青蒿异源基因的遗传转化及青蒿生物合成相关基因的克隆

本论文由三部分内容组成，一、药用青蒿的遗传转化，即根癌农杆菌和发 根农杆菌介导的转化系统的建立及其影响参数的研究。二、青蒿素生物合成的 分子调控。三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。 一、药用青蒿的遗传转化。建立了Ri质粒介导和Ti质粒介导的两种转基因系统， 其中Ri质粒介导青蒿转基因系统的建立是国际上首次报道;以GFP基因为报 告基因，首次获得高效表达的青蒿转绿色荧光蛋白基因的丛生芽，并对GFP基 因的表达进行了组织和细胞水平的定位。此外，对影响两种转基因系统的主要 参数进行了较为详细的研究。上述研究为青蒿素生物合成的分子调控奠定了坚 实的基础。 二、青蒿素生物合成的分子调控。为探索提高青蒿植株或组织和器官中的青蒿 素含量，首次以棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷酸合成酶的 cDNA 为 目的基因导入青蒿，对青蒿中青蒿素的生物合成进行了分子调控研究的尝试。 通过已建立的两种转基因系统，将从棉花中克隆的杜松烯合成酶和法呢基焦磷 酸合成酶的 cDNA 导入青蒿，获得转基因发根和转基因植株。结果表明，外源 基因的表达能够影响青蒿素的生物合成，其中法呢基焦磷酸合成酶基因的过量 表达能够促进青蒿素的生物合成，提高转基因发根和植株中的青蒿素的含量。 转基因发根F-26系中青蒿素含量最高达3.01 mg/g.DW，与对照相比青蒿素含量 提高3～4倍;转基因植株的青蒿素含量最高达10.08 mg/g.DW，与对照相比， 转基因植株的青蒿素产物提高2～3倍。此外，研究还表明，在转基因的发根C -37株系中，外源杜松烯合成酶基因的导入和表达可能相应地促进青蒿转基因 发根自身的法昵基焦磷酸基因的表达。 三、倍半萜生物合成相关基因的克隆。采用 RT-PCR 技术，从马铃薯 (Solanum tuberosum L.) 幼叶中克隆了 HMGRII 亚基因家族的一个新的成员 HMGR-c2（GenBank accession No．AF 096838Southem）;杂交分析表明，该基因至少以 两个拷贝以上形式存在于马铃薯基因组中;RT-PCR分析表明，HMGR -c2的 表达在幼苗期无组织特异性，广泛地存在于根、茎、叶等组织中。以青蒿001 株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期的λgtll cDNA文库，以PCR筛库方 法从青蒿中克隆一个法呢基焦磷酸合成酶cDNA (Artfps2 GenBank accession No． AF136602)和一个HMGR cDNA(GenBank accession No．AF142473);以青蒿 025株系的苗期叶片为材料，构建了青蒿苗期部分质粒文库以 PCR 筛库方法从 青蒿中克隆一个法昵基焦磷酸合成酶 cDNA (Artfpsl GenBank accession No.AF112881);此外，还从青蒿中克隆了倍半萜合成酶的 cDNA 片段(GenBank accession No.AF156854)。其中青蒿倍半萜合成酶基因的克隆是目前国际上本研 究领域最受关注的焦点和难点之一。至此，本研究已将与青蒿素生物合成相关 的三个重要的关键酶基因基本克隆，这无疑将加速青蒿素生物合成的基础和应 用研究的进程。

