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Ytterbium(III) and praseodymium(III) complexes of 2-carboxyethylgermanium sesquioxide (Ge-132) can hydrolyze the phosphodiester linkage of 3',5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and 3',5'-cyclic deoxyadenosine monophosphate (dcAMP). Both cAMP and dcAMP are hydrolyzed with high selectivity, yielding predominantly 3'-monophosphates. The selectivity and activity for hydrolyzing cAMP and dcAMP by lanthanide metal(III) complexes and lanthanide metal ions are compared.
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The cleavage of 3',5'-cAMP, 3',5'-cGMP and 3',5'-dcAMP by lanthanides has been investigated by HPLC and H-1 NMR. Rapid cleavage of cAMP, cGMP and dcAMP by Ce(III) under air at pH 8 and 37 degrees C has been observed. Regioselective cleavage of P-O(5') bond in cAMP, cGMP and dc;aMP tu give the corresponding 3'-AMP, 3'-GMP and 3'-dAMP by lanthanide chlorides has been achieved, and 3'-AMP and 3'-GMP are cleaved to adenosine(A) and guanosine(CT) more slowly, respectively, The notable difference in reactivity between Ce(III) and the other lanthanide ions under air has also been studied. The cleavage is enhanced with the increase in the molar fraction of Ce(IV). The fast cleavage of cAMP by Ce(III) under air at pH 8 is ascribed to the resultant Ce(IV) in the reaction mixture.
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在温和条件下能快速切断核酸的人工酶有许多重要的潜在应用价值,如作为模拟的限制性内切酶并发展到新的抗癌药物,因此,长期以来人们致力于研究具有高效率及高选择性的人工酶.关于稀土对核酸断裂作用的研究尚不多,而稀土对环核苷酸的催化水解作用只有Sumaoka等曾报道Ce~(3+)对3’,5’-环腺嘌呤单核苷酸(cAMP)有快速的水解作用,稀土对不同环核苷酸的催化水解作用尚未见报道.3’,5’-环腺嘌呤单核苷酸与3’,5’-环鸟嘌呤单核苷酸(cGMP)具有调节细胞应答及细胞间信息传递的作用,且细胞内不同环核苷酸的变化与某些心血管疾病的发病机理有关.本文用高压液相色谱(HPLC)和核磁共振(NMR)研究了稀土对cAMP与cGMP的断裂作用,并深入探索了其机理,这对于寻找高效率及高选择性的核酸催化体系,阐明稀土在生物体内的作用具有重要的意义.
Regulation of autoinducer 2 production and luxS expression in a pathogenic Edwardsiella tarda strain
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Edwardsiella tarda is a bacterial pathogen that can infect both humans and animals. TX1, an Ed. tarda strain isolated from diseased fish, was found to produce autoinducer 2 (Al-2)-like activity that was growth phase dependent and modulated by growth conditions. The gene coding for the Al-2 synthase was cloned from TX1 and designated luxS(Et). LuxS(Et) was able to complement the Al-2 mutant phenotype of Escherichia coli strain DH5 alpha. Expression Of luxS(Et) correlated with Al-2 activity and was increased by glucose and decreased by elevated temperature. The effect of glucose was shown to be mediated through the cAMP-CRP complex, which repressed luxS(Et) expression. Overexpression of luxS(Et) enhanced Al-2 activity in TX1, whereas disruption of luxS(Et) expression by antisense RNA interference (i) reduced the level of Al-2 activity, (ii) impaired bacterial growth under various conditions, (iii) weakened the expression of genes associated with the type III secretion system and biofilm formation, and (iv) attenuated bacterial virulence. Addition of exogenous Al-2 was able to complement the deficiencies in the expression of TTSS genes and biofilm production but failed to rescue the growth defects. Our results (i) demonstrated that the Al-2 activity in TX1 is controlled at least in part at the level of luxS(Et) expression, which in turn is regulated by growth conditions, and that the temporal expression of luxS(Et) is essential for optimal bacterial infection and survival; and (ii) suggested the existence in Ed. tarda of a LuxS/Al-2-mediated signal transduction pathway that regulates the production of virulence-associated elements.
