水稻菠菜紫黄质脱环氧化酶基因的克隆遗传转化及其特性的研究

自发现叶黄素循环具有热耗散的作用后它被引起广泛的关注目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上在跨膜质子梯度pH形成后玉米黄质Z和环氧玉米黄质A能够从叶绿素中吸收过多的激发能并以热能的形式耗散到体外从而保护光合器官免受强光的破坏紫黄质脱环氧化酶VDE是叶黄素循环的关键酶在较低的pH条件下它能在数分钟内将紫黄质V转变为Z和A本论文从水稻和菠菜中克隆了编码VDE酶的基因并通过转基因植物进一步研究了叶黄素循环在热耗散方面的作用主要获得了以下结果 首次从两个水稻亚种籼稻和粳稻中克隆了Rvde基因分别命名为iRvde和jRvde的全长cDNA序列分别长1647bp和1887bp两者开放阅读框的同源性为98%与其它已知vde基因的同源性在60以上推导两者均编码446个氨基酸其中转运肽序列长98个氨基酸两者成熟蛋白的氨基酸序列完全相同与已知VDE成熟蛋白的同源性在75%以上其中与小麦的同源性最高达87.4 通过PCR扩增获得了Rvde基因的核基因组DNA序列在它们的编码区中含有4个内含子其长度在jRvde中分别为105bp327bp81bp和69bp而iRvde基因的第2个内含子长425bp与jRvde的第2个内含子差别较大内含子的AT含量为6063%其两端为典型的GT/AG结构 构建了Rvde基因的原核表达载体pET-Rvde在0.4mmol/L IPTG的诱导下该基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达SDS-PAGE和Western杂交表明表达蛋白的分子量约为 43 kDa随着IPTG诱导时间的延长蛋白量逐渐增加诱导4h后它占大肠杆菌总蛋白的25左右吸收光谱差值A502-540随反应的进行逐渐增大反应体系总色素的HPLC分析表明V逐渐降低而Z刚好相反说明表达的蛋白具有与活体VDE酶相同的功能能在体外将V转变为A和Z 从菠菜中克隆了Svde基因并构建了该基因的反义抑制植物表达载体pCB-antiSvde用根癌农杆菌介导法转化烟草获得了大量的转基因植株再生的愈伤组织经GUS染色后呈蓝色PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Svde基因结果显示在转基因植株T0和T1代中都分别扩增出1.0 kb和1.4 kb的目的片段而在未转化的对照植株中没有扩增转基因植株的T0代种子在潮霉素培养基上的萌发数与未萌发数的比值为3:1符合单基因的孟德尔分离规律从T1代转基因植株中筛选出抑制程度较强的一个株系A29Southern杂交结果表明外源Svde基因已整合到烟草的基因组中并且只有一个插入位点通过冻融法从该植株的类囊体中提取VDE酶其酶活性为3.2是对照植株的45.7表明VDE酶受到了抑制荧光动力学及HPLC测定结果显示强光处理后在转基因植株中Z和A的形成较少非光化学淬灭NPQ值较对照低Fv/Fm的下降较对照快表明转基因植株的热耗散能力下降进而说明叶黄素循环具有热耗散的功能 同时还建立了根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系并初步作了转化Svde基因的试验另外还建立了一种适合于筛选转基因植株的DNA微量提取法此方法操作快捷方便一个人在一天内能制备50多个样品100mg的植物鲜样平均可获得40µg的DNA提取的DNA可直接用于PCR反应酶切分析及Southern分析