白皮松花粉管发育过程中RNA、蛋白质和多糖类物质的合成及其动态变化

花粉管是有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，它同根毛、真菌菌丝一样，具有典型的极性顶端生长模式。裸子植物花粉与被子植物相比，具有萌发时间较长，生长缓慢等特点。但是目前人们对于裸子植物花粉萌发和花粉管生长的机理还不清楚。本文以裸子植物白皮松（Pinus bungeana）的花粉为材料，采用细胞学和生理生化方法，包括应用普通光学显微镜、荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、显微红外光谱（FTIR）和透射电镜（TEM）等技术，对其花粉萌发和花粉管生长过程进行了较为系统的研究，旨在进一步揭示裸子植物花粉管发育的调控机制。 本论文首先研究了外源Ca2+ 和3种调钙药物（A23187、EGTA、TMB8）对白皮松花粉萌发和花粉管生长的影响。结果表明，在离体培养条件下，高浓度的Ca2+（1%）能完全抑制白皮松花粉的萌发，低浓度的Ca2+ 则影响不大，而花粉萌发和花粉管生长的最适Ca2+ 浓度为0.01%。用Ca2+ 载体A23187、Ca2+ 螯合剂EGTA和钙通道阻滞剂TMB8分别处理花粉后，花粉萌发和花粉管生长均受到抑制。另外，用 Ca2+ 荧光探针 Fluo-3AM标记，对Ca2+ 的分布变化进行了观察，发现在花粉萌发的初期，Ca2+ 向萌发孔聚集。在正常生长的花粉管中Ca2+ 呈梯度分布，顶端荧光最强。与对照相比，A23187处理后花粉粒中荧光增强，而EGTA和TMB8处理的花粉粒中荧光强度均减弱。并且这3种调钙药物还破坏了花粉管顶端的Ca2+ 浓度梯度，最终导致花粉管的生长受阻。 花粉萌发和花粉管的生长依赖于RNA和蛋白质的不断合成。在放线菌素D的存在下，花粉萌发基本不受影响，但花粉管的生长速度下降，花粉管中RNA含量也减少。而经过放线菌酮处理后，花粉萌发和花粉管生长均受到抑制，花粉管中蛋白质含量降低，同时花粉管顶端显著膨大。通过SDS-PAGE的结果表明，花粉粒萌发前后蛋白质图谱有明显差异。FTIR光谱分析表明，两种抑制剂处理均导致花粉管壁的化学组成发生了变化，例如蛋白质和饱和酯含量减少，而羧酸的含量增加。此外，由放线菌酮和放线菌素D处理后，花粉管的超微结构也发生了明显变化，其中特别是花粉管顶端的分泌系统遭到严重破坏。 纤维素的正常合成对于白皮松花粉管的生长是必需的。在正常培养基中添加纤维素生物合成抑制剂2，6-二氯苯腈（DCB）后，花粉萌发几乎不受影响，但是花粉管的形态发生异常，生长速率降低。DCB处理还导致花粉管壁中纤维素含量下降，而胼胝质在花粉管顶端积累。用识别酯化果胶的JIM7和识别酸性果胶的JIM5对离体培养的白皮松花粉管进行标记后，发现果胶成分呈异常分布图式。FTIR光谱分析结果表明花粉管细胞壁中蛋白质、羧酸以及饱和酯含量增加。同时，在电镜下观察发现，花粉管细胞壁顶端呈现不均匀加厚，其中主要的细胞器，如高尔基体和线粒体等膜结构均遭到破坏。 上述结果说明，白皮松成熟花粉粒中已含有花粉萌发和花粉管早期生长所必需的Ca2+ 和RNA，但是在花粉管的后续伸长过程中仍需要外源Ca2+ 的参与以及新RNA、蛋白质的不断合成。与被子植物不同，裸子植物花粉萌发的启动也需要新蛋白的合成。尽管在花粉管中纤维素的含量很低，但是对于细胞壁的构建、花粉管的正常形态的维持起着关键作用。

Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates

MicroRNAs (miRNAs) are a growing class of small RNAs ( about 22 nt) that play crucial regulatory roles in the genome by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. Most of the identified miRNAs are highly conserved among species, indicating