Regulation of autoinducer 2 production and luxS expression in a pathogenic Edwardsiella tarda strain
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Edwardsiella tarda is a bacterial pathogen that can infect both humans and animals. TX1, an Ed. tarda strain isolated from diseased fish, was found to produce autoinducer 2 (Al-2)-like activity that was growth phase dependent and modulated by growth conditions. The gene coding for the Al-2 synthase was cloned from TX1 and designated luxS(Et). LuxS(Et) was able to complement the Al-2 mutant phenotype of Escherichia coli strain DH5 alpha. Expression Of luxS(Et) correlated with Al-2 activity and was increased by glucose and decreased by elevated temperature. The effect of glucose was shown to be mediated through the cAMP-CRP complex, which repressed luxS(Et) expression. Overexpression of luxS(Et) enhanced Al-2 activity in TX1, whereas disruption of luxS(Et) expression by antisense RNA interference (i) reduced the level of Al-2 activity, (ii) impaired bacterial growth under various conditions, (iii) weakened the expression of genes associated with the type III secretion system and biofilm formation, and (iv) attenuated bacterial virulence. Addition of exogenous Al-2 was able to complement the deficiencies in the expression of TTSS genes and biofilm production but failed to rescue the growth defects. Our results (i) demonstrated that the Al-2 activity in TX1 is controlled at least in part at the level of luxS(Et) expression, which in turn is regulated by growth conditions, and that the temporal expression of luxS(Et) is essential for optimal bacterial infection and survival; and (ii) suggested the existence in Ed. tarda of a LuxS/Al-2-mediated signal transduction pathway that regulates the production of virulence-associated elements.
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Cyclic nucleotides (both cAMP and cGMP) play extremely important roles in cyanobacteria, such as regulating heterocyst formation, respiration, or gliding. Catalyzing the formation of cAMP and cGMP from ATP and GTP is a group of functionally important enzymes named adenylate cyclases and guanylate cyclases, respectively. To understand their evolutionary patterns, in this study, we presented a systematic analysis of all the cyclases in cyanobacterial genomes. We found that different cyanobacteria had various numbers of cyclases in view of their remarkable diversities in genome size and physiology. Most of these cyclases exhibited distinct domain architectures, which implies the versatile functions of cyanobacterial cyclases. Mapping the whole set of cyclase domain architectures from diverse prokaryotic organisms to their phylogenetic tree and detailed phylogenetic analysis of cyclase catalytic domains revealed that lineage-specific domain recruitment appeared to be the most prevailing pattern contributing to the great variability of cyanobacterial cyclase domain architectures. However, other scenarios, such as gene duplication, also occurred during the evolution of cyanobacterial cyclases. Sequence divergence seemed to contribute to the origin of putative guanylate cyclases which were found only in cyanobacteria. In conclusion, the comprehensive survey of cyclases in cyanobacteria provides novel insight into their potential evolutionary mechanisms and further functional implications.
