雨生红球藻诱变育种及突变株的筛选

虾青素是良好的着色剂，具有超强的抗氧化、捕获自由基、抗癌变，抗紫外线辐射、增强免疫等功能，在医疗、水产、食品和化妆品等生产领域有着广泛的市场。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）是一种单细胞的绿藻，在逆境条件下可积累高达4%干重的虾青素，是目前已知的天然虾青素含量最高的生物资源，规模化培养雨生红球藻是获取天然虾青素的最佳途径。 目前实验室研究和规模化培养使用的藻株多为出发株，存在一些缺陷：养殖过程中易被其它微藻、变形虫、原生动物、细菌等污染；只适合低温培养，28℃以上生长受抑制；生长相对较慢，培养周期长；尽管雨生红球藻是已知的天然虾青素含量最高的生物资源，但其含量仍然需要提高以适合规模化生产。因此筛选出温度适应范围广、生长速率快、虾青素含量高的雨生红球藻株一直是努力的方向。 本研究选用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）和叠氮钠(NaN3)以及物理诱变剂紫外线（UV)分别处理雨生红球藻，测定各种诱变剂的致死率，及对红球藻生长和虾青素积累的影响，根据实验结果确定合适的诱变剂量和诱变时间，通过初筛、复筛、再次诱变等分离、筛选出生长速度快、虾青素含量高的单一藻株并进一步利用高压液相色谱等方法进行鉴定。 实验结果表明：浓度为0.2％-1.0％EMS处理4h，雨生红球藻H2的死亡率7%-35%；紫外线照射2min-10min，雨生红球藻H0的死亡率10%-98％；叠氮钠30mg/L－270 mg/L处理24h，雨生红球藻H0的死亡率为20％-100％。各种诱变剂诱变结束后立即观察发现死亡细胞的形态相似但存活细胞相态有所不同，死亡细胞呈浅绿色，轮廓模糊，形状不规则，质壁间隙消失，胞内有白色空泡；EMS处理后存活细胞，呈圆球状，部分失去鞭毛和前端突起，游动缓慢，处理后第二天，细胞即恢复游动和分裂，分裂方式与正常细胞相似。紫外线和叠氮钠处理后存活细胞壁加厚，呈深绿色，圆球状，部分失去鞭毛和突起，严重抑制细胞的游动和分裂，出现不动细胞，培养一段时间后才出现分裂细胞，游动的和不动的存活细胞主要是采用不对称无性繁殖，这与正常细胞的不对称无性繁殖有所不同，正常细胞中不对称无性繁殖的母细胞多为不动细胞。紫外线和叠氮钠处理后部分细胞还产生大量的小孢子（配子？），直径较小1-4m，在母细胞内不停摆动，四、五天后逐渐脱离母细胞。这和以前描述的有性繁殖很相似，但由于没观察到后期孢子配对过程和缺乏小孢子的DNA含量和倍性的有关数据，不能确定观察到的小孢子现象为雨生红球藻的有性繁殖。 各种诱变剂处理后，各组存活藻株的生长和虾青素积累情况同对照组相比发生了变化：EMS实验中0.4％EMS组生长速率提高24％，其它组的细胞生长速率有所降低。各组单细胞虾青素含量和积累速率均高于对照组，其中0.4％和0.8％处理组单细胞内虾青素含量分别提高了76％和90％，积累速率分别提高了69％和115％；紫外线实验中4min、6min和10min组生长速率分别提高20％、17％和35%，各组藻细胞虾青素积累速率有不同程度的提高，其中2min组和10min组虾青素积累速率提高幅度最大分别为32%和31%，单细胞内虾青素含量除10min处理组提高48%，其它各组均有不同幅度的降低；叠氮钠实验中60mg/L、120mg/L和180mg/L组细胞生长速率分别提高了13％、20％和9％，各组藻细胞内虾青素含量和虾青素积累速率得到明显的提高。其中60 mg/L和180 mg/L组单细胞内虾青素含量提高幅度最大，分别提高75%和140%。180mg/L和240mg/L组虾青素积累速率提高幅度最大，分别为280％和250％。 诱变后通过固体平板分离，得到一系列单一藻株，其中0.4%浓度EMS处理雨生红球藻H2 4h后分离到H2-419在生物量上比H2高出20％,但虾青素含量提高幅度不大。用UV对突变株H2-419再次诱变得到较稳定的藻株H2-419-4，培养五个月后与H2相比生物总量提高68%，单细胞内虾青素含量提高28％，经高压液相色谱分析证明H2-419-4类胡萝卜素提取物中主要成分仍然为虾青素，和出发株H2相比色素成分没有发生变化，只是各成分比例有所不同。 还分析研究了其它单一藻株，但或是稳定性较差，或虾青素含量高而生长慢。如雨生红球藻H2经0.02％EMS诱变十天，分离得到的E-L-22和出发株相比虾青素产量提高40％，但生物总量上降低了27％；5min紫外线照射雨生红球藻H0后，分离得到的UV-5-16和UV-5-14在生物总量分别提高7％和36％。叠氮钠200mg/L处理24h分离得到的藻株N-2-42生物总量提高43％，但藻株N-2-43生物总量比出发株降低8％。

