着五数苣苔的花可能起源于一个两侧对称花祖先;五数苣苔中控制花背腹非对称性的CYC类基因应该是有功能的，至少在花发育的早期是这样的。由于苦苣苔科和婆婆纳科(Veronicaceae)(金鱼草属于婆婆纳科)亲缘关系较近，而且CYC类基因的基本功能之一是导致背部雄蕊退化;因此五数苣苔中辐射对称花的形成很可能既不是由于CYC类基因失去，也不是因为CYC-类基因功能获得延伸或加强所致。在五数苣苔花发育过程中，从早期的两侧对称到成熟花的辐射对称的发育转变可能牵涉到TCP和MYB基因家族成员相互调节作用在时间和空间上的改变。因此，五数苣苔是探讨被子植物中次生辐射对称花新的进化途径的一个理想的候选材料。针对解决这一问题，我们对五数苣苔花进行了以下实验研究： 1 花器官发生过程的观察 成熟的五数苣苔花是辐射对称花，但是对花发育过程中花原基电镜扫描结果表明：在花器官起始和发育的早期，五数苣苔花是显著的两侧对称;但是随着进一步发育，这种两侧对称性逐步减弱，最后形成具有微弱两侧对称性痕迹的辐射对称花。 2 花对称性基因的克隆 我们应用RACE技术克隆得到了五数苣苔花对称性同源基因：BlDIV1、BlDIV2和BlRAD的翻译区全序列及其上下游非翻译区，得到了BlCYC1的3‘端翻译区和非翻译区序列。为了确定这些基因内含子的有无和位置，我们也从DNA中得到了相应同源基因的DNA序列，并且补全了BlCYC1的5‘端序列。同时也克隆到了一个没有在mRNA中得到的CYC同源基因BlCYC2。在该实验中我们第一次在金鱼草以外的类群中克隆得到了DIV和RAD的同源基因。 3 序列比较和分子系统发育分析 运用不同的比较软件和分子系统发育分析工具对五数苣苔的花对称性基因进行了比较和分析。结果表明：五数苣苔各种类型的花对称性基因和金鱼草的花对称基因在序列上是高度同源的，在分子系统发育上是非常近缘的。暗示着五数苣苔花对称性基因和金鱼草花对称性基因功能上的同源性。 4 花对称称性基因表达模式的分析 我们第一次运用组织原位杂交和RT-PCR技术对在金鱼草以外类群中所有已知类型花对称性同源基因的表达模式进行了实验研究。结果表明：五数苣苔花对称性基因的表达模式在花发育的早期类似于金鱼草;但是早期以后，BlCYC1和BlRAD被负调节，BlDIV的表达特异地在每个花瓣侧部边缘表达;这种表达结果和花的形态发生过程有很好的吻合。 上述研究表明：和金鱼草花对称基因的表达模式相比，五数苣苔三种类型花对称性基因在花发育过程中的时间和空间表达模式发生了改变;并且这种表达模式变化和五数苣苔花对称性由发育起始时期的两侧对称向成熟时期的辐射对称的转变是相互关联的。五数苣苔具有两侧对称性痕迹的辐射对称花和其他类群辐射对称花的比较显示：在五数苣苔中发育早期的两侧对称性应该是两侧对称性的遗迹;这是由于BlCYC1和BlRAD基因早期表达的保守性造成的。我们的结果揭示了一个新的花对称性演化路径：在花发育过程中，被CYC-like基因推动的RAD和DIV同源基因之间相互调节作用在时间和空间上的变化是花对称性从两侧对称向辐射对称转变或演化的基础;我们的发现还预示着：在一个调节网络的动态变化过程中，一个预先存在的两侧对称发育程序的修饰调节可能在被子植物次生辐射对称花多样性的形成中扮演重要角色。