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变态过程是双壳贝类由幼虫向成体转变的一个必不缺少的发育阶段。研究双壳贝类幼虫的变态过程及其机理,对于阐明它们的种群数量变动,促进重要经济双壳贝类增养殖的发展有重要的理论和实践意义。本论文除了用化学物质对几种双壳贝类(海湾扇贝、墨西哥湾扇贝和硬壳蛤)幼虫的变态进行诱导外,主要以激素和神经递质的作用方式为基础,通过直接测定双壳贝类(以海湾扇贝为代表)幼虫体内激素和神经递质、第二信使cAMP等生化物质含量的变化来研究双壳贝类幼虫变态过程中的信息传递途径,从分子生物学和神经生物学角度阐明双壳贝类幼虫变态机理。主要结果如下:1.通过参考国内外大量文献的基础上,较为系统地评述了近二十年来海洋无脊椎动物幼虫附着变态研究的一些进展情况,主要包括诱导因子、附着变态机理模型、人工诱导物的应用和延迟变态四个方面。到目前为止,人们已经发现了许多海洋无脊椎动物幼虫附着变态的诱导物质,主要分为天然诱导物和人工诱导物两大类,一些人工诱导物如GABA、肾上腺素和去甲肾上腺素已经在经济贝类苗种生产中得到应用。幼虫附着变态机理模型主要有长牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫附着变态的双调控模型、红鲍(Haliotis rufescens)幼虫附着变态的上行调节模型以及多毛类Phragmatopoma california幼虫附着变态的脂肪酸调控模型。本论文还评述了海洋无脊椎动物幼虫发生延迟变态的原因以及延迟变态对海洋无脊椎动物造成的影响,并提出了解决的方法和今后研究的重点问题。2.在室内用氯化乙酰胆碱、ATP和CaCl_2 3种化学物质对海湾扇贝幼虫的变态进行了诱导实验。结果表明,虽然在个别浓度和处理时间氯化乙酰胆碱和ATP有诱导作用,但总体诱导效果不显著。而10×10~(-3)~40×10~(-3M的CaCl_2在处理12~24h后诱导效果较显著,其诱导效果对处理时间的依赖性较显著,在浓度为40×10~(-3)M和处理时间为24h时诱导效果最好,与对照组相比,变态率提高23.18%。3种诱导物对幼虫死亡率均有显著影响,并且死亡率对浓度和处理时间均有显著的依赖性,浓度越高,处理时间越长,死亡率越高。3.用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱进行了墨西哥湾扇贝(Argopectenirradians concentricus Say)幼虫变态的诱导作用实验。结果表明,KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素和氯化胆碱对墨西哥湾扇贝幼虫变态均有显著诱导作用。KCl在处理时间为12h~48h范围内均有诱导作用;13.42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl诱导效果较好,变态率平均提高10%以上。1.O×10~(-6)M~50×10~(-6)M的肾上腺素在处理时间为lh~12h较适宜,此时变态率均提高10%以上。1.0×10~(-6)M~50×10~(-6)M的去甲肾上腺素在处理时间为1h~24h都较适宜,变态率平均均提高10%以上,最高可提高31.07%。0.01×10~(-4)M~1.O×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h~48h时诱导效果均较好,它们之间的平均变态提高率并没有显著差别,均在12%~13%之间。10×10~(-4)M的氯化胆碱在处理时间为12h时诱导效果较明显,变态率可以提高19.14%,超过12h,变态率明显下降,100×10~(-4)M的氯化胆碱明显产生毒害作用,幼虫变态率均为零,而幼虫的死亡率均为100%。4.用KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,Serotonin,5-HT)和GABA(γ-氨基丁酸)进行了不同浓度不同处理时间对硬壳蛤(Mercenaria mercenaria L.)幼虫变态诱导实验。结果表明,KCl、肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA和5-羟色胺对硬壳蛤幼虫的变态均有诱导作用,而GABA的诱导 作用不显著。