南海上层海洋变异分析及海表温度统计学可预报性试验

气候变化和异常是当今地球科学研究的重大课题之一，与人类的生存、发展密切相关。南海作为我国最大的边缘海, 位于夏季风气流上游, 同时，作为热带太平洋的边缘海，具有显著的年际变异特征。近年来，随着卫星资料的积累和产品化使得我们有机会对南海的上层海洋要素进行全面的直接的观察，并进行南海气候异常变异及其可预报性的研究。 本文的研究内容就是利用近年来卫星资料产品，对南海主要海面要素，包括海面风场（SW）、表层温度场（SST）、海面高度场（SSH）的气候变化趋势以及南海表层温度变异的可预测性进行细致的探讨，并且利用较新的分析方法对南海上层海洋要素在近年来的非线性变异特点进行了分析。主要工作包括： 1. 采用南海卫星高度计及具有高精度模式输出结果通过联合经验正交函数分解（EOF）得到空间分辨率为1/3°×1/3°的南海绝对动力地形及地转流的季节变化（1－12个月）。从地转流场可以看到南海内部的表层流场主要有3种流系：西边界流、离岸流及南海多涡涡旋结构。 2. 通过南海海表大气和海洋要素（SW、风应力、SST、SSH）的气候变化趋势分析计算得到南海SST平均增暖0.5K/decade，海面高度升高6.7cm/decade，表层风场东分量和北分量的变化趋势分别为0.5m/s/decade、-0.04m/s/decade。其中南海SST增暖趋势和海面抬升速率远大于全球增暖和海面抬升速率。 3. 对南海SW、SSH和SST的异常场的EOF分析揭示南海SW、SSH及SST的年际尺度变化均表现出与ENSO变异现象一定的相关性：其中南海SW的第一模态特征表现为海盆尺度的反气旋，是西太平洋反气旋的最西南的一部分。对应的时间系数函数（TCF）滞后Nino3.4指数3个月，相关系数较高为0.90。南海SW的第二模态特征表现为均一化的西南风，TCF与印度洋偶极子（IOD）指数有一定相关性：TCF超前IOD指数4个月，相关系数达到0.58,表明南海SW第二模态似乎可以用来作印度洋偶极子现象的一个前兆。南海SSH的EOF第一模态特征为沿着南海东边界低水位，对应的TCF滞后Nino3.4指数2个月时间，二者相关系数为0.94；南海SST的EOF第一模态特征表现为整个海盆的增暖，对应的TCF与滞后Nino3.4指数8个月，相关系数等于0.62。 4. 基于典型相关分析（CCA），利用南海SSTA滞后热带太平洋Nino指数及印度洋IOD指数的关系建立南海SSTA的统计预报模式。通过对南海SSTA后报试验（1993/1994-2004年10月）与持续性预报值的预报效果进行比较分析，表明基于CCA统计方法对南海SSTA后期预报在预报时效超过3个月以上时具有更好的稳定性，提前1～12个月的后期预报水平平均值为0.60左右，误差均方根大约0.2个标准差。综合热带太平洋Nino指数为预报因子作南海SSTA统计预报的平均水平为0.55左右，亦具有较好的稳定性。 5. 基于前馈型神经网络，对南海近年的表层要素场（SW、SSH、SST）作非线性EOF分析。其中非线性EOF第一模态方差贡献与线性EOF相比均相应提高：海面风场、海面高度场的非线性作用较强，非线性EOF第一模态对变量场的方差贡献与线性EOF方法相比分别从54.75%提高到67.26%和50.43%提高至60.24%，非线性曲率强的空间范围占据绝大部分南海海域；相比较而言，南海SSTA场的非线性EOF第一模态的方差贡献提高不明显,非线性特征明显的区域仅在南海北部和南部靠近大陆的海区。对南海SSTA场1982-2003年时间长度的数据进行非线性与线性EOF分析比较，发现南海SSTA在近20年的非线性EOF分析中得到的非线性特征更不明显，表明与前10年相比，南海近10年的南海SSTA场的非线性成分有所增强。