基于TCP和MYB基因的表达模式，试探四数苣苔（Bournea sinensis）(苦苣苔科)中次生辐射对称花形成的进化发育途径

花对称性，作为花器官的一个基本而又非常重要的特征，它的进化发育过程，越来越吸引着科学家们的注意力。次生辐射对称花的形成也越来越受到关注。然而在分子发育水平上，除了模式植物金鱼草（Antirrhinum majus）和少数其他种外，次生辐射对称花演化的机制仍然是一个巨大的未被探索的领域。 在金鱼草和柳穿鱼（Linaria vulgaris）中，腹部化反常整齐花的形成各自是由CYC和LCYC基因沉默所致，二者基因沉默分别是由于转座子的插入和DNA广泛甲基化所导致;而在豆科（legumes）中，辐射对称花的形成是由于legCYC基因在五个花瓣上都有表达，这种情况和金鱼草中CYC基因同源异位表达所形成的背部化辐射对称花相似。然而，自然起源的两侧对称花支系中的次生辐射对称花的形成似乎并不是简单的花对称性基因功能丢失或获得。自然形成的次生辐射对称花究竟可能经历了怎样的进化途径？对此，我们选择了广义唇形目（Lamiales sensu lato）中苦苣苔科（Gesneriaceae）植物——四数苣苔（Bouenea sinensis）作为研究对象，通过和模式植物金鱼草的突变体中花对称性基因表达特征比较，结合其近缘种——五数苣苔（Bournea leiophylla）中DIVARICATA在时间和空间上的表达特征，试图揭示苦苣苔科中可能的两侧对称向次生辐射对称花转变的新的演化途径，以及在这种进化过程中所产生的可能的器官丢失或融合现象。 四数苣苔和五数苣苔同属于苦苣苔亚科（Cyrtandroideae）苦苣苔族（Trib.Ramondeae Eritsch）中的四数苣苔属（Bournea Oliv）。该属仅仅有两个种——四数苣苔和五数苣苔，它们都是次生辐射对称花类群中的典型代表，而且两者花发育过程都显示出了由腹部向背部顺序发生和生长的特征。然而和五数苣苔相比，四数苣苔花瓣和雄蕊数目分别少了一枚，拥有四枚花瓣（背部花瓣两枚、两侧花瓣两枚）和四枚雄蕊（背部雄蕊一枚、两侧雄蕊两枚、腹部雄蕊一枚）。从形态特征比较来看，很有可能是四数苣苔在次生辐射对称花形成的过程中，发生了腹部花瓣的丢失和两枚腹部雄蕊愈合成了一枚较大的腹部雄蕊。那么，我们推测在四数苣苔次生辐射对称花形成过程中，花对称性基因即CYC类和DIV类基因在分子水平上发生了变化，这种变化和四数苣苔中次生辐射对称花的形成有关。 基于上述考虑，我们开展了对四数苣苔中花对称性基因——BsCYCLOIDEA、BsDIVARICATA、BsRADALIS以及BsCYCLIND3四个基因共9个拷贝进行了在花组织中表达模式研究。我们在四数苣苔中共分离到了五个拷贝的CYC类基因，分别命名为BsCYC1C-1、BsCYC1C-2、BsCYC1D、BsCYC2A、BsCYC2B。这五个拷贝在保守的TCP区和R区保持了高度的同源性。BsDIV的两个拷贝BsDIV1、BsDIV2也是如此，在保守的两个区domain I、domain II，尤其是在那些螺旋和环结构处，保守性相当高。组织原位杂交结果显示，BsDIV在四数苣苔中的表达非常特别，在金鱼草和五数苣苔中该类基因的表达分两个不同时期，即早期表达和晚期特异性表达，BsDIV在四数苣苔中似乎没有早期表达模式或者在很早期就已经进入到了晚期的表达模式。它在四个花瓣的两侧边缘和四个雄蕊上均等表达，而且这种表达持续时间相对比较长。组织原位杂交结果也得到了RT-PCR结果的支持。有趣的是BsRAD的RT-PCR结果显示，BsRAD在晚期花瓣上只在背部表达，但是在雄蕊上的表达却和金鱼草中AmRAD在背部区域表达不同，它的表达从背部延伸到了两侧和腹部。BsRAD在花器官的第二轮和第三轮的表达显然发生了分化。这种现象可能暗示着BsRAD功能发生了分化。BsRAD和BsDIV在腹部雄蕊上精细的时间空间调控关系可能正是导致腹部雄蕊愈合的原因。RT-PCR结果并没有检测到BsCYC2在晚期花上的表达。原位杂交结果显示BsCYC2在第8期以后表达就基本消失了，从而验证了RT-PCR结果。BsCYC2在早期花原基和早期花器官上都是均匀表达，但在表达消失之前，它在花瓣裂片和花冠筒的分界处则有表达信号，BsCYC2可能和调控花冠筒高度有关。根据Almeida 和 Galego（2002）所说，花冠筒高度的改变依赖于CYC 、DIV基因和其它非主动生长决定因子之间的相互作用。BsCYC1C晚期的RT-PCR结果显示它在背部花瓣、背部雄蕊和两侧雄蕊上均有表达信号，但在腹部花瓣和雄蕊上则没有表达信号，这似乎和四数苣苔由腹部向背部顺序发育的形态特征相符合，说明BsCYC1C可能起到了抑制背部花瓣和背部雄蕊生长的作用。

烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）两侧对称花的进化发育途径

被子植物菊亚纲原始类群的花为辐射对称花，伴随着适应性进化和传粉者的专性化，两侧对称花随之出现并快速进化和多样化。与花对称性相关的基因首先在模式植物金鱼草中被分离出来，它们包括TCP 基因家族的两个基因Cycloidea（CYC）和Dichotama（DICH），MYB 基因家族的两个基因Radialis（RAD）和Divaricata（DIV）。模式植物金鱼草的分子发育与遗传学研究初步揭示出在花对称性形成过程中相关调控基因的功能、表达模式及其相互作用机制。研究表明，金鱼草花中CYC 和DICH 基因只在背部表达，控制背部属性。DIV基因早期在所有部位表达，但只影响腹部属性。CYC 和DICH 通过激活与DIV具有颉抗作用的RAD 基因在背部的表达来抑制DIV 基因在背部的作用从而构建了金鱼草的两侧对称花。但是，被子植物繁杂多样的花对称性远非一种模式植物所能概括。此外，被子植物花对称性的演化也是一个悬而未决的问题。要全面了解被子植物花对称性的起源、多样化及其背后的决定机制，有必要进一步研究不同类群中花对称性相关基因的功能变化和进化式样。 苦苣苔科（Gesneriaceae）与金鱼草所属的车前科（Plantaginaceae）同属于菊亚纲的广义唇形目。研究表明广义唇形目的祖先已经具有了两侧对称花，苦苣苔科是广义唇形目的基部类群，具有与唇形目两侧对称花早期分化相关的各种两侧对称花类型。因此，在苦苣苔科选择两侧对称花代表类群开展花对称性的进化发育生物学研究十分有助于探讨苦苣苔科花对称性基因在两侧对称花类群的调控进化，从而揭示广义唇形目基部类群花对称性的进化发育模式。我们选择苦苣苔科两侧对称花类群烟叶唇柱苣苔（Chirita heterotricha）为主要研究材料。烟叶唇柱苣苔是苦苣苔科两侧对称性比较强烈的类群，主要体现在其只有腹部两枚雄蕊能育，背部和侧部雄蕊均败育，与金鱼草的近亲沙漠幽灵花（Mohaveae confertiflora）的形态类似。在沙漠幽灵花中CYC 类基因的表达从背部延伸到了侧部，但是在烟叶唇柱苣苔中是否遵循同一模式还是存在其他途径这是我们的主要研究目的。此外，我们发现在烟叶唇柱苣苔花序的顶花中偶尔会发生腹部化的辐射对称突变花。在金鱼草和柳穿鱼中，CYC 类基因的失活导致了辐射对称突变花的产生，而在豆科植物Cadia purpurea 中，CYC 类基因的活性从背部延伸到了侧部和腹部，导致了辐射对称花的形成。烟叶唇柱苣苔中的情形则值得我们关注。再者，革叶粗筒苣苔（Briggisia mihieri）是烟叶唇柱苣苔的近缘类群，但它具有四枚能育雄蕊（侧部和腹部各两枚）。苦苣苔科两能育雄蕊类群被认为起源于四能育雄蕊类群。我们在烟叶唇柱苣苔野生型两侧对称花和辐射对称突变花中开展花对称性基因的表达模式研究，结合在革叶粗筒苣苔中的研究，试图揭示烟叶唇柱苣苔两雄蕊类两侧对称花形成的分子机制和进化发育途径。 本研究从烟叶唇柱苣苔中分离到4 个CYC 类基因（ChCYC1C，ChCYC1D，ChCYC2A，ChCYC2B），2 个DIV 类基因（ChDIV1，ChDIV2）和2 个RAD 类基因（ChRAD1，ChRAD2）。从革叶粗筒苣苔中分离到4 个CYC 类基因（BmCYC1C，BmCYC1D，BmCYC2A，BmCYC2B），2 个DIV 类基因（BmDIV1，BmDIV2）和1 个RAD 类基因（BmRAD1）。序列和系统发育分析结果显示它们均为花对称性基因。进一步的表达分析显示结果表明：（1）不同拷贝CYC 类基因的表达存在着分化，与其氨基酸序列的分化一致；烟叶唇柱苣苔的CYC 类基因表达从背部延伸到了侧部而革叶粗筒苣苔的CYC 类基因仅在背部表达，与它们的形态分化密切相关。（2）DIV 类基因在种内两个拷贝以及种间的表达无明显的分化，在花的各个部位都有表达。（3）烟叶唇柱苣苔两个拷贝的RAD 类基因的表达存在分化；两个种的同类RAD 类基因的表达也存在分化。这些花对称性基因的表达模式分析揭示了它们在烟叶唇柱苣苔和革叶粗筒苣苔两侧对称花形态建成以及二者花形态的演化中具有重要作用。 同时，我们对烟叶唇柱苣苔的辐射对称突变花进行了自交和F1 代培育，但是F1 代没有出现稳定的辐射对称突变株。我们从辐射对称突变花中分离到的CYC 类、DIV 类和RAD 类基因的核苷酸序列与野生型的完全一致。说明突变体的产生与序列变异无关。RT-PCR 分析表明突变花中CYC 类基因全部失活，而DIV 类基因和在腹部表达的RAD 类基因的表达信号有所增强，这与其腹部化辐射对称的形态相一致。这进一步证实了花对称性基因在烟叶唇柱苣苔花形态建成中的作用。

