几种赤潮微藻的形态和系统进化分析及荧光原位杂交检测

赤潮也称红潮，通常是指由于一些海洋浮游生物在水体中过度繁殖或聚集而使海水变色的现象。赤潮特别是有害赤潮造成了严重的生态环境问题，给水产养殖业和滨海旅游业造成了巨大损失，并可直接危害人类健康。研究赤潮，进而预防和控制赤潮，首先要对引发赤潮的生物种类进行准确鉴定并对自然水域的赤潮生物进行监控，并建立赤潮藻的快速鉴定与检测方法。本文分别对几株赤潮微藻进行了形态和系统进化分析，并探讨了荧光原位杂交在赤潮检测中的应用。 分别对5株分离自中国沿海不同水域的中肋骨条藻[Skeletonema costatum (Greville) Cleve]类似种 (SK-BH、SK-FQ、 SK-HH、SK-DH和SK-XM) 进行光镜和扫描电镜观察，并PCR扩增了转录内间隔区 (含5.8S rDNA)(ITS) 和核糖体大亚基 (D1-D2)区 (LSU)，获得的序列与其它已报道的骨条藻的同源序列进行了进化分析，以探讨５株骨条藻与已报道的骨条藻之间的进化关系。5株骨条藻在形态上各不相同，其中，只有1株 (SK-XM)被鉴定为中肋骨条藻，而其余4株皆与已报道的骨条藻的形态学特征不符。ITS树和LSU树具有不同的拓扑结构，并表明5株骨条藻至少分属3个不同的种。遗传距离分析提示了在地理距离上靠近的种，在进化上也可能靠近。此外，还可以观察到这5株藻之间的细微的形态学“进化”关系。所有结果表明了中国沿海骨条藻属种的多样性。 对1株分离自赤潮水域的裸甲藻 (Gymnodinium)类似种进行了形态学分析，并探讨了该藻与裸甲藻、凯伦藻(Karena)、旋沟藻(Gyrodinium)、下沟藻(Karlodinium)和共生甲藻(Symbiodinium)的进化关系。光镜观察表明该藻具有裸甲藻的一些典型的形态学特征，而我们没能获得细胞形态保存完好的电镜样品；进化分析初步鉴定该藻为一种共生甲藻。 获得了赤潮异湾藻[Heterosigma akashiwo (Hada) Hada]的LSU和ITS序列，设计了以胞质rRNA和胞核rDNA为靶序列的特异性探针，建立了赤潮异湾藻的全细胞和细胞核荧光原位杂交技术，对探针的特异性进行了验证，并考察了杂交信号和检测率在整个细胞周期的变化情况。探针能分别使整个细胞和细胞核呈现明亮的绿色荧光。探针是特异性的，不与其它受试藻进行交叉反应。杂交信号在整个细胞周期内变化不明显，且检测率为70%–80%。整个检测过程不到1 ｈ，能实现赤潮异湾藻的快速、准确、特异和半定量检测。 获得了海洋原甲藻(Prorocentrum micans Ehrenberg)的LSU和ITS序列，设计了以胞质rRNA为靶序列的特异性探针，建立了海洋原甲藻的全细胞荧光原位杂交技术，并对探针的特异性进行了验证。探针能使整个细胞呈现强烈的绿色荧光。探针不与其它受试藻种进行交叉反应，表明是特异性的。