双刺纺锤水蚤（Acartia bifilosa）基础生物学与生态学研究

20世纪90年代以来，为了确保日益增长的人口对蛋白质的需求，海洋鱼类养殖在全球范围内日趋发展。然而，许多养殖鱼类的品质如抗病力、口味等与野生种类相比大为降低。饵料对于鱼类品质的好坏起着至关重要的作用。在海洋的自然环境中，浮游动物，特别是数量庞大、种类繁多的桡足类是野生鱼类的天然活饵料。哪些桡足类适于作养殖饵料，如何获得、从何处获得桡足类，人工培养是否可行，能否通过加入桡足类来改善养殖鱼类的品质是长期以来业内人士一直关注的问题，需要大量的基础性探索研究工作。 开展有潜在开发价值种的生物学特性及室内培养的基础研究，进而开展大量生产技术的研究与应用，不仅是开发利用桡足类的一个重要途径，而且可以获得一些重要的生态学参数。 本论文自2003年10月－2004年9月之间，在胶州湾采集不同的桡足类种类，通过室内比较培养实验，选定双刺纺锤水蚤作为具有开发潜力的研究培养对象，对其展开一系列培养条件及生物学特性研究，在此基础上进行了小水体增殖培养，结合现场调查资料对与其生活策略相关的生态学问题进行了初步研究探索。结果如下： 筛选：2003年10月－2004年9月全年不同季节共采集11 种桡足类，在室内自然温度、自然海水（盐度30－32）下长时间培养，粗略筛选出能够经受实验室人工养殖水体生活的种类有：强额拟哲水蚤（Paracalanus. crassirostris）、汤氏长足水蚤（Calanopia thompson）、太平洋真宽水蚤（Eurytemora pacifica）、双刺纺锤水蚤（Acartia bifilosa）。对上述种类的成体和子代幼体分别测定其对不同盐度、温度的耐受能力。培养结果表明：18℃室温下，强额拟哲水蚤幼体在盐度20以上的环境中，存活时间不超过11天；汤氏长足水蚤雌体在培养温度低于20℃时，只能存活10天；25℃室温下，当盐度低于20时，汤氏长足水蚤雌体存活时间不超过9天，子代的存活时间不超过7天；太平洋真宽水蚤不适宜在温度较高的夏秋季培养，幼体在不同盐度的实验条件下存活时间不超过5天，不适宜长期培养；双刺纺锤水蚤在全年8－24℃的室内培养温度范围内保持了24－85％的存活率，雌体和子代在盐度10－35的范围内都能存活，最终结果表明双刺纺锤水蚤是其中最适宜进行人工培养的种类。 繁殖：对双刺纺锤水蚤雌体的培养条件和繁殖生物学的研究结果表明：在本实验所使用的6种微藻饵料：微绿球藻（Nannochloropsis oculata）、小球藻（Chlorella.sp）、等鞭金藻（Isochrysis galbana）、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、亚心型扁藻(Platymonas subordiformis)、中肋骨条藻(Skeletonema costatum)中，亚心型扁藻和中肋骨条藻适宜成体培养，亚心型扁藻对雌体存活有利，排粪率也要比中肋骨条藻低得多，亚心型扁藻在高温条件下的饵料利用效率要高于中肋骨条藻，中肋骨条藻对产卵有利，二者混合优势互补；预饥饿处理的双刺纺锤水蚤恢复到最高产卵率需要较长的时间，并且一直保持较低的产卵率；该种繁殖的最适温度范围15－20℃；在10－25℃温度范围内的平均产卵率差异并不显著。 生长及发育：对双刺纺锤水蚤幼体培养条件及发育生物学研究结果表明：在本实验所使用的6种微藻饵料中，微绿球藻是比较理想的开口饵料；粒径小（ 4 m）的微藻——微绿球藻和小球藻不能保证双刺纺锤水蚤后期无节幼体发育至桡足阶段，22℃以下采用微绿球藻 + 亚心型扁藻 + 中肋骨条藻的食物搭配，22℃以上需加入粒径在4m左右的等鞭金藻。 世代时间：通过一系列的温度梯度实验，证明在相同饵料的情况下，温度对双刺纺锤水蚤的发育具有显著的影响，在15－25℃的范围内，随着温度的升高，生长速度加快、世代周期缩短；在温度条件为15、18、20、22、25℃下的世代时间分别为25.5, 18.5, 13, 11.5, 9.5天。 群体培养：研究了适宜的微藻饵料种类搭配比例以及总饵料浓度对种群日均增值率的影响。结果表明：20℃下培养宜采用亚心型扁藻：中肋骨条藻：微绿球藻按含碳量2:1:1的比例组成混合饵料，达到最高增殖率的混合饵料浓度范围在1.0－4.0 μg C ml-1之间；25℃下培养宜采用亚心型扁藻：中肋骨条藻：微绿球藻：等鞭金藻按含碳量2:1:1:2的比例组成混合饵料，日均增殖率在混合饵料总浓度为1.0 μg C ml-1 时最高，低于和高于此浓度都会降低日增值率。 度夏机制：针对野外大面调查发现双刺纺锤水蚤在高温季节的胶州湾内仍然存在的事实（传统观点认为该种在夏季从水体中消失，通过休眠卵度夏），本论文从基础生态学研究出发，根据胶州湾夏季的温度和叶绿素浓度资料，设计实验研究了高温和饵料浓度对成体繁殖和幼体生长发育的影响。实验发现，饵料浓度对高温下雌体的繁殖有着明显的影响，15g Chla l-1浓度下的雌体在28℃都可以保持产卵状态，而且卵的孵化率也在50％以上；各处理中的卵都很快孵化，并保持了60％以上的孵化率；高浓度组15 g Chla l-1和10 g Chla l-1，无节幼体都能发育至成体，低浓度5 g Chla l-1处理组中，28℃下，不能发育至桡足阶段，而25℃下也只能发育至C4期。在本实验中没有发现双刺纺锤水蚤产生休眠卵。在胶州湾自然环境中发现该种全年存在。胶州湾中的双刺纺锤水蚤在夏季能够在不产生休眠卵的情况下安全度夏。