八棱丝瓜蛋白1的体外抗HIV-1活性

目的:研究八棱丝瓜蛋白1的抗HIV-1活性.方法:通过实验株HIV-1IIIIB诱导合胞体形成抑制实验、HIV-1IIIB和临床分离株HIV-IKM018急性感染细胞以及HIV-1IIIB慢性感染细胞的p24抗原表达抑制实验检测八棱丝瓜蛋白1的抗HIV-1活性.结果:八棱丝瓜蛋白1抑制HIV-1IIIB诱导C8106细胞形成合胞体的EC50为0.025 μmol·L-1,治疗指数为76.八棱丝瓜蛋白1抑制HIV-1IIIB感染C8166和HIV-1KM018感染PBMC的p24抗原表达的EC50分别为0.033和0.207 μmol·L-1.八棱丝瓜蛋白1不抑制HIV-1IIIB在慢性感染H9细胞中的复制.结论:首次发现八棱丝瓜蛋白1是一种具有抗HIV-1活性的核糖体失活蛋白.

氟代柠檬酸对体外培养的神经胶质瘤细胞G422增殖的抑制效应

为研究氟代柠檬酸(Fluorocitrate)对体外培养的神经胶质瘤细胞生长的影响,采用MTT法研究不同的氟代柠檬酸浓度(0.0025mmol/L,0.005mmol/L,0.01 mmol/L,0.025mmol/L和0.1 mmol/L)和作用时间(36h,48h和60h)对神经胶质瘤细胞G422增殖的影响.结果发现:(1)氟代柠檬酸可抑制G422细胞的增殖,并且其抑制作用随氟代柠檬睃浓度的增加而增强;(2)高浓度(0.01 mmol/L,0.025 mmol/L和0.1 mmol/L)氟代柠檬酸对G422细胞的增殖抑制作用随作用时问的延长而增强:(3)低浓度(0.0025mmol/L和0.005mmol/L)氟代柠檬酸对G422细胞的增殖抑制作用不随作用时间的延长而改变.实验表明,氟代柠檬酸能够抑制神经胶质瘤细胞的增殖,其抑制能力随氟代柠檬酸浓度的增加和作用时间的延长而加强.

四种渗透性防冻剂在猕猴精子低温冷冻保存中对精子功能状态的影响

以冷冻精子的复苏运动度、荧光染料Hoechst 33258 检测的细胞膜完整率、异硫氰酸荧光素标记的 花生凝集素(FITC2PNA) 检测的顶体完整率作为精子功能状态的指标, 对甘油、二甲亚砜、乙二醇和丙二醇4 种常用渗透性防冻剂在猕猴精子冷冻保存过程中的作用进行了比较。结果表明: 冷冻保存精子的复苏运动度, 甘油(4713 ±517 %) 和乙二醇(4418 ±617 %) > 二甲亚砜(2219 ±019 %) > 丙二醇(0 ±0 %) ; 细胞膜完整 率, 甘油(5418 ±312 %) 和乙二醇(5410 ±617 %) > 二甲亚砜(3715 ±710 %) > 丙二醇(2813 ±615 %) ; 顶 体完整率, 甘油(8212 ±214 %) 和乙二醇(8214 ±214 %) > 二甲亚砜(6817 ±517 %) 和丙二醇(7213 ± 315 %) ( P < 0105) 。结果提示: 二甲亚砜和丙二醇, 尤其是丙二醇并不适合猕猴精子的冷冻保存; 而乙二醇具 有和甘油相似的保护作用, 是一种极具潜力的猕猴精子冷冻保存的渗透性防冻剂。

Additional angles to calculate the deformation of RNA helices induced by bulge loops

Bulges are common features of folded RNA structures. The RNA axial kinking caused by bulges has been confirmed by many experiments. Usually, a kinking angle zeta and a bending angle theta are used to describe the kinking and twisting of RNA molecules containing bulges. Here, we present two additional angles (twist angle zeta(1), twist angle zeta(2)) to describe the deformation of RNA helices induced by bulge loops because only two angles (a kinking angle zeta and a bending angle theta) are not enough to define the deformation of RNA induced by bulges. (C) 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