硫代硫酸钠及葡萄糖对蓝细菌Synechocystis sP.PCC6803脂及光合器组成的影响

本文通过对蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加葡萄糖、Na2S203的BG-11培养基中的生长特性、脂类及脂肪酸组成、细胞低温荧光、色素组成进行分析测定，总结出如下规律： 当蓝细菌Synechocystis sp. PCC 6803在添加有葡萄糖的BG-11培养基中培养时细胞出现了一种新的糖脂（记为糖脂-x），在添加果糖、麦芽糖、乳糖等其它碳源的培养基中生长的细胞中也检测到糖脂-x糖脂-x的出现经推测是与活性氧相作用的产物，当在含糖的培养基中加入活性氧猝灭剂Na2S203时能有效地抑制糖脂-x的出现。糖脂一x的出现伴随着其它脂、尤其是双半乳糖甘油二酯(DGDG)的含量下降，这可能与细胞营养代谢类型的转变相适应。糖脂-x的出现使细胞适应异养生长条件，这时藻胆体(PBS)，光系统II(PSII)，光系统I(PSD降解，叶绿素消失。 糖脂-x经1H-NMR波谱术检测证实为甘油糖脂，经气质联谱分析其脂肪酸组成中含大量的枝链脂肪酸，12-甲基十四碳酸、12-甲基十五碳酸、12-甲基十六碳酸以及两种稀有的含氮脂肪酸。这些脂肪酸在添加高浓度葡萄糖的培养基中生长的．Synechocystis sp. PCC 6803中的单半乳糖甘油二酯(MGDG)也能检测到。ESI-MS以及P-SI-MS测定结果表明糖脂．x含一分子的脂酰基侧链以及两分子的己糖，半乳糖与葡萄糖。 对．Synechocystis sp. PCC 6803生长在不同浓度的葡萄糖与Na2S203培养基中脂类组成与脂肪酸组成进行比较，发现Na2S203能有效地增加膜脂中硫代异鼠李糖二酰基甘油(SQDG)和磷脂酰甘油(PG)的百分含量，培养基中同时添加葡萄糖时能抵消Na2S203的这一效应。此外，Na2S203能显著增加单半乳糖甘油二酯(MGDG)、双半乳糖甘油二酯(DGDG)中十六碳酸(C16:0)的百分含量，这一效应也能为葡萄糖恢复。Na2S203不能显著地改变SQDG中C16:0的百分含量，加入葡萄糖时能降低C16:0的百分含量。这些结果说明Na2S203可能充当一种还原剂使膜脂处于一种低的不饱和状态，同时加入葡萄糖时能降低Na2S203的还原力。此外，Na2S203还可作为SQDG合成中的硫供体。 用HPLC测定．Synechocystis sp. PCC 6803在添加不同浓度的Na2S203，葡萄糖的BG-11培养基中生长时的叶绿素与类胡萝卜素浓度，结果表明葡萄糖表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的抑制效应，Na2S203在低浓度时表现出对叶绿素与类胡萝卜素水平的促进效应，但在高浓度时表现出抑制效应。因此适当浓度的Na2S203的加入有利于维持蓝细菌在培养基中添加葡萄糖的生长条件下的低水平自由基，能使葡萄糖表现出促进细胞生长的特性。 通过测定Synechocystis sp. PCC 6803生长曲线中葡萄糖、Na2S203的浓度效应，结果表明葡萄糖在低浓度（例如5 mmoI.L-l）时表现出促进细胞的生长，在相对高的浓度表现出抑制细胞生长的效应。在培养基中同时加入Na2S203时可恢复葡萄糖对细胞的生长的促进效应。单独加入Na2S203表现出对细胞生长的抑制效应。这说明葡萄糖、Na2S203对细胞的生长存在着正的协同效应。

理化因子对PSII内周天线CP43和CP47色素蛋白复合体结构与功能的影响

从菠菜叶绿体中分离纯化出PSII内周天线CP43及CP47色素蛋白复合物。通过利用光谱学手段 (吸收光谱、荧光光谱、CD光谱等)及生化技术(HPLC和电泳等)，研究了酸、碱、强光及高温等理化因子对其结构和功能的影响。结果如下： 1：酸和碱处理对CP43和CP47结构和功能的影响 1），酸、碱处理均使CP43和CP47红区主峰吸收降低，蓝区Soret带吸收降低，Soret带的附属带吸收增加，红区及蓝区吸收主峰均蓝移。酸处理时在542 nm及510 nm附近出现Pheo a的吸收峰，碱性处理时出现642 nm的吸收峰。酸、碱处理后CP43及CP47中绝大部分色素仍然结合在脱辅基蛋白上, 吸收光谱的变化源于结合态的色素而非游离色素。酸性条件下Chl a受到破坏变为Pheo a 使CP43及CP47失绿, 但Pheo a仍牢固地结合在脱辅基蛋白上，使CP43及CP47出现Pheo a的吸收峰。碱性条件下虽然绝大部分色素也结合在脱辅基蛋白上，但色素与蛋白之间的亲和力减弱，使其在进行PAGE电泳时从蛋白质上脱落。碱性条件下642 nm吸收峰的出现是OH- 与Chl a之间相互作用的结果，它需要蛋白质次级结构的变化，当蛋白质次级结构保持完整时或Chl a 分子被尿素分子包围时这种作用受到抑制。碱性条件下CP43及CP47中642 nm吸收峰的出现取决于Chl a与OH- 的相对量，同样在进行PAGE电泳时CP43中Chl a与脱辅基蛋白的分离也取决于Chl a与OH- 的相对量。 2），CP43中β-Car与Chl a之间的能量传递易于受碱的干扰，而在CP47中易于受酸的干扰。酸对CP43和CP47蛋白质次级结构的影响远小于碱的影响。酸和碱都显著地影响了Chl a分子所处的微环境并干扰了Chl a分子之间的激子相互作用。 3), 酸和碱以不同的方式影响CP43和CP47的光吸收、能量传递及蛋白质的次级结构。H+ 可以在不破坏蛋白质次级结构的情况下渗透到色素蛋白内部与Chl a反应而产生Pheo a，同时使β-Car和Chl a (或Pheo a) 之间的相对位置发生变化, 它们之间的能量传递受到干扰。OH- 首先破坏CP43和CP47中的氢键, 引起蛋白质解折叠, 使屏蔽在蛋白质内部的Chl a 暴露，进而与暴露的Chl a作用而将其皂化为叶绿素酸酯。随着蛋白质的去折叠, 其远紫外CD活性丧失, 色素所处的微环境受到干扰, β-Car和Chl a (或Chl a酸酯) 之间的相对位置发生改变, 因此β-Car和Chl a ( 或Chl a酸酯) 之间的能量传递也受到干扰。 4),酸或碱处理使CP43和CP47中Chl a 在进行HPLC时洗脱时间和洗脱峰面积发生改变, 但β-Car洗脱时间和洗脱峰的面积相对稳定。意味着酸碱处理并不破坏CP43及CP47中的β-Car。 2.强光照射对CP43结构和功能的影响 强光(1000 μmol E./m2.s)可以引起CP43中Chl a的漂白及蛋白质的降解，这种作用明显地被连二亚硫酸钠抑制。同样条件下,β-Car 的光吸收几乎不受光破坏的影响。 3.高温处理对CP43、CP47及其它PSII亚基降解的影响 用从菠菜叶片中分离出的PSII、OECC(放氧核心复合体)、去除33 kDa的OECC、RC-CP47(结合有CP47的反应中心复合体)、RC(反应中心复合体)、CP43及CP47等多亚基或单亚基色素蛋白复合体，研究这些复合体中各蛋白亚基在高温时的降解情况。结果发现PSII各蛋白亚基降解对温度的敏感性显著不同： CP43、D2、CP29、LHCII >D1、CP47 >> PsbO、PsbP、PsbQ及Cytb559 (α亚基)。