栉孔扇贝核心组蛋白的基因结构及H2A抗菌活性的研究

栉孔扇贝是我国传统的海水养殖品种，但自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。目前，虽然针对扇贝养殖环境、病原以及养殖技术等方面开展了大量的研究工作，提出了许多防病治病的措施，并取得了一定的成效。但由于引起养殖扇贝病害的病原和发病原因的多样性，大量使用抗菌素和农药后造成病原微生物抗药性的提高以及对环境造成的严重破坏，贝类养殖业要摆脱病害的困扰，必须开辟新的疾病防治途径。 从扇贝自身的免疫防御因子入手，筛选和克隆参与免疫防御的功能基因，尤其是一些新颖的具有抗菌活性的分子，对于深入探讨扇贝的免疫防御机制，指导扇贝的遗传改良和抗病品系的培育具有重要的意义；另一方面，可对抗菌效应物实现重组表达，开发新型的病害预防治疗制剂，取代目前普遍使用的抗生素和化学药物。抗菌效应物是机体在免疫应答过程中产生的多肽类物质，对侵入生物体内的细菌、病毒具有很强的免疫杀灭作用，对抗菌效应物的研究有助于深入了解机体先天性免疫防御的机制。 本研究在同源克隆策略的基础上，从利用构建的Genome Walking 文库中克隆到了栉孔扇贝核心组蛋白群的全长序列，该串联重复序列全长5671bp，包括各一个拷贝的组蛋白H4, H2B, H2A 和 H3。所有的核心组蛋白在3’侧翼序列均具有与其在细胞周期进化模式相关的特征结构，即两个不同的终止信号：发卡结构和至少一个多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）。在5’区域的起始密码子上游37–45 bp处的保守的CAP位点（5’-PyCATTCPu-3’）存在于除H2B外的每一个基因中；规则的TATA 和CAAT元件也在核心组蛋白群中的个别的基因中找到。在H2B 和H2A基因的启动子区域，对于定位转录起始位点非常重要的元件（5’-GATCC-3’）也相对保守； 在H2B启动子区域存在着与其特征序列（5’-GGAATAAACGTATTC-3’）相似性很高的序列结构5’-GGATCGAAACGTTC-3’。增强子序列只发现存在于H4 和 H3基因中，其序列结构与组蛋白增强子序列(5’-TGATATATG-3’)基本匹配。在组蛋白基因群中存在着一些保守的序列和重复结构表明组蛋白基因的进化是采取“生与死的进化模 式”并伴随着强的纯化选择压力，使得该基因群变异较少以保持其基本功能。同时，利用18S rRNA做参照，探讨了H2A 和H2B作为分子系统进化分析的潜在分子标记，表明组蛋白H2A 和H2B可以作为分子系统进化分析得候选分子，它们在区分近缘种的分辨率上表现出了更高的灵敏度。该研究结果为进一步定性软体动物组蛋白重复单位提供了基础。 在脊椎动物中，组蛋白H2A通过特异性剪切其N末端产生新颖的抗菌肽的形式来参与宿主的免疫应答反应，在软体动物中是否存在同样的机制还未有研究报道。本研究利用上述克隆的H2A基因研究了其在病原胁迫下的表达变化规律并对其N末端39aa进行了重组表达和抗菌活性分析，以期为开发和利用软体动物的新颖的抗菌肽提供理论依据。半定量RT-PCR发现血细胞中H2A 的mRNA 在微生物感染前后的表达量没有任何显著的变化，表明H2A本身并不直接参与对病原的清除过程或者说病原微生物并不能诱导H2A的表达。因此，我们推测该基因可能象脊椎动物一样以前体形式存在，经剪切后参与宿主的免疫应答过程，为此我们研究了H2A的N末端的抗菌活性。通过将与脊椎动物buforin I同源的H2A的N末端39aa克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K实现了该基因N末端的重组表达。抑菌实验表明，重组产物具有广谱的抗菌活性，其对供试的革兰氏阳性菌藤黄微球菌表现出显著的抗菌活性，而对革兰氏阴性菌（鳗弧菌、亮弧菌）的抑菌活性则相对较弱；此外，重组产物对毕赤酵母GS115也表现出一定的杀菌活性，证明其具有抗真菌活性。上述研究结果证明组蛋白H2A的N末端是一种潜在的抗菌肽，但该抗菌肽是否参与机体的免疫应答过程需要进一步的深入研究。