KCl的最佳诱导浓度随处理时间不同而有所不同。当处理时间为1~24h时,KCl的最佳诱导浓度为33.56×10~(-3)M,此时幼虫变态率均提高24%以上,当处理时间为48h时,KCl的最佳诱导浓度为20.13~26.85×10~(-3)M,处理时间为72h时,最佳诱导浓度为13.42×10~(-3)M。肾上腺素和去甲肾上腺素的诱导作用与浓度和处理时间均有关。肾上腺素的最佳处理浓度为100×10~(-6)M,最佳处理时间均为8h,此时幼虫变态率提高最大,为36.97%。当去甲肾上腺素的诱导浓度为100×10~(-6)M,处理时间为8h~16h时,幼虫变态提高率较高,均大于18%,死亡提高率均低于30%,当去甲肾上腺索诱导浓度为500×10~(-6)M时,虽然在8h~16h的处理时间范围内,幼虫变态提高率也较高,均大于18%,但当处理时间超过8h,在16~48h范围内,幼 虫死亡提高率明显升高,均大于50%。L-DOPA的适宜诱导浓度为10×10~(-6)M~50×10~(-6)M,适宜处理时间为8~24h,此时幼虫变态率均提高30%以上,最高可提高79.43%。5-羟色胺的诱导作用较强,其适宜诱导浓度为100×10~(-6)M—1000×10~(-6)M,适宜处理时间为0.5~24h,此时幼虫变态率提高均在30%以上,当处理时间为8h时,最佳诱导浓度为1000×10~(-6)M,此时幼虫变态率提高57.5%,当处理时间为24h时,最佳诱导浓度为100×10~(-6)M,此时幼虫变态率提高69.29%。GABA的诱导作用较弱,最佳诱导浓度随处理时间的不同而有所不同。处理时间为24h和48h时,最佳诱导浓度为0.1×10~(-6)M;处理时间为0.5~16h时,最佳诱导浓度为100×10~(-6)M。5.KCl、肾上腺素、去甲肾上腺索、L-DOPA、5-羟色胺、GABA、茶碱和咖啡因8种诱导物对不同发育阶段海湾扇贝幼虫变态的诱导作用是不同的。13.42×10~(-3)M和20.13×10~(-3)M的KCl对第12天幼虫的变态有抑制作用,变态提高率为负值;之后当幼虫发育至第13和14天时,两浓度的KCl能够明显诱导幼虫变态,变态提高率均高于20%,而对于第16天的幼虫诱导作用有所减弱,变态提高率有所降低;26.85×10~(-3)M的KCl对第12和13天幼虫的变态均有抑制作用,变态提高率为负值,对第14和16天幼虫的变态却有明显的持续的诱导作用,变态提高率分别为22.98%和37.5%。神经递质肾上腺素、去甲肾上腺素、L-DOPA、5-羟色胺和GABA的诱导作用规律基本相似,即对第13天海湾扇贝幼虫的变态有明显的抑制作用,变态提高率均为负值,而对第14天幼虫的诱导作用较显著。茶碱和咖啡因作为影响细胞内cAMP的物质,它们的诱导作用规律与神经递质有所不同。它们对第13天海湾扇贝幼虫变态的诱导效果最好。6.测定了不同发育阶段及人工诱导后海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺含量的变化规律。结果表明,海湾扇贝幼虫体内去甲肾上腺索含量在变态前和变态后没有明显变化,变态前为2352(pg/mg湿重),变态后为2770(pg/mg湿重)。多巴胺和5-羟色胺含量在变态前随幼虫的发育而增加,变态前(第13天)急剧增加,第13天的幼虫比第12天的幼虫分别增加了2.8倍和5.7倍,变态后急剧下降,变态后幼苗比第13天的幼虫分别降低了25.1倍和16.4倍。海湾扇贝幼虫体内DA:NE比和5-HT:NE比在变态前和变态后变化比较剧烈。DA:NE比和5-HT:NE比在变态前(第13天)急剧增加,第13天的幼虫比第12天的幼虫增加了3.O倍(DA:NE比)和5.0倍(5-HT:NE比);变态后急剧降低,变态后幼苗比第13天的幼虫降低了29.8倍(DA:NE比)和19.5倍(5-HT:NE比)。海湾扇贝幼虫经KCl和氯化钙诱导24h后,体内去甲肾上腺素、多巴胺和5-羟色胺以及DA:NE比和5-HT:NE比均有所降低。本实验的结果表明,多巴胺和5-羟色胺可能启动了海湾扇贝幼虫的变态过程。7.茶碱和咖啡因对墨西哥湾扇贝幼虫的变态均有明显诱导作用。它们的诱导作用均对浓度的依赖性较强,对处理时间的依赖性较弱。10×10~(-4)M的茶碱诱导效果最好,平均变态提高率达33%,其次为1.0×10~(-4)M和100×10~(-4)M的茶碱,平均变态提高率分别为23.15%和21.97%。