滇池控藻围隔中水生植物和浮游藻类对不同形态铁浓度的影响

运用围隔试验来研究围隔生态系统内浮游藻类的组成和数量以及水生植物变化对不同形态铁浓度的影响,再反过来探讨微量元素铁在蓝藻水华暴发过程中对水生植物和浮游藻类生态生理的作用,从而为探索治理蓝藻水华的新途径提供基础证据。从2003年6月至10月,定期采样测定了控藻围隔水体中的亚铁、颗粒态铁(>0.22μm)、小胶体态铁(0.22～0.025μm)、溶解态铁(<0.025μm)的浓度和叶绿素a的浓度,同时对浮游藻类进行了组成鉴定和细胞计数。结果表明,不同形态的铁之间是可以相互转化的,胶体态铁比颗粒态铁活跃,是溶解

鲤病毒病原的感染性测定

为查明养殖鲤(Cyprinus carpio)突然大批发病死亡的原因,对鲤病样品进行了细胞攻毒、空斑测定、电镜观察,以及鱼体感染等实验。先以患病鲤的组织匀浆液,经过滤后,分别接种到草鱼鳍条细胞(GCF)、鲤上皮瘤细胞(EPC)等14种培养细胞中。利用倒置显微镜观察显示,在1~2 d内,该病鱼组织匀浆液可使其中9种细胞出现典型的细胞病变。收集出现病变的细胞液(即病毒悬液),进一步进行病毒滴度检测、空斑测定和鱼体感染实验。结果显示,在GCF细胞上的病毒滴度为107.3TCID50/mL;在FHM,TSB和GC

鄱阳湖渔业资源现状及其环境监测

1 997— 1 999年对鄱阳湖区渔业资源与环境进行了动态监测 ,统计渔获物 2 778kg,生物学测定 1 62 7尾 ,采集到鱼类 1 2 2种 ,隶属于 1 2目 2 1科 77属 ,其中鲤科鱼类种类最多 ,计 65种 ,占 5 3.3%。湖区渔获物个体偏小 ,以 1— 2龄鱼为主 ,鲤、鲫基本上是当年鱼。鄱阳湖现有鲤、鲫产卵场 33处 ,主要分布在湖区东、南、西部 ,年均有效产卵面积 61 6.66km2 ,年均产卵量5 6.85亿。鄱阳湖区湖口、蛤蟆石、星子、康山水域湖水的pH、COD、Cr+

池养雄性白鱀豚性自慰行为与血清睾酮浓度之间的关系

自 1996年 3月至 1998年 12月 ,作者采用放射免疫分析法每月 1次测定雄性白豚 (Lipotesvexillifer)“淇淇”血清睾酮浓度。春季每天 1次 ,其它季节每三天 1次 ,每次 1h ,用目标动物取样法观察“淇淇”的行为。结果发现 ,性自慰 (腹面贴池壁、伸出阴茎 )行为的发生频率和血清睾酮激素水平都有周期性变化 ,春季为高峰期 ,秋季有 1个小峰 ,性自慰行为与血清睾酮激素浓度两者的周期较为一致。从性自慰行为和血清睾酮激素水平季节变化 ,推测出“淇淇”性腺活动的周期性变化 ,活动

瓦氏黄颡鱼年龄与生长的研究

根据在长江中游嘉鱼至新滩口江段采集的瓦氏黄颡鱼标本,对其年龄与生长进行了研究。以脊椎骨为年龄鉴定材料,胸鳍棘和耳石作为对照材料。透射光下,脊椎骨上较宽的暗带和较窄的亮带相间排列成同心圆环,一个暗带和一个亮带构成一个年轮。2—7月形成新年轮,脊椎骨上不存在幼轮。雌、雄鱼的脊椎骨半径与体长呈显著的正相关,回归方程分别为:L_♀=6.95+131.46R-10.12R~2,L_♂=18.06+113.64R-1.70R~2。体长与体重的关系方程分别为:W_♀=1.85×10~(-5)L~(2.98),W_♂=1