栉孔扇贝大规模死亡病原学研究

用平板画线法从患病栉孔扇贝（Chlamys farreri）体内分离到了一种原核生物（简称QDP）。QDP可以在改进的液体培养基MEM（含2.2%NaCl，5%小牛血清）和脑心浸液（含2.2% NaCl）中生长；菌落在显微镜下（150×）为无色、透明的小点状；革兰氏染色阴性；菌体为圆形或近似圆形。QDP在发育过程中有两种状态，一种为未成熟阶段，直径小于100nm；另一种为成熟阶段，直径变化很大，最小约60nm，最大可达4µm以上。较小的个体有拟核、核糖体和新月状的空泡，未见细胞壁；较大的个体有细胞壁，胞内大部分被空泡充满，未见拟核和核糖体。栉孔扇贝组织超簿切片电镜观查证实QDP的存在。QDP的密度随着生长发育时间的不同而有所变化，繁殖高峰期密度较大。 建立了密度梯度离心结合滤膜过滤分离技术，优化人工培养条件。最适生长温度为23℃，最适生长pH值为7.4，最适生长盐度相当于细胞培养液所需的盐浓度（0.85%NaCl）。 提取的QDP核酸能被RNase A 降解，且没有检测到DNA。以PCR、RT-PCR扩增其16SrRNA基因序列片段，PCR反应没有扩增出扩增子，而RT-PCR则扩增出了16S rRNA基因序列片段，经测定其序列全长度为1430bp，经与GENEBANK中的16S rRNA片段比较分析，与6种不同科的微生物的同源率最高的为95%-95.47%。 采用温度梯度和病原浓度梯度回归感染实验方法，较为系统地研究了QDP的致病性。研究结果表明：QDP对栉孔扇贝有强烈的致病作用，高温（23℃以上）是其致病的必要条件，证实DQP是栉孔扇贝大规模死亡的病原体之一。

青蟹属的系统进化和中国沿海拟穴青蟹的群体遗传结构研究

为了进一步研究青蟹属系统进化的科学问题，并揭示我国东南沿海青蟹群体遗传结构和群体进化细节信息，本论文主要开展了以下两个方面的研究：（1）基于线粒体12S rRNA、16S rRNA和COI三种基因序列探讨中国东南沿海青蟹的种类归属与青蟹属的系统进化；（2）利用线粒体COI基因标记分析中国东南沿海拟穴青蟹的群体遗传结构。序列特征、遗传距离和系统进化分析结果都表明本文研究的青蟹均为S. paramamosain。NJ、BAYES和ML系统进化树显示S. paramamosain与S. tranquebarica互为姐妹种，S. olivecea应该是4种青蟹中最早分化出来的种类。10个地理群体130只拟穴青蟹的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）细胞色素氧化酶亚基I（COI）基因序列Mantel检验结果显示群体间的遗传分化程度与地理距离没有显著的相关性。分子进化中性检验结果表明自然选择在分子进化过程中起了重要作用，并暗示该物种在最近经历了一个快速的群体爆发及扩张事件。