处理时间对茶碱诱导效果影响不显著,在1~24h范围内,平均变态提高率在19.07~26.1%之间变动。10×10~(-4)M的咖啡因诱导效果最佳,4个处理时间的平均变态提高率为36.01%,其次为100×10~(-4)M,平均变态提高率为26.43%。处理时间对茶碱的诱导效果影响不大,在1~24h范围内,平均变态提高率在19.65~22.02%之间变动。8.采用直接测定cAMP的方法来研究cAMP是否参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。结果表明,cAMP参与了海湾扇贝幼虫的变态过程。海湾扇贝幼虫体内cAMP含量随着发育阶段的不同而有所变化。在D形幼虫期最低,为73 pmol/(mg蛋白质);当到达壳顶期幼虫时cAMP含量明显增加,比D形幼虫期提高了12.7倍。从壳顶期幼虫到眼点幼虫(100%,第13天)cAMP含量增加速度较慢,各发育阶段分别比前一发育阶段增加了0.4倍、0.3倍和0.2倍。但当幼虫变态后,体内cAMP含量又急剧增加,幼苗体内cAMP含量比眼点幼虫(100%,第13天)增加了6.1倍。当用KCl、肾上腺索和L-DOPA诱导后,幼虫体内cAMP含量明显增加,分别比对照组提高了7.8倍、1.5倍和10.7倍,说明cAMP参与了这3种诱导物诱导海湾扇贝幼虫变态的过程。9.在前面实验结果和参考有关文献的基础上,初步提出了以海湾扇贝为代表的双壳贝类幼虫变态机理模型:幼虫变态分为两个过程:启动过程和后续过程。当幼虫发育到一定阶段,在外界刺激因子的作用下,体内分泌多巴胺和5-羟色胺,多巴胺和5-羟色胺通过某种信号转导途径(如以DG和IP_3为第二信使)启动变态过程,变态过程启动后,又激活以cAMP为第二信使的信号转导途径(暂时称为后续过程),两者共同完成了幼虫的变态过程。
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采用体外药物诱导的方法,研究了5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)诱导的硬壳蛤卵母细胞成熟过程中cAMP信号通路的作用。结果表明,5-HT (0.01—100µM)均能够显著地诱导硬壳蛤卵母细胞的成熟。磷酸二酯酶抑制剂—咖啡因、茶碱和IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)可以单独抑制卵母细胞的自发成熟,但效果不显著。10mM的咖啡因和茶碱以及5mM的IBMX能够显著地抑制5-HT的诱导效果。dbcAMP(双丁酰基环腺苷一磷酸)不但能够抑制卵母细胞的自发成熟,而且还可以抑制5-HT诱导的成熟。因此,cAMP信号通路参与了5-HT诱导的硬壳蛤卵母细胞的成熟过程,并且该信号通路起着负调控的作用。 研究了PLC(磷脂酶C)和PKC(蛋白激酶C)的激活剂/抑制剂对5-羟色胺诱导的卵母细胞成熟的影响。高浓度的新霉素(PLC抑制剂)可以抑制5-HT诱导的卵母细胞的成熟,而DMBA(9,10-Dimethy-1,2-benzanthracene,9,10–二甲基胆蒽,PLC激活剂)则能够促进成熟。PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate,佛波十四烷酸乙酸酯,PKC激活剂)能够抑制5-HT诱导的成熟,而Spingosine(PKC抑制剂)则可以促进卵母细胞的成熟。从而推测,5-HT诱导的卵母细胞成熟需要磷脂酰肌醇信号通路的激活。PLC浓度的降低能够抑制5-HT诱导的卵母细胞成熟;PKC浓度的降低则会促进卵母细胞的成熟。因此,在硬壳蛤卵母细胞的成熟过程中,PLC起促进的作用,DAG(二酰肌甘油)–PKC通路则起抑制的作用。 细胞外高浓度Ca2+能够促进硬壳蛤卵母细胞的成熟,Ca2+离子载体A23187也可以促进硬壳蛤卵母细胞的成熟。1-100µM异搏定(Verapamil,钙离子通道阻断剂)能够抑制卵母细胞的成熟,而100µM的Verapamil能够完全抑制其成熟。上述结果表明细胞外Ca2+对硬壳蛤卵母细胞的成熟是必需的,而且起到促进卵母细胞成熟的作用。三氟拉嗪(TFP,Ca2+与CaM结合的拮抗剂)能够抑制卵母细胞的成熟,高浓度的三氟拉嗪(1mM)能够完全抑制卵母细胞的成熟。说明CaM起到促进卵母细胞成熟的作用。可见,Ca2+通过与CaM的相互作用,共同起到促进硬壳蛤卵母细胞成熟的作用。 5-HT诱导成熟的卵母细胞可以完成受精过程,其受精过程以及幼虫发育情况与正常受精发育过程类似,没有显著差异。高浓度的新霉素可以抑制受精过程,而茶碱和咖啡因对受精没有影响。从而推测,磷脂酰肌醇信号通路参与了硬壳蛤卵母细胞的受精过程,而cAMP信号通路可能没有参与受精过程。 发现硬壳蛤的性腺发育与我国常见的双壳类如泥蚶相似。硬壳蛤卵母细胞中卵黄粒主要由线粒体、高尔基液泡、内质网和微吞饮泡形成。