牙鲆性腺分化发育及类固醇激素T和E2对性腺分化的影响

本文采用组织学手段研究了牙鲆性腺在分化、发育和成熟过程中的变化。然后，通过放射性免疫方法（RIA）测定了牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆液中的性类固醇激素—睾酮（T）和雌二醇（E2）的含量，并结合牙鲆血清中T和E2含量的年周期测定，从内分泌学水平探讨了T和E2在其性腺分化、发育和成熟过程中水平的变化规律。同时，采用高温和雌性激素对性腺未分化的普通和雌核发育牙鲆仔稚鱼进行诱导处理，获得了较高比例的雄性鱼/假雄鱼或100%雌性鱼；并研究了这些外界环境因子对牙鲆性腺分化、性别比率及体内T和E2水平的影响，藉此探讨了牙鲆性别决定与性腺分化的细胞学和内分泌学机制。 对牙鲆仔稚幼鱼性腺的组织切片观察发现，培育水温18~20℃下，孵化后第45天、平均全长<22.0±2.8 mm的牙鲆，其性腺分化尚未开始，属于原始性腺；在孵化后70日龄、平均全长为38.0±1.7 mm左右，部分个体中观察到卵巢的雏形，其余个体的性腺在此阶段以及之后的一段时间内变化并不明显；到了第110天、平均全长达到86.5±5.9 mm时，雌性个体卵巢出现了卵原细胞向卵母细胞的转变，标志着卵巢分化的结束。在90日龄、平均全长为63.5±3.4 mm的雄性牙鲆中，精原细胞快速增殖，并观察到了输精管结构；进一步的细胞学分化则出现在100日龄、平均全长为76.0±8.6 mm的个体中，此时可以看到精小叶的形成；在平均全长为140.0±15.2 mm时，精巢中出现初级精母细胞，标志着性腺分化的基本完成。 对牙鲆仔稚幼鱼全组织匀浆和成鱼血清中的T和E2水平的比较发现，在全长为6 mm左右的仔鱼中T和E2含量均较高。随后，在性腺分化过程中T含量大大降低，E2的含量急剧增高，而性腺分化后期E2含量又降到较低的水平。在雄性牙鲆成鱼中， 从精巢第Ⅲ期开始，T含量随着精巢的发育而增加，到了精巢第Ⅴ期性腺发育成熟并排精后，又降低到较低的水平；E2含量在从精巢第Ⅲ期发育至精巢第Ⅴ期过程中略呈降低的趋势，但是总体上来说没有明显的差异。在雌性牙鲆成鱼中，卵巢从第Ⅱ期到第Ⅳ期的过程中，T水平逐渐升高，在第Ⅴ期时则明显降低；而E2含量在卵巢第Ⅱ期时保持较低的水平，随着卵巢的发育，E2含量逐渐增高，在卵巢第Ⅳ期时达到最高水平，在第Ⅴ期产卵后又有所降低。在雌雄个体中T和E2均呈现周期性的变化。5月份随着水温的升高，雄性个体T和E2含量显著上升；到了9月份又逐渐下降至最低值。雌性个体E2含量自3月份开始增高，在5月份急剧升高，并在6月份达到最高值；在7月份的时候，E2突然降低，而到了8月份又有所回升；9月份之后E2逐渐降低并在1月份左右降到最低；而T的含量分别在2月份和6月份出现两次高峰。 温度诱导牙鲆幼鱼性腺分化的结果表明，牙鲆中存在明显的TSD机制，即其性腺分化因饲育水温的不同而变化：在一定温度范围内，随着饲育温度的增加，牙鲆的雄性比例逐渐增高，常温对照组和21℃组中的雄性比例分别为51.62%、60.00%，而在24℃和28℃高温组中，雄性比例显著高于对照组，分别达到73.33%和87.27%。T和E2含量测定显示，在性腺分化时期，高温和对照组中T含量没有明显的变化，而温度处理组中的E2水平则低于对照组，特别是在28℃高温组，其E2水平显著低于对照组（P<0.05）。外源E2处理性腺未分化的牙鲆幼鱼的结果也表明，牙鲆的死亡率与雌性化比率均为雌性激素剂量依赖型的。随着外源E2剂量的增加，雌性比率增加，但同时死亡率也增高。此期间T和E2水平比较发现，在性腺分化时期，对照组中的T含量稍高于雌激素处理组；而对照组中的E2含量高于0.2 ppm和2 ppm两个低剂量组，却低于20 ppm和100 ppm两个高剂量组。 同时，还对人工诱导培育的雌核发育牙鲆和性反转牙鲆进行了性腺发育观察，在所观察的雌核发育牙鲆个体中，其雌性比例为83.33%，而高温28℃饲育群体中的雄性比例（即假雄鱼比例）为91.67%；在雌性个体中，也有一定比例的个体性腺发育不正常，有的性腺发育较小，有的则缺少部分性腺。进一步对雌核发育成体的血清中T和E2含量进行测量，发现在普通牙鲆个体中T含量显著低于雌核发育个体，而E2含量则高于雌核发育牙鲆；在雌核发育牙鲆中，性腺发育不正常的个体比性腺发育正常的个体中的T含量稍高，而E2含量则显著低于正常雌核发育牙鲆个体和普通牙鲆个体（P< 0.05）。

中国明对虾重要分子伴侣蛋白基因的克隆及表达研究

对虾养殖业的可持续发展面临着种质退化、病害严重和养殖环境恶化等问题的严重挑战。养殖环境恶化造成的环境胁迫，不但影响对虾的生长性状，而且导致对虾的抵抗力下降，更容易引发病害的发生。养殖环境恶化已经严重影响了对虾养殖业的健康可持续发展。本论文针对环境恶化造成的环境胁迫对对虾影响的分子机理进行了研究。 克隆了中国明对虾对环境胁迫应答的重要伴侣蛋白基因，包括钙网蛋白（FcCRT）、葡萄糖调节蛋白78 （FcGrp78）、热休克蛋白70（FcHsp70）和热休克蛋白90（FcHsp90）的全长cDNA，研究了这些基因的组织表达特征，并对这些基因在不同胁迫条件下的转录表达特征进行了分析。 钙网蛋白是一种多功能的内质网钙结合蛋白，负责蛋白折叠和糖蛋白修饰。本论文首次在中国明对虾报道了钙网蛋白FcCRT基因的全长cDNA序列，编码406个氨基酸，具有保守的N-，P-和C-功能域，以及信号肽和保守的HDEL内质网回收标签。FcCRT基因与其它物种的钙网蛋白具有高度的相似性，系统进化分析表明，FcCRT在亲缘关系上更接近昆虫的钙网蛋白。Northern blot和原位杂交结果显示，FcCRT基因在中国明对虾各组织中均有表达，且在卵巢中发育早起的卵母细胞中表达量最高，说明FcCRT很可能参与了卵母细胞的成熟。FcCRT基因在不同胁迫条件下，其转录表达均呈现明显的变化。在WSSV感染实验中，中国明对虾肝胰脏和淋巴器官中FcCRT转录表达均明显上调；热休克、重金属处理均可引起FcCRT基因转录表达的变化，但不同重金属处理引起FcCRT转录表达变化的模式不同。铜离子处理6小时，会引起FcCRT基因的下调表达，但在12小时之后出现明显上调；镉离子处理12小时后引起FcCRT基因的下调表达，但在24小时又出现明显的上调表达。 葡萄糖调节蛋白78（GRP78）是内质网重要的伴侣蛋白。中国明对虾的Grp78基因（FcGrp78）的cDNA全长为2325bp，编码665个氨基酸。FcGrp78具有三个Hsp70蛋白家族标签，并含有KDEL内质网回收标签。FcGrp78基因与中国明对虾已有的Hsc70和Hsp70具有高度相似性。Northern blot杂交结果显示FcGrp78基因在中国明对虾各组织中均有表达。FcGrp78基因在WSSV感染的中国明对虾肝胰脏中呈上调表达，在血细胞中下调表达，说明FcGrp78可能与对虾的免疫应答有关。热休克处理会诱导FcGrp78基因转录的上调。不同重金属离子胁迫引起的FcGrp78转录表达有所不同：铜离子处理可以诱导FcGrp78基因在处理后24小时的上调表达；镉离子的处理导致FcGrp78基因处理后12小时的下调以及处理后24小时的上调表达变化。短期低氧胁迫则抑制对虾FcGrp78基因的转录表达。 本论文报道的中国明对虾FcHsp90基因 cDNA全长2552bp，编码726个氨基酸，具有保守的N端功能域、中间功能域和C端功能域，具有五个保守的Hsp90蛋白家族标签，序列上与其他物种Hsp90相似性高。Real-time RT-PCR结果显示FcHsp90基因在发育的卵巢中表达量较高，说明Hsp90可能参与了对虾卵母细胞成熟过程中的蛋白合成和卵黄蛋白原的分泌。WSSV感染引起中国明对虾肝胰脏的FcHsp90的转录表达明显上调，说明FcHsp90很可能与对虾的免疫相关。热休克处理诱导FcHsp90基因转录表达的迅速上调。铜离子处理也可诱导FcHsp90基因转录的上调表达，而镉离子处理首先引起FcHsp90基因的下调表达，24小时后开始上调。低氧胁迫也会抑制FcHsp90基因在对虾体内的转录表达。 诱导型FcHsp70基因cDNA全长2511bp，编码629个氨基酸，具有三个保守的Hsp70蛋白家族标签和C末端EEVD序列。与其他物种的Hsp70蛋白具有高度的相似性。FcHsp70基因转录表达对于热休克处理和铜离子的处理非常敏感：热休克处理2小时后FcHsp70基因的转录水平是对照组的80倍；铜离子处理12小时FcHsp70基因转录表达达到对照组的15倍。而镉离子处理后没有诱导FcHsp70显著的上调表达。 以上研究结果为阐明对虾对环境胁迫应答的机制奠定了重要基础，并可为抗逆对虾的培育提供依据。