冬小麦春化过程中低温诱导的开花特异mRNA及蛋白质的合成

本实验以冬小麦“农大139”（T. aestivum L. cv. Nongda 139）为材料对春化作用诱导开花的分子机制作了一些探讨，主要结果如下： 1. 应用SDS-PAGE及高分辨双向电泳技术，比较了冬小麦给予春化、脱春化及超期春化处理后的电泳图谱，并结合对春小麦对照样品的分析，结果发现有一些蛋白质和春化作用紧密相关，它们随春化而出现、随脱春化而消失，并在不经低温处理即可以开花的春小麦对照中存在。也就是说，这些开花特异的蛋白质（FSPs）的存在或在诱导下的合成和小麦抽穗开花能力的获得存在一种正相关，因此推测它们在冬小麦由营养生长状态向生殖生长状态转变的过程中起了关键性的作用。 2. 从不同处理的及对照样品中提取mRNA进行体外翻译的结果表明：春化作用过程中低温诱导了mRNA组分的变化，其中一些新产生的mRNA种类与春化诱导的开花能力的获得呈高度相关，即它们是开花特异的（Flower Specific），它们中有的只在春化的特定时期存在并起作用。 3．比较体内分析及体外翻译的结果发现，一些开花特异蛋白质（FSPs）可以同时在体内提取物及体外翻译产物中检测到，因此，春化作用中开花特异蛋白质诱导合成的调节很可能发生在转录水平上。 4．基于以上结果的分析可以推测春化诱导开花是低温导致了开花特异基因表达的结果，超期春化的效应不能被脱春化所逆转则系编码这些开花特异蛋白质的基因在长期低温条件下转变成了组成性表达所致。 有关低温诱导产生的开花特异蛋白质的性质与功能及编码这些蛋白质的基因尚需进一步研究。

水稻花发育相关基因RA68和OsUBP1的分离与功能分析

　　　　　　　　　　　　　　　　　第一部分 利用减法杂交和RACEs从水稻中克隆了一个编码含有脯氨酸和苏氨酸丰富结构域多肽的cDNA,其相应的基因被命名为RA68。RA68由3个外显子和2个内含子组成，编码的蛋白由219个氨基酸残基组成。该蛋白由一个21个氨基酸残基组成的信号肽，一个亲水性的N－端结构域和一个疏水性的C－端结构域组成。 N端结构域是一段嵌合PTPTSYG motif的富含脯氨酸和苏氨酸的序列。 Southern杂交和序列分析结果表明RA68在水稻基因组中以单拷贝存在，定位于第2号染色体。Northern杂交结果表明RA68在幼芽和花中表达量较高，在根和叶中不表达。原位杂交分析结果表明：在幼苗期RA68 主要在幼芽胚芽鞘的内外层细胞和幼叶原基的表层细胞中表达;转入生殖生长期后，在花序分生组织、枝梗原基顶端、花器官原基、大孢子囊和花粉粒中表达。用GFP作报告基因，用洋葱表皮细胞进行的瞬间表达测试结果显示RA68蛋白定位于细胞核中。转反义RA68水稻植株抽穗期比对照野生型延迟30天左右。这些结果表明RA68可能是水稻花分生组织特征基因，在成花转变过程中起作用。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第二部分 通过RACE和RT-PCR方法分离了水稻OsUBP1基因，其推测编码蛋白含有UBP结构域（Cys Box和His Box）和TopⅥA结构域。RT-PCR分析结果表明OsUBP1在转录过程中通过可变剪接产生多个不同的转录本，这些转录本在叶、根、颖花和幼芽中存在着时空调节表达模式，每种组织中的转录本是不一样的。这些转录本内含子剪切位点除了经典的GT-AG外，还有GC-AG、CT-AC、TT-GA、GT-GA和CT-GA。由于发生了GC-AG的可变剪切产生了OsUBP1的重要功能结构域Cys Box。水稻OsUBP1基因和OsSPO11-1基因位于11号染色体的同一基因座位上。原位杂交分析表明，在花中OsUBP1 mRNA 主要在药壁绒毡层、花粉粒、大孢子囊和颖花底部维管束中表达。转反义OsUBP1植株大多不能正常结实，这说明OsUBP1可能参与水稻的育性调节。 关键词

MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

果实对酵母拮抗菌和外源水杨酸诱导的抗病性应答机理

用生物和非生物因子来进行采后病害的防治，是一个非常有效的方法。诱导抗性作为控制果蔬采后病害的生物技术，已成为该领域的一个研究热点。然而诱导抗性的机制非常复杂，涉及到寄主、病原菌、激发子之间的相互作用关系。本研究主要利用酵母拮抗菌Pichia membranefaciens和SA处理果实，观察其抗性诱导表达和对采后青霉病菌（Penicillium expansum）的抑制作用，并从蛋白质组学水平上对诱导抗性的机理进行了分析。研究结果表明： 1、酵母拮抗菌P. membranefaciens (5 × 107 cells·ml-1)和SA(0.5 mM)处理采后甜樱桃果实，能够明显地降低病害的发病率和病斑直径。酵母菌和SA处理影响到了果实抗氧化酶的活性，同时还改变了POD同工酶谱和甜樱桃果实的总蛋白含量，并诱导了新的蛋白质条带产生。用光学显微镜和扫描电子显微镜技术观察发现，在in vitro条件下P. membranefaciens能够紧密地结合与病原菌的菌丝，而在in vivo条件下这种结合较为松散。 2、借鉴其它模式植物的方法，我们建立了一整套适用于多汁类植物材料的蛋白质组学研究方法。对于芒果，桃，甜樱桃、苹果以及冬枣等果实，都取得了重复性非常好的2-D图谱。我们应用该技术进一步研究了P. membranefaciens (1 × 108 cells·ml-1)以及SA (0.5 mM)处理对桃果实蛋白质组的诱导影响。结果显示，两种激发子处理都能够诱导桃果实产生抗性，从而减轻青霉病引起的腐烂。在诱导处理1 d以后，酵母拮抗菌和SA分别诱导22和16个蛋白的差异表达。质谱鉴定的蛋白属于6大类：代谢，防御反应，转录，能量途径以及细胞结构。有6个蛋白受到两种激发子的共同调控。其中，4种蛋白(包括glutathione peroxidase, polyphenol oxidase precursor, catalase和methionine sulfoxide reductase) 属于抗氧化蛋白，涉及到活性氧代谢。另2个蛋白（Major allergen Pru av 1和peroxidase）是病程相关蛋白，直接参与植物的防御反应。同时一些磷酸化酶和转录因子也受到两种激发子的调节从而参与果实的抗病反应。酶学测定和Northern杂交的结果表明，拮抗菌与SA处理均能影响过氧化氢酶活性及其基因的表达。 3、采前用较高浓度SA (2 mM) 短时间（10s）处理不同成熟期的甜樱桃果实，能够明显降低果实青霉病的病斑直径，并能减轻较低成熟度果实的发病率。在没有接菌的情况下，SA诱导了33个差异表达的蛋白，其中用质谱鉴定出了26个。而在接种病原菌的情况下，SA诱导了19个差异表达的蛋白，并鉴定出了其中的12个。这些蛋白分别涉及到代谢、防御反应、转录、能量途径、信号转导等过程。在没有接种病原菌的情况下，SA处理诱导了Putative DnaJ heat shock protein, PR1-like protein, Peroxidase, Major allergen Pru av 1 (Pru a 1)和Catalase等与抗病有关的蛋白。而在接种病原菌的情况下，诱导了PR1-like protein, Peroxidase和Catalase蛋白的差异表达。通过酶活性测定以及对细胞学定位的研究，我们发现在没有接种病原菌的情况下，POD的活性受到SA的诱导。但是在接种病原菌以后，诱导效果不明显。

小麦TaRanBP基因功能的初步分析

小G蛋白（small GTPases）是真核生物中广泛存在的一类调节各种生命活动的信号分子。根据结构与功能的不同，小G蛋白家族成员可分成五个亚家族，分别为Ras，Rab，Rho，Arf和Ran。五类小G蛋白通过其活化态（GTP结合态）和非活化态（GDP结合态）的相互转换行使着各种功能。Ras GTPases在酵母和哺乳动物中调节细胞增殖过程; Rho GTPases调控肌动蛋白重组过程，并参与MAP 激酶的细胞信号转导过程等; Rab GTPases和Arf GTPases分别在膜转运过程中起着不同的重要作用;而Ran GTPases则在核孔位置调节着蛋白和RNA分子的运输过程。 小G蛋白附属蛋白调节着小G蛋白活化态与非活化态之间的转换，其中鸟核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)可以催化小G蛋白转换为GTP结合形式，即活化态;而GTPase 激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)和小G蛋白结合蛋白(small GTPases binding proteins)可以激活小G蛋白自身的水解活性，从而将其转变成非活化态形式。 相比其它小G蛋白，Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物中的研究相对较少。已有的成果表明它们主要在核质运输过程中及对相应的信号转导途径起调节作用。而针对Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物尤其是高等植物个体发育过程中的作用，目前报道还很少。 为了揭示Ran结合蛋白(Ran binding protein, RanBP)在植物发育过程中的作用，本文通过转基因手段对其功能进行 了研究。在此之前，本实验室已从小麦cDNA文库中成功克隆Ran结合蛋白基因：TaRanBP。该基因cDNA全长1035 bp，编码207个氨基酸。通过农杆菌介导叶圆片法，分别用正义、反义及TaRanBP与GFP融合蛋白等表达载体转化烟草，并成功获得转基因植株。亚细胞定位观察发现TaRanBP蛋白主要定位于细胞质内，尤其是在核膜附近富集。生理学和细胞学等方面的研究分析发现，TaRanBP基因在烟草个体发育过程中产生重要作用。过量表达TaRanBP基因的转基因植株在一定数量上表现出愈合的花冠筒上出现不同程度开裂，花冠筒上有附生舌状花瓣，及带有花瓣状颜 色的花萼等异常花表型。同时，转反义基因在一定程度上促进了转基因植株初生主根的生长（为对照烟草的2.3倍），而转正义基因烟草与对照烟草的初生主根长度差异不明显。用碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)进行根部细胞染色。观察发现，不同的转基因烟草与对照烟草之间在根的各个不同形态区域的细胞大小差异不明显，推测根长的差异可能是由于整体细胞数目变化的原因导致。向重力性实验发现，转反义基因烟草幼苗较对照烟草的向重力性反应增加，而转正义基因的则表现为降低。激素吲哚乙酸(Indoleacetic Acid, IAA)的添加处理可以恢复转反义基因烟草的向重力性异常表型，而对转正义基因烟草几乎无影响。添加激动素(Kinetin, KT)的处理发现不同转基因烟草和对照烟草的向重力性均有减弱。观测后期，转正义基因的向重力敏感性较对照烟草得到恢复。测量不同转基因株系T1代幼苗鲜重，发现不同转基因烟草和对照烟草的幼苗鲜重动态变化在各个时间点有差异，且差异情况不尽相同。而不同转基因幼苗T1代幼苗可溶性蛋白含量较对照烟草有不同程度的下降。这种下降并没有影响转基因烟草的整体生长进程，开花期和结实情况与对照烟草相比也无明显变化。