亚历山大藻分子鉴定和荧光原位杂交检测方法研究

近年来，世界沿海国家有害赤潮发生的频率、规模及危害都有上升趋势，有害赤潮已经成为重要的近海环境问题之一。要有效防范有害赤潮带来的危害效应，建立和发展可靠、有效的赤潮监测手段非常重要。目前，对于赤潮藻种的监测主要依靠显微观察的方法，在实际应用中经常遇到困难。首先，亲缘关系相近的物种在形态上差异很小，如甲藻门亚历山大藻属的一些种类，仅细胞壁上个别甲片的结构有细微差别，并且这些形态学指标还容易受环境条件及生长阶段的影响。另外，这种以形态学为基础的分析方法，分析速度慢、耗时长，对操作人员的要求较高，难以满足浮游植物种群动力学监测“量大、连续”的要求。因此，本研究将分子生物学的技术和方法应用于赤潮监测，力求提高赤潮藻种鉴定的准确性和检测工作的效率。 亚历山大藻是一类重要的有害赤潮藻，该藻属中一些产毒特性差别很大的藻种，单从表形特征难以明确区分，从而限制了基于形态观察的监测技术的应用。本研究中，我们尝试应用分子生物学技术与方法，开展了该藻属藻种分子鉴定和荧光原位杂交检测方法的研究。在亚历山大藻的分子鉴定方面，我们采用了核糖体RNA基因（rDNA）序列分析的方法，首次测定了9株分离自中国沿海的（以及实验室保有的其它两株）亚历山大藻的rDNA序列全长，其中包括核糖体小亚基（SSU）rDNA、大亚基（LSU）rDNA、5.8S rDNA及内转录间隔区（ITS）区序列。序列分析结果显示，这些藻株包含了5种核糖体类型，分别是塔玛复合种亚洲温带（Temperate Asian）核糖体类型（TSC-TA），塔玛复合种西欧（West European）核糖体类型（TSC-WE），相关亚历山大藻（A. affine）核糖体类型（AF），微小亚历山大藻（A. minutum）葡萄牙（Portugal）核糖体类型（M-PO）和微小亚历山大藻新西兰（New Zealand）核糖体类型（M-NZ）。将测获的rDNA序列划分为若干保守性不同的区段，分别进行系统发育分析（结合GenBank数据库中保存的其它亚历山大藻相关序列）。结果显示，LSU rDNA D1-D2区是对该藻属藻种进行分子鉴定和系统发育研究的较好区段。同时，为解决建立亚历山大藻克隆培养的困难，我们应用单细胞rDNA序列分析方法，对亚历山大藻单个细胞直接进行了种类鉴定。结果表明，该方法适用于不同生活史阶段的亚历山大藻。 在亚历山大藻的检测技术方面，我们进一步扩展和完善了针对完整细胞的荧光原位杂交检测方法。首先，通过对不同核糖体类型藻株rDNA序列信息的对比分析，针对各自特异的序列位点，设计了特异性rRNA标记探针。经荧光原位杂交实验检验，实现了对5种核糖体类型亚历山大藻的特异性标记。其中，针对WE、M-PO及M-NZ核糖体型的特异性探针为首次获得，另外两个探针是针对TA和AF核糖体类型rRNA新的位点所设计。同时，对影响探针标记效果的诸多因素进行了分析和探讨。此外，在2007年春季长江口海域赤潮调查中，首次应用特异性核酸探针和荧光原位杂交检测方法，调查了该海域亚历山大藻的丰度。结果表明，在4月4日-4月10日的样品中，亚历山大藻达到了较高的密度，最高密度达到103cells/L。同时发现，实验中样品的保存方法有待改进。随后的研究表明，盐醇固定方法及多聚甲醛/甲醇固定方法，可以较好的保持rRNA不被降解并适宜杂交（至少3个月时间）。 总之，本研究首次测定并分析了11株亚历山大藻（9株分离自中国沿海）的rDNA全序列信息。在此基础上，获得了5种核糖体类型亚历山大藻的特异性rRNA标记探针，其中3种为首次获得。另外，实验证明，单细胞rDNA分析技术和荧光原位杂交检测方法，在自然水体中亚历山大藻的直接鉴定及丰度调查中，均具有良好的应用前景。这一工作为我国近海亚历山大藻的鉴定和检测提供了理论依据和方法学基础，希望对该藻赤潮的监测工作有推动作用。 关键词：亚历山大藻 遗传探针 rRNA rDNA 荧光原位杂交 系统发育

鄂霍次克海天然气水合物区柱状沉积物LV39-18H微生物多样性研究

冷泉是指温度接近于海水，而以高于周围水环境浓度的烃类化合物（主要为甲烷）、硫化物或二氧化碳为主要成分，受地质构造或压力梯度作用渗出沉积物表层的流体。对冷泉沉积物中微生物群落的调查，有助于认识该极端环境中某些生理未知微生物类群的功能并理解微生物活动对整个系统的影响。 本文对从鄂霍次克海冷泉区采集获得的沉积物样品按深度划分得到的11个断层中的6个断层进行了总基因组的提取，利用16S rDNA作为分子标记，构建克隆文库并结合总有机碳、总氮、硫等环境因子对该样品中的细菌和古菌群落结构沿沉积物断层的分布情况进行研究，结果显示该沉积物中的细菌和古菌均具有高度多样性且显示出明显的成层分布： 1.细菌群落主要来自10个细菌门，优势门类为绿弯菌、未定门JS1、γ-、δ-变形菌，同时还发现浮霉菌、未定门OP8、放线菌、酸杆菌、拟杆菌、疣微菌的存在。我们还在分布于表层沉积物δ-变形菌类群中发现了占该层群落15%以上的SRB（硫酸盐还原菌）类群，这强烈提示着该沉积物环境中存在着AOM（甲烷厌氧氧化）过程。 2.古菌类群主要划分为DSAG、MBG-D、MCG、MGI、MBG-A和MHVG等类群。其中MBG-D类群沿断层的垂直分布与沉积物中硫含量表现出相似的变化趋势，这提示MBG-D类群可能参与该环境中硫相关的地质化学过程。