桑沟湾贝藻养殖区附着生物生态效应研究

附着生物又称污损生物，是附生在海洋设施和生物体表面的动物、植物和微生物等生物的总称（Azis et al., 2001）。附生在养殖器材和生物体表面的数量巨大的附着生物，对贝类养殖和海湾生态系统内的物质和营养盐循环等多个方面产生影响。本研究以北方重要的养殖海湾----桑沟湾为研究对象，对贝藻养殖区附着生物的群落演替及其生态效应进行了研究。主要研究结果如下： ① 2007年5月至2008年5月，采用挂网的方法对桑沟湾栉孔扇贝和海带混养区的附着生物的季节变化进行了研究。结果显示挂网上的附着生物具有显著的季节变化特征，网片上的附着生物湿重与水温的变化相一致，生物量为3~1210 g•m-2。2月份附着生物的生物量最低，8月份最高。2007年9月至11月，对栉孔扇贝养殖笼上和贝壳上的附着生物种类和数量进行了研究。结果显示9月份养殖笼上附着生物的湿重约为1.94 kg，10月份降至0.99 kg，11月份又稍有增加，为1.03 kg。扇贝壳上的附着生物变化趋势与养殖笼上的相同，9~11月份壳上附着生物的数量约0.49~2.09 g。扇贝养殖笼上可鉴定的大型附着生物约23种，包括藻类、海鞘类、苔藓虫类、环节动物、腔肠动物、软体动物、甲壳动物和海绵动物等。玻璃海鞘、柄海鞘、紫贻贝和苔藓虫等是附着生物群落中的优势种。 ② 通过在栉孔扇贝和虾夷扇贝上壳上添加不同重量的“模拟附着生物”（速凝水泥）的方法，研究了贝壳上附着生物的重量对这两种扇贝生长和存活的影响。结果显示水泥重量是上壳重0.5-3倍的各组实验组扇贝的生长和存活与对照组（未添加水泥的扇贝）之间没有显著差异。说明贝壳上附着生物重量为上壳的3倍重时，也不会显著影响扇贝生长存活。9-11月份贝壳上的自然附着生物的重量约为1.47-2.09 g，为上壳重的28.16 (±38.6)%—31.29 ± (31.63)%。因此，贝壳上附着的生物重量不太可能对扇贝的生长存活造成显著的负面影响。 ③ 在桑沟湾现场测定了玻璃海鞘和柄海鞘的生物沉积速率。9月份（水温约24℃）玻璃海鞘和柄海鞘的生物沉积速率分别为32.14和90.06 mg•ind-1•d-1或（858.99 和467.76 mg•gdw-1•d-1），据此计算，养殖笼上的两种海鞘的生物沉积速率约为84.29 mg•m-2•d-1。海区的自然沉积速率为41.49 mg•m-2•d-1；玻璃海鞘和柄海鞘沉积物中有机质含量分别为14.34%和13.77%，对照组海区自然的有机质含量为14.36%；以上三者有机碳的含量分别为24.72%，23.74%和24.76%；氮的含量分别为0.27%和0.25%，自然沉积物中的氮含量为0.30%。9月份扇贝养殖笼上附着的海鞘将产生2588.16吨的沉积物，即向底部沉积363.77吨的有机物、6.99吨的氮和1.79吨的磷。 ④ 通过测定扇贝养殖笼上优势种附着生物--玻璃海鞘、柄海鞘和贻贝的摄食、呼吸和排泄，研究了这些优势种类对贝类养殖和海湾环境的影响。9月份（水温约24.5℃）玻璃海鞘和柄海鞘对颗粒有机物（POM）的摄食率分别为14.30 和17.01 mg• h-1•ind-1。根据实验结果计算这两种海鞘摄取的颗粒有机物相当于312个扇贝的摄取量，大于笼内养殖的扇贝的摄取量；玻璃海鞘和柄海鞘的耗氧率分别约为0.32和0.18 mg•h-1•ind-1，养殖笼上的这两种海鞘消耗的溶解氧约等于75个扇贝消耗的溶解氧。栉孔扇贝、玻璃海鞘、柄海鞘和贻贝的排氨率分别为33.66 ±11.34，117.90±23.46，35.91±6.22，28.08±3.41 ug NH4-N•gdw-1•h-1。以此估算，9月份玻璃海鞘、柄海鞘和贻贝每天排泄的氨氮约为654.08 kg，相当于16467吨栉孔扇贝（鲜重）排泄的氨氮。海鞘和贻贝排泄的氨氮可提供浮游植物等所需的2.75%的氮，可以提供1204吨海带的生长所需的氮。 ⑤ 一个养殖笼内的栉孔扇贝和全部附着生物（Scallop Culture Unit, SCU）在夏季（6-9月）对颗粒有机物的摄食速率约为43.13-98.94 mg/h，平均74.05 mg/h，期间桑沟湾养殖的栉孔扇贝及附着生物摄取的POM约为1279.58吨；同期，SCU对氨氮和磷（PO4-P）的排泄速率分别为125.59-1432.23 μmol•h-1和76.2-252.89μmol•h-1，期间桑沟湾养殖扇贝及附着生物排泄的氮磷分别为211.09 吨和83.79 吨。一串牡蛎及吊绳和牡蛎壳上的附着生物（Oyster Culture Unit, OCU），夏季摄食率为5-41.43μmol•h-1，耗氧率为16.54-41.76μmol•h-1，对氨氮和磷（PO4-P）的排泄速率分别为35.56-489.34μmol•h-1 和9.92-16.68μmol•h-1。以此估算，夏季OCU可摄取POM535.68吨，消耗溶解氧955.58吨，排泄氮磷分别为62.37 吨和15.50 吨。