太行花MADS-box基因克隆、表达模式及功能分析

基因的重复（duplication）及其功能的多样性（diversification）为生物体新的形态进化提供了原材料。重复的基因通过表达方式和（或）编码序列的改变而导致其亚功能化（subfunctionalization）和（或）新功能化（neofunctionalization），从而使这些重复基因有可能保留在生物体中，增添生物的遗传稳定性（robustness）和多样性。MADS-box基因在植物（特别是在被子植物）的进化过程中发生了大量的基因重复事件而形成一个多基因家族。MADS-box基因家族的不同成员在植物生长发育过程中起着非常重要的作用，在调控开花时间、决定花分生组织和花器官特征，以及调控根、叶、胚珠及果实的发育中起着广泛的作用。开展对MADS-box基因家族成员的序列结构、表达模式及编码蛋白的功能研究可以为这些同源基因在生物体中的可能命运提供很好的实验依据。本研究以我国特有的蔷薇科物种太行花做实验材料，通过3’ RACE和5’ RACE方法从太行花中克隆了7个MADS-box家族的基因。序列和系统进化树分析表明这7个基因分别与拟南芥的MADS-box基因AG、SHP（SHP1/2）、PI、AP1、FUL和SEP1以及与矮牵牛MADS-box基因PhTM6具有很高的同源性并聚为一支，从而将这7个MADS-box基因分别命名为TrAG（Taihangia rupestris AG）、TrSHP（Taihangia rupestris SHP）、TrPI（Taihangia rupestris PI）、TrAP1（Taihangia rupestris AP1）、TrFUL（Taihangia rupestris FUL）、TrSEP1（Taihangia rupestris SEP1）和TrTM6（Taihangia rupestris PhTM6）。针对克隆的这些基因，具体进行了以下几方面的研究： 第一，对TrAG和TrSHP两个MADS-box基因进行了研究，它们分别属于AG亚家族中旁系同源进化系euAG和PLE进化系的成员。通过原位杂交的方法分析了旁系同源基因TrAG和TrSHP的表达方式是否发生了分化;构建组成型表达载体转化野生型拟南芥，分析了TrAG和TrSHP的编码蛋白的功能是否发生了改变;并进一步通过酵母双杂交的方法比较了TrAG和TrSHP的相互作用方式是否发生了分化。原位杂交分析表明，TrAG和TrSHP主要在雄蕊、心皮和胚珠中表达。在花发育过程中，TrAG起始表达比TrSHP早，在随后将形成雄蕊和心皮原基的分生组织区域以及雄蕊原基中表达;然而直到雄蕊原基出现前未检测到TrSHP的表达。在雄蕊原基形成之后，TrAG和TrSHP在发育的雄蕊、随后将产生心皮原基的分生组织区域以及心皮原基中表达。在花发育的晚期，TrAG在发育的柱头、花柱以及胚珠中均有表达，而TrSHP仅在胚珠中表达。35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株表现出相似的表型，包括开花提前;莲座叶和茎生叶向腹卷曲、变小;花芽在时期13前即开放，萼片包裹不住花芽;萼片和花瓣分别被同源异型转化为心皮化和雄蕊化器官，并在萼片向腹面产生异位的胚珠;在茎生叶上产生柱头化的乳突和胚珠;子房弯曲;果实提前沿着开裂区裂开，暴露出胚珠。此外，也观察到35S::TrAG和35S::TrSHP转基因拟南芥植株的一些表型差异，35S::TrAG转基因拟南芥植株花芽呈暗绿色，而35S::TrSHP转基因拟南芥植株花芽呈黄绿色;不同与35S::TrAG转基因植株表型的是，35S::TrSHP转基因拟南芥植株花被脱落受到了抑制，偶尔可以观察到花丝基部融合，果实变短、育性降低。酵母双杂交分析表明TrAG可以与TrSEP3相互作用，而TrSHP不能与TrSEP3形成异源二聚体。以上研究结果表明做为旁系同源基因，TrAG和TrSHP在表达方式上发生了改变，在蛋白编码序列上保持了其祖先的功能，但是编码序列的一些差异还是导致它们之间生化作用方式的不同和一定程度上的亚功能化。基于以上研究结果并结合先前报道的在拟南芥、金鱼草和矮牵牛等物种中旁系同源基因的表达和功能数据，我们提出在不同物种中旁系同源基因在进化过程中维持部分功能冗余（redundant），但是也通过改变表达方式、编码蛋白的功能及蛋白相互作用方式呈现出不同形式的亚功能化和（或）新功能化。 第二，对TrPI基因的功能也进行了初步研究，它属于AP3/PI亚家族PI-like进化系的成员。原位杂交结果表明，TrPI主要在花瓣、雄蕊和胚珠中表达。显示出TrPI与拟南芥同源基因PI保守的表达模式。35S::TrPI转基因拟南芥植株莲座叶发生延迟、变小、并且第一至第三片莲座叶呈白色针状;莲座叶和茎生叶并不像野生型呈有规则的螺旋状排列;花序茎基部、中间或顶端发生2-3个分支;在茎生叶的叶腋内的花序抽出时间明显晚于野生型，并且很小甚至不能完全抽出而藏在叶腋内。低温条件下转基因植株莲座叶的表型更加明显，表现为莲座叶变为针状，无叶片，仅有叶柄结构。这明显不同于35S::PI转基因拟南芥植株的表型。此外，酵母双杂交分析表明TrPI自身可以形成同源二聚体。这种相互作用方式也不同与拟南芥中PI的相互作用方式。以上研究结果表明，TrPI可能与拟南芥PI具有保守的表达模式但编码的蛋白可能获得了新的功能。 第三，构建了一个AP1-like基因（TrAP1）的过量表达载体，转化野生型拟南芥植株，通过反向遗传学分析了TrAP1的功能。35S::TrAP1转基因拟南芥植株开花提前;花序以两朵花终止，形成terminal flower的表型;偶尔可以观察到雄蕊转化为花瓣化的器官;莲座叶呈黄绿色并且其边缘呈锯齿状。酵母双杂交分析表明TrAP1蛋白自身可以形成同源二聚体。这些结果表明TrAP1可能与拟南芥同源基因AP1具有保守的功能。