软体动物线粒体基因组学及分子系统发生研究

本研究以双壳纲、翼形亚纲、珍珠贝目、扇贝超科的栉孔扇贝(Chlamys farreri )、海湾扇贝(Argopecten irradians)和牡蛎超科巨蛎属(Crassostrea)的长牡蛎(C. gigas)、葡萄牙牡蛎(C. angulata)、熊本牡蛎(C. sikamea)、香港巨牡蛎(C. hongkongensis)和近江牡蛎(C. ariakensis)5种牡蛎及异齿亚纲、帘蛤目、帘蛤科的紫斑文蛤(Meretrix pethechialis)为研究对象，系统的研究了以上物种的线粒体基因组全序列的特点。并以线粒体12个蛋白质编码基因的序列，在氨基酸和核苷酸水平上构建了软体动物的分子系统发生树。本研究旨在为利用线粒体基因组全序列全面构建软体动物分子系统发生树，为软体动物的系统发生和进化研究提供一种新的思路和前期基础工作，本研究主要内容分为以下三个部分： 一、栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体基因组序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR技术扩增了栉孔扇贝和海湾扇贝线粒体全基因组，利用步移法结合文库构建的测序策略获得了线粒体基因组的序列。海湾扇贝线粒体全基因组长度为16,211 bp，栉孔扇贝接近全序列长度为20,789 bp。两个基因组都编码35个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和21个tRNA。与典型的动物线粒体基因组相比，两个基因组都缺少一个蛋白质编码基因atp8和2个trnS, 在海湾扇贝基因组中有1个trnF的重复，而在栉孔扇贝基因组中有1个trnM的重复。基因排列比较显示，尽管海湾扇贝、栉孔扇贝和巨扇贝分类学上属于同一扇贝科，但是它们的线粒体基因排列非常不同。在四种扇贝中，虾夷扇贝与栉孔扇贝的基因排列顺序非常相似；即使排除tRNA的比较，栉孔扇贝和海湾扇贝基因组仅仅共享三个小的基因块；而海湾扇贝与巨扇贝仅有一个相同的基因块。在所有的系统发生分析中，四种扇贝稳定的系统发生关系得到强有力的支持，海湾扇贝较其他三种扇贝较早的分化出来；栉孔扇贝比其他两种扇贝与虾夷扇贝亲缘关系更近。贝叶斯法和最大似然法分析都支持扇贝超科的单系发生。 二、巨蛎属牡蛎线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了巨蛎属C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis 5种牡蛎线粒体全基因组序列，并于GenBank已公布的美洲牡蛎C.virginica序列进行比较研究。C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis线粒体全基因组长度分别为18,225 bp、18,225 bp、18,243 bp、18,622 bp和18,414 bp，都长于C. virginica基因组17,244 bp的长度。本研究的5种牡蛎线粒体基因组都编码39个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和25个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，都缺少一个蛋白质编码基因atp8，有trnM、trnK和trnQ 3个tRNA基因的重复，更特别的是基因组中的rrnL分为两段，这在其它线粒体基因组中未见报道，有一个重复的rrnS；而C. virginica基因组编码37个基因，与其他牡蛎相比，没有trnK和trnQ重复，只有一个rrnS。基因排列比较显示，巨蛎属的5种牡蛎C. gigas、C. angulata、C. sikamea、C. hongkongensis和C. ariakensis基因排列完全一致，而与C. virginica的基因排列相比仍然有较大的差别，有多个tRNA发生易位。系统发生分析显示，C. gigas和C. angulata首先聚在一起，然后与C. sikamea聚为一支。C. hongkongensis和C. ariakensis聚成一支。C. virginica为单独的一支。系统树清楚的显示出C. gigas和C. angulata以及C. hongkongensis和C. ariakensis非常近的亲缘关系，这也是长期以来，牡蛎分类学上的经典问题，有学者认为C. gigas和C. angulata为同一物种，线粒体基因组的数据显示C. gigas和C. angulata可能达到不同物种的差异。传统分类上的“近江牡蛎”的“白蚝”和“赤蚝”，线粒体序列差别明显，完全支持两种牡蛎新种名的制定。 三、紫斑文蛤线粒体基因组全序列分析及分子系统发生研究 采用Long-PCR扩增技术和步移法结合文库构建的技术策略获得了紫斑文蛤线粒体基因组全序列。该基因组全长19,567 bp，编码36个基因，包括12个蛋白质编码基因，2个rRNA和22个tRNA。与典型的线粒体基因组相比，缺少一个蛋白质编码基因atp8和1个trnS, 有1个trnQ基因的重复。基因排列比较显示，双壳类的基因排列在低的分类阶元时相对保守。在帘蛤科中，紫斑文蛤M. petechialis和菲律宾蛤仔V. philippinarum共享四个完全一致的基因块，两个大的基因块是cox1-L1-nad1-nad2-nad4L-I 和 cox2-P-cob-rrnL-nad4-H-E-S2-atp6-nad3-nad5，另两个小基因块只包括tRNA基因。在以氨基酸序列构建的分子系统树中，帘蛤科紫斑文蛤与菲律宾蛤仔首先聚在一起，然后，它们与A. tuberculata形成一个进化枝。这一枝与H. arctica结合起来，支持异齿亚纲单系发生。