扇贝丝氨酸蛋白酶抑制剂基因CfKZSPI及Aikunitz的克隆与重组表达

扇贝养殖是我国重要的海水养殖产业，然而自1997 年以来，养殖扇贝陆续爆发的大规模死亡，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。丝氨酸蛋白酶抑制因子及丝氨酸蛋白酶在无脊椎动物的免疫应答中起着核心作用，它们的协同作用直接导致外界病源入侵的信号转导和级联放大，并进一步激活一系列防御体系，如黑化反应、血液凝结和抗菌肽的合成等。因此，克隆扇贝参与免疫防御的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因并对其功能进行研究，将有助于进一步研究扇贝的免疫防御机制，丰富和发展无脊椎动物免疫学的内容。 运用大规模EST技术和RACE技术从栉孔扇贝中克隆出一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，定名为CfKZSPI。该基因cDNA序列全长1788bp，其中5' 非编码区（Untranslated Region, UTR）为97 bp，3' UTR161 bp，有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A 尾巴，开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）含有1530 bp，编码509 个氨基酸残基。对其推测氨基酸序列进行分析，发现其中包括22个氨基酸残基组成的信号肽序列和12个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR（quantitative real time PCR）对鳗弧菌浸泡刺激后栉孔扇贝血淋巴中CfKZSPI 的 mRNA表达量进行了检测，发现其mRNA 的表达量在鳗弧菌刺激后3h明显上升，达到空白组的43.6倍；然后在6h时有所下降，为空白组的15.0倍；随着菌刺激时间的增长，CfKZSPI基因的 mRNA 表达量急剧增加，在刺激后8h，12h，24h分别达到空白组的174.1，207.8，675.4倍。统计分析发现3h（P=0.019<0.05）和12h（P=0.020<0.05）时，CfKZSPI基因mRNA表达量与空白组差异均显著。为了研究栉孔扇贝CfKZSPI的蛋白活性，将其第十二个结构域克隆到pET-32a（+）载体中，转化大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）表达菌株，获得可溶性表达的蛋白rCfKZSPI-12，对其进行抑制蛋白酶活性的分析，发现其对胰蛋白酶有很强的抑制活性，而对凝血酶没有抑制活性。当rCfKZSPI-12与胰蛋白酶分子比率为1：1时，约90%的蛋白酶活性被抑制。运用狄更斯作图法研究rCfKZSPI-12对胰蛋白酶的抑制能力，结果发现其对胰蛋白酶的抑制常数为173 nmol L-1。 采用同样方法从海湾扇贝cDNA文库中克隆出一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因，定名为Aikunitz。该基因全长632 bp，其中5' UTR 为105 bp，3' UTR 为 245 bp，有一个典型的多聚腺苷酸信号序列（AATAAA）和一个ploy A 尾巴，ORF 含有282 bp，编码93 个氨基酸残基。推测的氨基酸序列N末端有一个20个氨基酸残基组成的信号肽序列，成熟蛋白包括一个Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂结构域。采用QRT-PCR对鳗弧菌和藤黄微球菌感染后海湾扇贝血淋巴中Aikunitz 的mRNA的表达量进行了检测，结果发现其在鳗弧菌刺激后3h到9h持续上升，9h时表达量为PBS对照组的4.49倍（P=0.008<0.05），然后开始下降，在72h时表达量为对照组的0.24倍（P=0.021<0.05）；而在藤黄微球菌刺激后3h到12h其表达量上升，其中6h时为空白组的5.95倍（P=0.0004<0.01）；12h以后迅速下降，其中24h的表达量为对照组的0.38倍（P=0.028<0.05）。将Aikunitz基因编码的成熟蛋白按照重组CfKZSPI-12的方法进行重组表达，并对重组蛋白进行抑制蛋白酶和抑菌活性分析。结果发现其对胰蛋白酶和弹性蛋白酶两种丝氨酸蛋白酶都没有抑制作用。抑菌实验同样发现，重组Aikunitz 对供试的革兰氏阳性菌藤黄微球菌和革兰氏阴性菌鳗弧菌和大肠杆菌都不显示明显抑菌活性。