观赏向日葵（Helianthus annuus L.）花色及其花青素的研究

观赏向日葵作为一种新型花卉，具有巨大的市场开发潜力。而花色作为向日葵的重要观赏性状之一，对其的研究却比较少。本文从向日葵花色多样性、花色遗传规律、花色与虫媒传粉的关系及其对向日葵花色遗传的影响做了分析和讨论，利用英国皇家园艺学会比色卡和分光色差仪对向日葵的花色做了归类总结，并且利用高效液相色谱法对向日葵的花青苷成分做了分析研究。 本研究结果表明，彩色向日葵色系可以分为两大类，即黄色系和红色系，其中红色系向日葵的花色变异较小;而黄色系向日葵的花色变异较大，可以再细分为橙黄色和柠檬黄色两个亚类。利用高效液相色谱法测定了39份向日葵舌状花瓣中的花青苷大概有9种(A、B、C、D、E、F、G、H、I)，这9种花青苷并不是在所有39份样品中都出现，且红色系向日葵中花青苷的种类较多。花青苷G在红色系和黄色系向日葵中均被检出。对红色向日葵花瓣的花青苷提取液进行多级质谱分析发现，花青苷元类型主要是矢车菊苷元，其糖苷类型主要是和葡萄糖、鼠李糖和/或阿拉伯糖结合;而在纯黄色的向日葵中通过多级质谱分析未检测到这些花青苷，说明矢车菊类花青苷是红色向日葵舌状花红色形成的化学基础。