东、西太平洋深海沉积物细菌多样性研究

深海生物圈有着不同于陆地和浅海的典型特点，例如高压、低温、永久黑暗及寡营养，并且深海微生物具有特殊的代谢途径及庞大的生物量，这使得深海成为一个巨大的有待开发利用的生物资源宝库。 本文研究的样品分别取自东太平洋E272站位(12°36’39"N, 104°19’28"W)和西太平洋Ph05-5站位(16°04’93"N, 124º34’48"E)。E272站位距离东太平洋13°N海隆45km，水深3 191m；而Ph05-5站位地处西菲律宾海盆，在黑潮源区附近，位于西太平洋暖池区边缘，水深3 382m，并且Ph05-5岩芯一共包含了五个明显的火山灰层。 本文采用了末端限制性片段长度多态性分析（T-RFLP）和16S rRNA 基因文库分析的方法在小尺度上对东太平洋E272站位的沉积物样品进行细菌群落结构的研究。研究结果表明沉积物细菌群落结构在小尺度上存在明显的垂直变化。系统进化分析表明，该沉积物样品的细菌多样性较高，共包含9个主要的门类，包括变形菌门、绿弯菌门（绿色非硫细菌）、浮霉菌门、酸杆菌门、放线菌门（高G+C革兰氏阳性菌）、拟杆菌门、硝化螺旋菌门、以及两个待定的门类OP8和TM6。其中变形菌门细菌是一类在海洋中非常常见的细菌，广泛分布于各个海洋环境，在我们的文库当中发现了变形菌门的三个纲，包括α-、-、-变形菌纲。本项研究充分表明该沉积物环境中具有较高的细菌多样性，在小尺度上细菌群落垂直分布明显，其结果也可从侧面反映深海沉积物近表层处的环境条件在小尺度上的垂直变化显著。 对西太平洋暖池区沉积物样品的细菌群落的研究也采用16S rRNA 基因文库分析的方法。系统进化分析表明该沉积物样品细菌的多样性相对较低，一共包含了六个不同的门类，包括变形菌门、浮霉菌门、放线菌门、厚壁菌门（低G+C革兰氏阳性菌）、绿弯菌门、酸杆菌门。在这个沉积物样品中也发现了变形菌门的三个纲包括α-、-和-变形菌纲。聚类分析和系统进化分析都表明表层的细菌群落同其它8层的细菌群落存在明显的差异，并且其它8层包括5个火山灰层和3个远洋粘土层的细菌群落结构差异不大，推测火山灰成分不仅对火山灰层的细菌群落产生影响，而且可能通过扩散对整个沉积物的微生物群落结构都产生影响。表层可能由于沉积时间较晚所以受影响相对较小或表层本身不同于较深层次的理化条件而使表层群落存在较大差异。 对东、西太平洋不同环境下的两个深海沉积物样品的细菌多样性进行比较，结合其它研究发现变形菌门细菌在不同深海环境中都普遍存在，是深海不同环境的广适类群。另外，两个环境中的细菌多样性存在很大差异，东太平洋沉积环境中的细菌多样性要远高于西太平洋沉积环境中的细菌多样性，推测其最可能的原因是西太平洋沉积物火山灰成分对细菌群落的影响，致使其细菌群落与东太平洋远洋粘土沉积物细菌群落产生很大差异；另外，不同洋区的环境差异也应该是造成细菌群落差异的一个重要方面。