滤食性贝类对浅海养殖系统生源要素动态的影响

在浅海养殖系统中，生源要素的形态和动态对滤食性贝类生长有着重要影响，与此同时，滤食性贝类对系统中的生源要素的动态也具有重要作用，国外学者对此研究的比较多，但在我国研究甚少。在本论文中利用室内模拟实验和海上调查的方法，研究滤食性贝类的生物过滤、生物沉积及排泄作用对浅海养殖系统中生源要素动态的影响。室内模拟实验部分：1998年4月至6月间，在烟台利用室内规格相同的水池，建立了栉孔贝扇（Chlamys farreri）不同养殖密度单养、栉孔扇贝和海带（Laminaria japonica）混养、栉孔扇贝和海带、刺参（Apostichopus japonicus）多元化养殖等三种养殖模式，九个养殖系统和一个对照系统，实验中各池的温度、光照、盐度和换水量基本一致，定期测定实验池中颗粒有机碳（POC）、颗粒氮（PN）和水体及沉积物中营养盐的含量。实验结果表明：1 栉孔扇贝大量滤食水体中的颗粒物质，导致水体中颗粒物质浓度的降低，水体中POC和PN的现存量与栉孔扇贝的放养密度负相关，水体中颗粒物的缺乏会限制栉孔扇贝的生长，当POC、PN的现存量分别降低到0.09mg/L、0.015mg/L时，就会限制栉孔扇贝的生长。2 栉孔扇贝排泄代谢产物增加了水体中无机营养盐的浓度，栉孔扇贝排泄的氮以NH_4~+-N为主，占三氮的93.5%；海带可为栉孔扇贝生长提供一部分饵料。3 实验期间硅浓度低于或近于2umol/L，限制了硅藻的生长，实验后期水体中氮盐浓度降低，氮磷比小于10，可能限制了浮游植物的生长，减少了栉孔扇贝的饵料生物，从而抑制了栉孔扇贝的生长。4 在栉孔扇贝单养和贝藻参混养系列中，沉积物中有机物、有机碳、有机氮、有机磷及总磷的含量随栉孔扇贝放养密度的增大而减少。5 在贝藻混养系列中的栉孔扇贝生长好于单养系列，在贝藻参混养系列中的海带生长速度快于贝藻混养系列；单养和贝藻参混养模式中栉栉孔扇贝的日产量均以放养密度中等的（20个/m~2）养殖系统较高。海上调查部分：于1997年冬季、1998年春季和夏季，在烟台四十里湾海区进行了三次野外调查，分别在养殖海区和非养殖海区取得沉积物柱状样，测定沉积物中有机质和间隙水中无机营养盐的含量。实验结果表明：6 养殖区沉积物中有机质的含量大于非养殖区，平均高约22%。7 养殖海区沉积物间隙水中营养盐的浓度大于非养殖海区，其中养殖区NH_4~+-N、PO_4~(3-)-P 的浓度分别高于非养殖区50%和200%-400%，NO_3~--N, NO_2~--N 的浓度差别不明显；沉积物间隙水中营养盐浓度冬季较小，而春夏季浓度较高；氮盐以NH_4~+-N 为主，占90%以上。8 养殖海区沉积物－海水界面间营养盐扩散通量大于非养殖海区，烟台四十里湾沉积物－海水界面间NH_4~+-N, PO_4~(3-)-P, NO_3~--N, NO_2~--N 冬、春、夏三季平均扩散通分别为249.99 umol/m~2/d、3.78 umol/m~2/d、5.24 umol/m~2/d、0.83mol/m~2/d。

Screening of surfactants for harmful algal blooms mitigation

Screening experiments were conducted in order to find promising synthetic surfactants for harmful algal blooms (HABs) mitigation. The chemically synthesized surfactant cocamidopropyl betaine (CAPB) showed characteristics of relatively high inhibition efficiency, high biodegradability and low cost. The motility inhibition ratios of 10 mg/L CAPB on Cochlodinium polykrikoides and Alexandrium tamarense were about 60% after 5 min. The biodegradation test indicated that the half-life of CAPB in seawater was shorter than one day and 90% was biodegraded after five days under the initial concentration of 100 mg/L at 25degreesC. Further cell lysis experiments revealed the selective lysis effect of CAPB on different HAB organisms. More than 90% of C. polykrikoides lysed at the concentration of 10 mg/L CAPB after 24 h and at 15 mg/L CAPB after 4 h, whereas the lysis effect of CAPB on A. tamarense was slight, no more than 10% after 2 h interaction with 50 mg/L CAPB. This research provided preliminary data for CAPB as a candidate in harmful algal blooms mitigation and pointed out unresolved problems for its practical application in the meantime. (C) 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Feeding activities of zooplankton in the Bohai Sea

The Bohai Sea was the site of the Chinese national GLOBEC programme. During the June 1997 cruises of R/V Science No.1, observations and experiments on zooplankton feeding were conducted. At five 48 h time-series stations the following observations and measurements on zooplankton were carried out: (1) diurnal vertical migration, by collecting samples at different layers every 3 h with a closing net; (2) diurnal feeding rhythms, by gut pigment analysis; and (3) ingestion rate, by both gut pigment analysis and the dilution method. A classification by body size was used to deal with the diversity of species and developmental stages of zooplankton assemblages. Samples were separated into three size groups: small (200-500 mu m), medium (500-1000 mu m) and large (> 1000 mu m). The results showed that the copepods (Calanus sinicus, Paracalanus parvus, Acartia bifilosa and Centropages mcmurrichi) performed clear diurnal vertical migrations. However, their behaviour was different at different stations. The variation in gut pigment content over the 24 h cycle showed strong diurnal feeding rhythms, particularly for the large size group. Gut pigment contents reached their daily maximum during the time from dusk to midnight (18:00-24:00). The peak value was about 10 times the minimum observed in the daytime. The in situ daily grazing rate, based on gut pigment contents and evacuation experiments, was 4.00-12.65 ng chla ind(-1) day(-1) for the small size group, 5.99-66.58 ng chla ind(-1) day(-1) for the medium size group and 31.31-237.13 ng chla ind(-1) day(-1) for the large size group. The copepods consumed only a small part (2.90-13.52%) of the phytoplankton biomass hut about 77% of the daily production. The grazing mortality rate of phytoplankton by microzooplankton (<200 mu m) measured by the dilution method ranged from 0.43 to 0.69 day(-1) The calculated daily consumption of phytoplankton biomass was 35-50%, and 85-319% of the potential production.

