褐藻两个光系统的色素-蛋白质复合物的分离及特性研究

以褐藻裙带菜(Undaria pinnatifida)、萱藻(Scytosiphon lomentarius)、海蒿子(Sargassum confusum)、叉开网地藻(Dictyopteris divaricata)、海带(Laminaria japonica)、囊藻(Colpomenia sinuosa)、鼠尾藻(Sargassum thunbergii)、水云(Ectocarpus confervoides)为材料，对其色素-蛋白质复合物的分离技术及其特性进行了系统研究。通过对裙带菜色素-蛋白质复合物分离技术及其影响因素的研究，确立了褐藻的PAGE分离方法。采用Tris-Gly电泳分离系统，以非离子去污剂DMG或DIG为增溶剂(DMG: Chl=20: 1, DIG: Chl=50: 1, 4 ℃增溶1 h)，10%的分离胶浓度，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为30: 0.8,从裙带菜中成功地分离出8条含色素的蛋白质复合物带。采用Anderson命名系统，以高等植物菠菜为参照，将其命名为CPIa, CPI, CPa, LHC_1, LHC_2, LHC_3, LHC_4和LHC_5。游离色素较少。通过对三种褐藻的色素-蛋白质复合物的表观分子量测定、光谱学研究以及对裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽组成分析，揭示了褐藻各种色素-蛋白质复合物的特征。CPIa是褐藻分子量较大的PSI复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。CPI是褐藻的PSI核心复合物，为P700-叶绿素 a-蛋白质复合物。CPa是褐藻的PSII复合物，为墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物。其余5条为捕光色素-蛋白质复合物，LHC_1和LHC_3是墨角藻黄素-叶绿素 a/c-蛋白质复合物，LHC_2, LHC_4和LHC_5是叶绿素 a/c-蛋白质复合物。根据裙带菜色素-蛋白质复合物的多肽分析结果并与高等植物比较，提出褐藻PSI和PSII的结构模型。褐藻PSI和PSII的反应中心多肽与高等植物相同，捕光复合物明显区别。褐藻LHCI和LHCII的多肽组成相同，都是由单一的20 kDa多肽组成。褐藻叶状体、叶绿体、类囊体膜和PSI复合物的77 K 荧光发射光谱具有特异性，缺少高等植物PSI特征的730 nm 荧光峰。叶状体的77 K 荧光发射光谱按荧光主峰的波长分为两种类型，一种类型的荧光主峰在690 nm，另一种类型的在705-720 nm。三种褐藻PSI复合物的77 K 荧光发射光谱相同，有两个分别们于680 nm和715 nm 的发射峰。褐藻的77 K 荧光特异是由PSI的结构决定的。根据褐藻PSI复合物的荧光特性以及去污剂增溶动力学分析结果，推动F715来自褐藻核心色素-蛋白质复合物，F680来源于PSI复合物中的捕光复合物。褐藻PSI复合物中缺少高等植物发射730 nm 荧光的LHCIb复合物的能量传递模型。

海带蓝光受体及相关基因的研究

本研究中运用四种不用的方法提取海带孢子体RNA，通过对比分析，确定了采用CTAB提取液[2% (w/v) CTAB,100 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 50 mM EDTA, pH 7.5, 2 M NaCl, 50 mM DTT]提取RNA的方法，该方法的主要改进之处： (1) 高浓度（50 mM）的 DTT作为防止多酚氧化的还原剂加入提取液中；(2) 1/4 体积的乙醇和 1/9 体积的3 M 醋酸钾（pH 4.8）用来沉淀去除多糖；(3) 1/10倍体积的3 mol/L醋酸钠（pH 5.0）和两倍体积的乙醇选择性沉淀RNA；(4) -80℃沉淀30 min沉淀RNA。CTAB改进法提取的海带孢子体RNA质量好（A260/280 =1.96±0.05)，产量高（68 μg/g），分离的RNA可用于RT-PCR反应，扩增相关基因片段。该方法提取海带配子体RNA效果也很好。 根据拟南芥(Arabidopsis thaliana)、 莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 、铁线蕨(Adiantum capillus-veneris)、转板藻(Mougeotia scalaris)和无隔藻(Vaucheria frigida)等的蓝光受体蛋白保守序列，设计一系列简并引物，进行RT-PCR扩增，筛选并克隆测序了4条序列片段，通过比对分析，所得序列与已知的蓝光受体基因序列不一致。在所获得的序列中，一条783 bp的序列与肌醇-1-磷酸合成酶基因的片段有较高的相似性，通过RACE法克隆出该基因的3’末端，5’末端克隆没有成功，全长序列有待深入分析。

