文蛤（Meretrix meretrix）幼虫生长发育相关基因的克隆和功能分析

贝类养殖是我国海水养殖业中最重要的组成部分之一。贝类人工大规模养殖中的关键环节是种苗的人工繁育，早期幼虫能否正常生长发育，对幼虫变态和变态后生长率及成活率有很大的影响，直接关系到生产产量和经济效益，所以，了解幼虫发育机制对于生产实践具有重要的指导意义。 文蛤（Meretrix meretrix）是一种在东亚各国沿海和滩涂地区广泛分布的双壳贝类，是我国一种重要的经济品种。本论文以文蛤幼虫为研究对象，分别对文蛤幼虫发育过程中贝壳形成相关的铁蛋白（MmeFer）、营养及变态相关的组织蛋白酶B（MmeCB）及变态过程中细胞凋亡相关的caspase三个基因进行了克隆，分析了基因及编码蛋白在担轮幼虫期（L1）、D形幼虫期（L2）、壳顶幼虫期（L3）和稚贝期（L4）的时空表达特征，解析了其可能的功能，并研究了相应酶类的特异性抑制剂作用对幼虫发育过程的影响，进行了目标蛋白的功能验证，详述如下： 研究结果显示，在文蛤胚胎发育到原肠胚时放入不含铁离子的人工海水中培养，发育成无壳的畸形，随着人工海水中铁离子添加浓度的升高，幼虫长出壳状组织接近正常状态；而发育到L1期幼虫放入不含铁离子的人工海水中培养却可以发育出正常的壳，推测铁和铁代谢相关蛋白在幼虫贝壳初始形成有重要的作用。根据构建的文蛤幼虫cDNA文库中提供的序列信息，从文蛤中克隆了与铁离子代谢密切相关的铁蛋白（MmeFer）的全长cDNA 序列；通过Real time PCR发现，MmeFer mRNA的表达量在贝壳形成前后有明显改变；整体原位杂交结果显示MmeFer mRNA在L1期的表达部位刚好是贝壳生成的起始部位，推断文蛤铁蛋白与文蛤幼虫贝壳初始形成密切相关。 利用文蛤幼虫cDNA文库中的EST信息在幼虫中克隆到文蛤组织蛋白酶B（MmeCB）全长cDNA序列；通过整体原位杂交分析发现MmeCB mRNA在L2至L4期幼虫的消化腺部位表达，而且在L2期的幼虫表皮也有表达，说明MmeCB可能和幼虫消化相关，而且可能参与幼虫从表皮摄取营养的过程。利用MmeCB特异性抑制剂（CA074Me）处理饥饿幼虫，发现其生长受到明显抑制，验证了MmeCB参与幼虫表皮营养代谢的推论。利用免疫组织化学技术，研究了MmeCB蛋白在文蛤幼虫中的时空分布，发现其在L2期幼虫表面和胃部有阳性信号，而在L3期，MmeCB在幼虫面盘基部有强烈的表达，提示MmeCB在文蛤幼虫中不仅起到营养的作用，而且可能和幼虫附着变态有关。利用CA074Me分别处理文蛤胚胎和变态期幼虫，发现抑制MmeCB的活性对胚胎发育和幼虫变态都有显著影响。研究结果提示MmeCB在幼虫发育各阶段均具有重要的生物学功能。 根据caspase在不同物种中的保守区域设计简并引物，在文蛤幼虫中扩增到cDNA序列片段；检测有活性的caspase在文蛤幼虫各发育时期的分布部位，发现其在L1至L3期幼虫中都有分布，说明整个幼虫形态变化过程中都有caspase的参与；细胞凋亡检测结果显示，幼虫主要发生细胞凋亡的部位在L3期幼虫的面盘，即变态过程中要退化的器官，说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制；用caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫，发现幼虫变态率下降，初步验证了caspase在文蛤幼虫变态过程中的作用。 通过对上述三种基因的研究，分别探讨了文蛤幼虫发育阶段中的几个主要事件（L1期到L2期的贝壳形成、L2到L3期的幼虫营养摄食及L3到L4期的附着变态）相关的基因及其功能，为研究贝类生长发育调控的分子机理提供了新的线索。

Rhein induces apoptosis and cell cycle arrest in human hepatocellular carcinoma BEL-7402 cells

Rhein, an anthraquinone derivative of rhubarb, inhibits the proliferation of various human cancer cells. In this paper, we focused on studying the effects of rhein on human hepatocelluar carcinoma BEL-7402 cells and further understanding the underlying molecular mechanism in an effort to make the potential development of rhein in the treatment of cancers. Using MTT assay and flow cytometry, we demonstrate a critical role of rhein in the suppression of BEL-7402 cell proliferation in a concentration- and time-dependent manner. The increase of apoptosis rate was observed after incubation of BEL-7402 cells with rhein at 50-200 mu M for 48 hours, and the cells exhibit typical apoptotic features including cellular morphological change and chromatin condensation. Moreover, rhein-induced cell cycle S-phase arrest. Additionally, after rhein treatment, expression levels of c-Myc gene were decreased, while those of caspase-3 gene were increased in a dose-dependent manner by using real-time PCR assay. The results demonstrate for the first time that cell cycle S-phase arrest is one of the mechanisms of rhein in inhibition of BEL-7402 cells. Rhein plays its role by inducing cell cycle arrest via downregulation of oncogene c-Myc and apoptosis through the caspase-dependent pathway. It is expected that rhein will be effective and useful as a new agent in hepatocelluar carcinoma treatment in the future.