A bioaugmentation failure caused by phage infection and weak biofilm formation ability

Two biological aerated filters (BAF) were setup for ammonia removal treatment of the circulation water in a marine aquaculture. One of the BAFs was bioaugmented with a heterotrophic nitrifying bacterium, Lutimonas sp. H10, where the ammonia removal was not improved and the massive inoculation was even followed by a nitrification breakdown from day 9 to 18. The nitrification was remained stable in control BAF operated under the same conditions. Fluorescent in situ hybridization (FISH) with rRNA-targeted probes and cultivable method revealed that Lutimonas sp. H10 almost disappeared from the bioaugomented BAF within 3 d, and this was mainly due to the infection of a specific phage as revealed by flask experiment, plaque assay and transmission electron observation. Analyses of 16S rRNA gene libraries showed that bacterial groups from two reactors evolved differently and an overgrowth of protozoa was observed in the bioaugmented BAR Therefore, phage infection and poor biofilm forming ability of the inoculated strain are the main reasons for bioaugmentation failure. In addition, gazing by protozoa of the bacteria might be the reason for the nitrification breakdown in bioaugmented BAF during day 9-18.

Isolation and identification of bacteria associated with the surfaces of several algal species

We conducted this study to assess the diversity of bacteria associated with the surfaces of algae based on 16S rDNA sequence analyses. Twelve strains of bacteria were obtained from the surfaces of the following four species of algae: Gracilaria textorii, Ulva pertusa, Laminaria japonica, and Polysiphonia urceolata. The isolated strains of bacteria can be divided into two groups: Halomonas and Vibrio, in physiology, biochemical characteristics and 16S rDNA sequence analyses. The phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences of the isolates shows four obvious clusters, Halomonas venusta, Vibrio tasmaniensis, Vibrio lentus, and Vibrio splendidus. Isolates from the surface of P. urceolata are more abundant and diverse, of which strains P9 and P28 have a 16S rDNA sequence very similar (97.5%-99.8%) to that of V. splendidus. On the contrary, the isolates from the surfaces of G textorii, U. pertusa and L. japonica are quite simple and distribute on different branches of the phylogenetic tree. In overall, the results of this study indicate that the genetic relationships among the isolates are quite close and display a certain level of host species specificity, and alga-associated bacteria species are algal species specific.

Antimicrobial screening and active compound isolation from marine bacterium NJ6-3-1 associated with the sponge Hymeniacidon perleve

Twenty-nine marine bacterial strains were isolated from the sponge Hymeniacidon perleve at Nanji island, and antimicrobial screening showed that eight strains inhibited the growth of terrestrial microorganisms. The strain NJ6-3-1 with wide antimicrobial spectrum was identified as Pseudoalteromonas piscicida based on its 16S rRNA sequence analysis. The major antimicrobial metabolite, isolated through bioassay-guide fractionation of TLC bioautography overlay assay, was identified as norharman (a beta-carboline alkaloid) by EI-MS and NMR.

Isolation and characterization of novel marine Roseobacter clade members producing unique intracellular chromium-rich aggregates

The marine Roseobacter clade comprises one of the largest fractions of heterotrophic marine bacteria and accounts for about 16% of 16S rRNA gene clones retrieved from marine bacterioplankton. Their global distribution seems to be related to oceanic water masses and their environmental and biogeochemical properties. In this study, we report isolation and characterization of novel Roseobacter clade members from the Yellow Sea, China. Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences reveals that the new isolates (YSCB1, YSCB2, YSCB3 and YSCB4) are closely related to uncultured Arctic seawater bacterium R7967 (99.57-100% sequence identity) and to the cultured Roseobacter sp. DSS-1 (99.27-99.76% sequence identity) isolated from the southeastern coastal water of the USA. Interestingly, YSCB strains possess unique intracellular chromium-containing aggregates. Therefore, these novel Roseobacter clade members exhibit a peculiar property in mineral biogeneration. (c) 2006 Elsevier SAS. All rights reserved.