栉孔扇贝Chlamys farreri生态免疫机制的基础研究

针对目前栉孔扇贝Chlamys farreri养殖亟待解决的种质、病害、环境和产品质量等日趋严重的问题，从栉孔扇贝本身的防御机制和神经内分泌机制入手，较为系统地研究了环境胁迫，应激激素与血细胞免疫功能之间的相互作用机制；从生态免疫学角度，探讨了栉孔扇贝大规模死亡的原因，为栉孔扇贝病害防治和种质优化提供了一些理论依据。主要研究结果如下： 1.较为系统地综述了贝类生态免疫机制的研究进展。分析了应激激素对贝类细胞免疫活性的抑制作用，以及生态免疫过程中免疫成本的投入与其他生态因子之间的内在联系，分析了病原体与宿主之间的相互作用机制，提出了贝类生态免疫机制研究新见解和新思路。 2.筛选出一种较适用的抗凝剂配方：Glucose 20.8 gL-1，EDTA 20mM, Sodium chloride 20 gL-1，Tris-HCl 0.05M，pH=7.4。 3.模拟研究了栉孔扇贝养殖过程中的主要环境胁迫因子，包括露空胁迫（5°C，17°C和25°C露空最长持续24小时），急性温度胁迫（从17°C分别直接升至23°C和28°C或降至11°C），急性盐度胁迫（从盐度31直接升至盐度35或降至盐度25和20），饥饿胁迫（持续40天）和密度胁迫（分为低、中和高密度），对栉孔扇贝血细胞免疫功能的影响，养殖过程中的露空胁迫对栉孔扇贝的血细胞免疫功能具有抑制作用，从而削弱了扇贝胁迫后恢复的最初24小时中抗击病原体的能力。高温下（25°C）的露空胁迫能够显著地降低扇贝的成活率。急性升温胁迫（从17°C突变至28°C）会严重的破坏栉孔扇贝的内稳态，损伤其血细胞免疫功能，从而增加了扇贝对病原体的易感性。而扇贝对快速的降温胁迫（从17°C突变至11°C）则具有较高的耐受性。盐度20的低盐胁迫能够显著抑制栉孔扇贝的血细胞防御功能，同时低盐有利于许多病原体的繁殖，两方面的协同作用，将大大增加扇贝大规模死亡的几率。饥饿胁迫（40天）能够显著地抑制血细胞的免疫活性，然而在实验室饵料充足的条件下，养殖密度除了对血细胞的吞噬活性有一定的抑制作用外，对血细胞其他的免疫活性影响不明显。 4.揭示了环境胁迫因子，包括露空胁迫（17°C 露空24小时），温度胁迫（从17°C分别直接升至28°C或降至11°C持续7天），低盐胁迫(从盐度31直接降至盐度20持续7天)和饥饿40天胁迫，对栉孔扇贝血细胞超微结构的影响，露空胁迫（17°C 露空24小时），低盐胁迫(盐度20持续7天)和饥饿40天胁迫严重损伤了血细胞的膜系统及各种细胞器的结构。 5.利用酶联免疫法测定了栉孔扇贝血淋巴中应激激素（肾上腺素，去甲肾上腺素和多巴胺）的基础浓度，分别为0.088±0.11, 18.63±1.96 和 2.59±0.46ng/ml。研究了血淋巴中应激激素对环境胁迫（包括露空，急性升温和急性降盐）的响应水平，急性露空，升温和降盐能够显著提高血淋巴中肾上腺素和去甲肾上腺素的浓度，而多巴胺浓度变化却呈现出完全相反的趋势。 6.肾上腺素和去甲肾上腺素体外诱导栉孔扇贝血细胞研究结果表明：浓度为30ng/ml或50ng/ml的去甲肾上腺素能够显著抑制血细胞的吞噬活性，浓度为50ng/ml的去甲肾上腺素能够显著抑制血细胞的活性氧产物，而肾上腺素对血细胞免疫功能的影响则不显著。

Isolation and characterization of venom from nematocysts of jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye

The present work is the first report of the biochemical characterization of the venom from nematocysts of the jellyfish Rhopilema esculentum Kishinouye. The nematocysts were isolated by autolysis and centrifugation and separated by flow cytometry. Four types of nematocysts were identified: mastigophores, euryteles, and atrichous and holotrichous isorhiza. SDS-PAGE and amino acid analyses demonstrated that most of the proteins in the nematocyst extract were between 10 kDa and 40 kDa, and that glutamic acid was the main amino acid. A hemolytic activity assay showed that the activity of the nematocyst venom (RNV) was strongest in Tris-HCl buffer (50 mmol/L, pH 7.8, 5% glycerol, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1 mol/L NaCl). The hemolytic activity was related to protein concentration and the HU50 against chicken erythrocytes was 0.91 A mu g/mL.

Electrophoretic migration behavior of DNA fragments in polymer solution

A newly developed polymer coil shrinking theory is described and compared with the existing entangled solution theory to explain electrophoretic migration behaviour of DNA in hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) polymer solution in buffer containing 100 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane 100 mM boric acid, 2 mm ethylenediaminetetraacetic acid at pH 8.3. The polymer coil shrinking theory gave a better model to explain the results obtained. The polymer coil shrinking concentration, C-s, was found to be 0.305% and the uniform entangled concentration, C+, 0.806%. The existence of three regions (the dilute, semidilute, and concentrated solution) at different polymer concentrations enables a better understanding of the system to guide the selection of the best conditions to separate DNA fragments. For separating large fragments (700/800 bp), dilute solutions (HPMC < 0.3%) should be used to achieve a short migration time (10 min). For small fragments (200/300 bp), concentrated solutions are preferred to obtain constant resolution and uniform separation. The best resolution is 0.6% HPMC due to a combined interaction of the polymer coils and the entangled structure. The possibility of DNA separation in semidilute solution is often neglected and the present results indicate that this region has a promising potential for analytical separation of DNA fragments.

A remarkable synergic effect of water-soluble bimetallic catalyst in the hydrogenation of aromatic nitrocompounds

Hydrogenation of nitrobenzene can be catalyzed by the water-soluble catalyst PdCl2(TPPTS)(2) (TPPTS = tris(m-sulfonatophenyl)phosphine trisodium salt) under normal pressure at 65 degrees C in H2O/toluene biphasic solvent system. The exhibits higher catalytic activity and selectivity for the hydrogenation of aromatic nitrocompounds, compared with PdCl2(TPPTS)(2) or H2PtCl6 alone. The transmission electron micrographs demonstrate that the monometallic catalyst is composed of ultrafine palladium particles of almost uniform size while the particles of bimetallic catalyst are more widely distributed in size than those of the monometallic ones. (C) 1999 Elsevier Science B.V. All rights reserved.