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从患病牙鲆中分离出迟缓爱德华氏菌株TX1,经报告菌株检测发现TX1有AI-2活性。用梯度PCR和Genome walking的方法克隆了TX1 luxS基因,将luxS基因在大肠杆菌DH5α中表达,证明其具有功能活性。在TX1中,luxS的表达与AI-2的活性基本是一致的,二者均受生长时期和生长条件的调节,即在glucose存在的条件下luxS表达和AI-2活性升高,而在高温条件下luxS表达和AI-2活性降低。glucose对AI-2活性以及luxS表达的影响经过荧光定量PCR,启动子活性检测,AI-2活性检测以及凝胶滞缓等一系列的实验证实是由cAMP-CRP复合物介导的,该复合物可以通过与luxS启动子相互作用而抑制luxS的表达。RNA干扰表明,TX1中luxS表达被干扰以后,对细菌产生了多方面的影响,包括:(1) 降低AI-2水平;(2) 降低细菌的生长能力;(3) 降低Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成能力;(4) 减弱细菌毒力。外源AI-2的添加可以回复Ⅲ型分泌系统相关基因的表达水平以及生物膜的形成,但是并不能修复生长状况,表明LuxS在TX1中具有双重功能,即参与细胞代谢以及群体感应信号传导。基于LuxS/AI-2群体感应系统对细菌毒力的重要性,设计并筛选了一个该系统的阻遏因子5411。Pull-down实验证明5411可以和LuxS特异性结合。研究表明5411在TX1中表达导致细菌毒力显著下降。将5411克隆至牙鲆共生菌FP3中,发现5411可以被分泌到胞外并能被TX1吸收。将表达5411的共生菌导入牙鲆,发现其能够有效阻遏TX1对牙鲆的侵染。 这些结果表明:(1) TX1中AI-2的活性受控于LuxS,而后者则受生长时期和生长条件的调控;(2) luxS的正常表达对于细菌的正常生长和侵染是必需的;(3) LuxS/AI-2群体感应系统调控Ⅲ型分泌系统相关毒力因子的表达;(4) 通过阻遏LuxS/AI-2群体感应系统来抑制病原菌侵染是一种具有潜力的新型病害防控方法。
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本研究运用RT—PCR技术,首次从大熊描Ailuropoda melanoleucu的肌肉组织总RNA中成功克隆了核糖体蛋白S15(RPS15)基因的表达序列.并对其进行了初步分析。结果表明:大熊猫RPS15基因的表达序列全长为442bp,开放阅读框(ORF)为438bp,编码145个氨基酸,该蛋白的分子量为17.0401KDa,等电点为10.3,含有2个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,4个N-酰基化位点及1个RPS19蛋白signature位点。进一步分析发现,大熊猫RPS15基因的表达序列及其编码的氨基酸序列与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性。
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本文研究模拟高原低氧下新生和胚胎大鼠发育时,下丘脑内促肾上腺皮质激素(CRF) 及垂体环磷酸腺苷(cAMP) 水平的变化。结果表明:5km 海拔高度抑制下丘脑CRF 的发育,当发育至25天和30天时,CRF含量分别为对照组的64. 8 %和57. 9 %。此时,体重分别为47. 8 %和52. 9 %。30 天时,cAMP为20. 8 %。本研究还显示,在7km 海拔高度,已怀孕大鼠难以完成正常的妊娠和胎儿发育过程,5km 海拔高度暴露17 天时,胚胎脑内CRF 含量高于对照。