牡丹花芽分化类型与促成连续二次开花

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.），芍药科芍药属植物，是我国的传统名花，因花朵硕大、花色丰富、花型齐全而显雍容华贵、富丽端庄，“惟有牡丹真国色，花开时节动京城”，深受人民的喜爱。人们在欣赏牡丹的过程中，一方面为其艳丽多姿而赞叹，同时又为其自然花期较短且集中而遗憾，“弄花一年，看花十日”，因此，如何通过栽培等技术措施使牡丹连续开花，一直是牡丹研究者探索的重要课题。近年，在对牡丹栽培的系统研究中，发现不同牡丹品种的花芽分化类型（数量、梯度）直接影响其开花数量和开花次数。为了有效地利用不同类型的牡丹，选育出更多的丰花、同株可连续开花的品种，服务于牡丹的产业化生产，本试验对4个牡丹品种群的135个品种进行了同枝条芽数的统计分析及花芽分化梯度的划分，阐明了花芽分化类型与促成连续二次开花的关系。初步测定了具有促成连续二次开花习性的牡丹品种‘High Noon’不同芽位腋芽内源激素的含量，揭示了牡丹同株连续二次开花过程中不同芽位腋芽内源激素的生理变化规律，为解决牡丹同株花期短、不能同株连续开花的难题奠定了理论基础。本研究主要结果如下： 1、牡丹花芽分化类型与自然开花的关系 通过对135个牡丹品种花芽分化数量和梯度类型的调查，将同枝条的芽数聚类为少（3-4）、中等（5-7）、多（8-10）三类;将花芽分化梯度划分为小、中、大三种类型。芽数类型和花芽分化梯度类型均与品种群有一定的关系。中原品种群中90%的品种属于芽数少的类型，47%的品种属于分化梯度大的类型;日本品种群中73%的品种属于芽数中等的类型，52%的品种属于分化梯度中的类型;法国品种群和美国品种群品种调查数量较少，但大多数品种属于芽数中等的类型，分别占80%和44%，分化梯度小的品种分别占调查总数的40%和67%。绝大部分品种的腋花芽因在枝条上着生的位置不同而有明显的异质性，上部芽顶端优势强，萌动率和开花率均高，芽数多的品种中、下部芽在春天自然开花季节常处于休眠状态。 2、牡丹花芽分化类型与促成连续二次开花的关系 花芽分化数量的多少与梯度的大小直接影响着开花次数。花芽分化数量少、梯度大的品种不建议直接用于同株促成连续二次开花栽培;花芽分化数量中等或多、梯度小的品种可以实现同株促成连续二次开花，10个试验牡丹品种中的中原牡丹品种‘如花似玉（Ru Hua Si Yu）’和美国牡丹品种‘High Noon’具有同株连续二次开花能力，且二次开花率达75%以上，两次开花品质均优良。 3、‘High Noon’不同芽位腋芽内源激素与促成连续开花的关系 通过测定美国牡丹品种‘High Noon’同枝条不同芽位腋芽萌动前期、后期内源激素含量，结果表明：萌动后期不同芽位腋芽的GA3、IAA、ZRs含量增加，尤其1位芽、2位芽含量增加显著;萌动后期ABA含量则随着芽位自上而下增加显著，可能是导致下部芽继续保持休眠状态的主要原因;萌动后期下部芽的ABA/ZRs配比增幅较高，说明ABA/ZRs配比与芽的生长与休眠关系密切。

槐花提取化合物K3体外抗HIV-1活性的研究

目的:研究槐花提取化合物K3的体外抗HIV-1活性,并对其抗HIV-1机制进行初步探讨.方法:采用MTT比色法检测化合物对各种细胞的毒性.用合胞体形成计数法,p24抗原捕获ELISA法及RT-PCR等多种方法研究化合物体外抗HIV-1活性.结论:槐花提取化合物K3体外有较好的抗HIV-1活性,能够抑制病毒实验株(HIV-1ⅢB,耐药株(HIV-1 74v)和临床分离株(HIV-1KM018)等多种病毒株的复制,且其作用机制是多靶点的,不仅可以抑制病毒的进入,还可以抑制HIV-1逆转录酶活性.

Synthesis and characterization of ZnO nanoflowers grown on AIN films by solution deposition

ZnO nanoflowers are synthesized on AIN films by solution method. The synthesized nanoflowers are composed of nanorods, which are pyramidal and grow from a central point, thus forming structures that are flower-shaped as a whole. The nanoflowers have two typical morphologies: plate-like and bush-like. The XRD spectrum corresponds to the side planes of the ZnO nanorods made up of the nanoflowers. The micro-Raman spectrum of the ZnO nanoflowers exhibits the E-2 (high) mode and the second order multiple-phonon mode. The photoluminescence spectrum of the ZnO nanoflowers exhibits ultraviolet emission centred at 375 nm and a broad green emission centred at 526 nm.

Synthesis and structures of morphology-controlled ZnO nano- and microcrystals

Zinc oxide flower-like bunches were directly synthesized on indium-doped tin oxide (ITO) glass substrates through a simple chemical bath deposition process. By adjusting precursor concentration, other morphologies ( spindles and rods) were also obtained. All of them are hexagonal and single crystalline in nature and grow along the [ 0001] crystallographic direction. The possible growth mechanisms for these nano- and microcrystals were proposed. It was revealed that both the inherent highly anisotropic structure of ZnO and the precursor concentration play crucial roles in determining final morphologies of the products. In addition, vibrational properties of ZnO crystals with different morphologies were investigated by Raman spectroscopy.