Isolation and characterization of a marine magnetotactic spirillum axenic culture QH-2 from an intertidal zone of the China Sea

Magnetotactic bacteria (MTB) are ubiquitous in aquatic habitats. Because of their fastidious requirements for growth conditions, only very few axenic MTB cultures have been obtained worldwide. In this study, we report a novel marine magnetotactic spirillum axenic culture, designated as QH-2, isolated from the China Sea. It was able to grow in semi-solid or liquid chemically defined medium. The cells were amphitrichously flagellated and contained one single magnetosome chain with an average number of 16 magnetosomes per cell. Phosphate and lipid granules were also observed in the cells. Both rock magnetism and energy-dispersive X-ray spectroscopy characterizations indicated that the magnetosomes in QH-2 were single-domain magnetites (Fe3O4). QH-2 cells swam mostly in a straight line at a velocity of 20-50 mu m/s and occasionally changed to a helical motion. Unlike other magnetotactic spirilla. QH-2 cells responded to light illumination. As a consequence of illumination, the cells changed the direction in which they swam from parallel to the magnetic field to antiparallel. This response appears to be similar to the effect of an increase in [O-2]. Analysis of the QH-2 16S rRNA sequence showed that it had greater than 11% sequence divergence from freshwater magnetotactic spirilla. Thus, the marine QH-2 strain seems to be both phylogenetically and magnetotactically distinct from the freshwater Magnetospirillum spp. studied previously. (C) 2010 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

Morphology and Molecular Phylogeny of Trimyema koreanum n. sp., a Ciliate from the Hypersaline Water of a Solar Saltern

A new ciliate, Trimyema koreanum n. sp., isolated from hypersaline water (salinity of 293 parts per thousand) from a solar saltern in Korea, was investigated using live observation, protargol impregnation, and gene sequencing. Trimyema koreanum is about 30 x 13 mu m in vivo, has usually 23 longitudinal ciliary rows forming two distinct ciliary girdles visible both in vivo and in protargol impregnation. A third indistinct ciliary girdle as well as a girdle of mucocysts is distinguishable only in impregnated cells. We suggest T. koreanum as a new species, differing from the most similar species, T. marinum, by the presence of two distinct ciliary girdles (T. marinum usually has six ciliary girdles clearly visible in living cells and three anterior spirals that encircle the cell completely). Although the number of known 18S rRNA sequences in the genus Trimyema was limited, the Trimyema group including T. koreanum forms a strong clade. The phylogenetic position confirms that the isolate belongs to the genus Trimyema and is different from previously sequenced species. Trimyema koreanum is able to consume both prokaryotes and small eukaryotes (specifically, the alga Dunaliella sp.).

Tandem duplication-random loss is not a real feature of oyster mitochondrial genomes

Duplications and rearrangements of coding genes are major themes in the evolution of mitochondrial genomes, bearing important consequences in the function of mitochondria and the fitness of organisms. Yu et al. (BMC Genomics 2008, 9: 477) reported the complete mt genome sequence of the oyster Crassostrea hongkongensis (16,475 bp) and found that a DNA segment containing four tRNA genes (trnK(1), trnC, trnQ(1) and trnN), a duplicated (rrnS) and a split rRNA gene (rrnL5') was absent compared with that of two other Crassostrea species. It was suggested that the absence was a novel case of "tandem duplication-random loss" with evolutionary significance. We independently sequenced the complete mt genome of three C. hongkongensis individuals, all of which were 18,622 bp and contained the segment that was missing in Yu et al.'s sequence. Further, we designed primers, verified sequences and demonstrated that the sequence loss in Yu et al.'s study was an artifact caused by placing primers in a duplicated region. The duplication and split of ribosomal RNA genes are unique for Crassostrea oysters and not lost in C. hongkongensis. Our study highlights the need for caution when amplifying and sequencing through duplicated regions of the genome.