A comparison of future increased CO2 and temperature effects on sympatric Heterosigma akashiwo and Prorocentrum minimum

Very little is known about how global anthropogenic changes will affect major harmful algal bloom groups. Shifts in the growth and physiology of HAB species like the raphidophyte Heterosigma akashiwo and the dinoflagellate Prorocentrum minimum due to rising CO2 and temperature could alter their relative abundance and environmental impacts in estuaries where both form blooms, such as the Delaware Inland Bays (DIB). We grew semi-continuous cultures of sympatric DIB isolates of these two species under four conditions: (1) 20 degrees C and 375 ppm CO2 (ambient control), (2)20 degrees C and 750 ppm CO2 (high CO2),(3) 24 degrees C and 375 ppm CO2 (high temperature), and (4) 24 degrees C and 750 ppm CO2 (combined). Elevated CO2 alone or in concert with temperature stimulated Heterosigma growth, but had no significant effect on Prorocentrum growth. P-Bmax (the maximum biomass-normalized light-saturated carbon fixation rate) in Heterosigma was increased only by simultaneous CO2 and temperature increases, whereas P-Bmax in Prorocentrum responded significantly to CO2 enrichment, with or without increased temperature. CO2 and temperature affected photosynthetic parameters alpha, Phi(max), E-k, and Delta F/F'(m) in both species. Increased temperature decreased and increased the Chl a content of Heterosigma and M Prorocentrum, respectively. CO2 availability and temperature had pronounced effects on cellular quotas of C and N in Heterosigma, but not in Prorocentrum. Ratios of C:P and N:P increased with elevated carbon dioxide in Heterosigma but not in Prorocentrum. These changes in cellular nutrient quotas and ratios imply that Heterosigma could be more vulnerable to N limitation but less vulnerable to P-limitation than Prorocentrum under future environmental conditions. In general, Heterosigma growth and physiology showed a much greater positive response to elevated CO2 and temperature compared to Prorocentrum, consistent with what is known about their respective carbon acquisition mechanisms. Hence, rising temperature and CO2 either alone or in combination with other limiting factors could significantly alter the relative dominance of these two co-existing HAB species over the next century. (c) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

高效液相色谱-质谱分离鉴定荧光试剂标记的脂肪酸

以2-(2-(10-蒽基)-萘[2,3-d]咪唑)-乙基-对甲苯磺酸酯(ANITS)作为柱前衍生化试剂,在Eclipse XDB-C8色谱柱上,梯度洗脱实现了20种游离脂肪酸(FFA)衍生物的完全基线分离.90℃下在DMF溶剂中以K2CO3作催化剂,选取衍生试剂摩尔数为脂肪酸的7倍,衍生反应40 min可获得稳定的荧光产物.激发和发射波长分别为250 nm和512 nm.采用大气压化学电离源(APCI)正离子模式,实现了油菜蜂花粉中游离脂肪酸的质谱鉴定.所有脂肪酸的线性相关系数均大于0.9999, 检出限为24.76～98.79 fmol.

牦牛放牧率和放牧季节对小嵩草高寒草甸土壤养分的影响

经过两年牦牛放牧试验表明,夏季草场不同土壤层有机质、有机碳、全磷、全氮和速效磷的含量及0～20cm土壤层营养因子的平均含量与放牧率呈线性回归关系,速效氮含量与放牧率呈二次回归关系;冬季草场不同土壤层有机质、有机碳和全氮与放牧率呈线性回归关系,全磷、速效磷和速效氮的含量及0～20cm土壤层营养因子的平均含量与放牧率呈二次回归关系。随着放牧率的逐渐增加,夏季草场不同土壤深度速效氮含量也逐渐减小,当放牧率达到1.07、1.08和1.22头·hm-2时,0～5、5～10、10～20cm土壤速效氮含量依此达到最小;冬季草场不同土壤层全磷、速效磷和速效氮含量逐渐增加,当放牧率达到0.81、0.78和1.00头·hm-2,1.03、1.09和1.03头·hm-2,1.36、1.35和1.30头·hm-2时,0～5、5～10、10～20cm土壤层全磷、速效磷和速效氮含量分别依此达到最大。在夏季草场,0～20cm土壤层速效氮平均含量达到最小放牧率是1.07头·hm-2;冬季草场0～20cm土壤层全磷、速效磷和速效氮含量达到最大放牧率分别是0.90、0.83和1.21头·hm-2。

稳定性同位素技术在生态学上的应用

稳定性同位素技术早在20世纪70年代末期就被引入到生态学领域.最初是利用植物稳定性碳同位素的差异,开展了许多有关营养流动方面的研究;到90年代,稳定性碳和氮同位素被用来分析动物的食性、营养级位置关系以及食物链结构;本世纪初,由于技术的进步,稳定性同位素(特别是氢同位素)被用来开展动物迁徙习性方面的研究.到目前为止,国内有关这方面的研究还鲜有报道,而且对自然界存在的稳定性同位素的理解还存在一定偏差.本文主要介绍了稳定性同位素效应及其分馏原理、稳定性同位素在示踪动物食性信息、确定营养级位置关系、分析食物网结构以及研究动物迁徙生态学中的作用等方面的内容.

高寒矮嵩草草甸不同退化演替阶段植物地上部氮磷元素比较

本研究旨在比较高寒草甸草地不同退化演替阶段下植物地上部氮磷元素含量、吸收速率以及单位面积累计重量.结果表明:植物生长季内(5～9月),3个样地植物地上部N、P含量都是在生长初期最高,随植物生长季节的推移以及地上生物量的增加,其含量逐渐稀释直到生长季节结束,全氮含量范围为36.90～14.90 g/kg,全磷的含量范围是2.22～1.06 g/kg.不同退化演替阶段由于植物组成的不同,其N、P含量有明显的差异,P的含量中度退化样地最高(1.91%),重度退化样地最低(1.51%);N的含量则恰恰相反,重度退化样地最高(26.40%),中度退化样地最低(18.60%);原生植被样地介于两者之间,其生长季P的平均含量为1.63%,N的平均含量为20.80%.植物N、P的吸收速率和单位面积累计重量都是随退化程度的加剧而降低,即原生植被样地>中度退化样地>重度退化样地,并且植物营养元素吸收速率与地上生物量生长速率呈正相关关系.