假根羽藻细胞色素b6f蛋白复合体中α-胡萝卜素的结构与功能

细胞色素b6f蛋白复合体（Cyt b6f）是光合链中连接两个光系统（PSII 和PSI）的中间电子载体蛋白复合物，其主要的生理功能是催化电子传递和质子跨膜转移，形成跨膜质子电化学梯度，为ATP的合成提供能量，在光合作用光能转化过程中占有很重要的地位。细菌和莱茵衣藻Cyt b6f的晶体结构已于2003年底获得了近原子水平的解析，但有关该复合物中两种色素（Chl a和β-Car）的生理功能及其机理尚无明确的解释。预计它们将成为今后几年的研究热点,因为揭示Cyt b6f蛋白复合体中Chl a和β-Car分子的生理功能对于进一步阐明光合作用高效转能及其调控的分子机理具十分重要的意义。鉴于目前尚未见到海洋绿藻Cyt b6f的报道，本文以海洋绿藻—假根羽藻（Bryopsis corticulans）类囊体膜上的Cyt b6f蛋白复合体为对象，对其中的类胡萝卜素的分子结构与生理功能进行了比较系统地研究。 首先，我们改进了原用于菠菜类囊体膜Cyt b6f的分离、纯化流程，在原流程的基础上增加了一次2 mol/L NaBr洗膜，彻底地去除了膜表面的杂蛋白;还调整了第二次硫酸铵分级沉淀时的饱和度，并将38-45%饱和度下的沉淀物确定为需要收集的Cyt b6f制剂。采用此改进的流程，我们首次从假根羽藻类囊体膜中分离纯化了高活性、高纯度的Cyt b6f制剂。SDS-PAGE分析的结果显示该制剂的4个多肽亚基 （Cytf 、Cyt b6 、Rieske[Fe-s]及亚基IV）的表观分子量分别为34.8、24.0、18.7和16.7 kD;Cyt b6 / f 比值接近2.0， 其纯度值为9.9 nmol cyt f/mg;其催化电子传递的活性 （C10-PQH2→PC）为73 e/s。HPLC 和共振拉曼光谱分析表明，假根羽藻Cyt b6f中的类胡萝卜素为α-胡萝卜素分子，它是一种在Cyt b6f中尚未报道过的类胡萝卜素。定量分析表明，每个假根羽藻Cyt b6f单体中全反式(all-trans)和9顺式（9-cis）α-胡萝卜素的含量分别为0.2和0.7个分子，另外还含有1.2分子的Chl a。CD光谱分析表明该9-cis-α-胡萝卜素处在一个不对称的蛋白环境中。TLC分析表明该制剂是一种缺脂的Cyt b6f蛋白复合体。 采用稳态荧光激发光谱，时间分辨吸收光谱及Chl a的光破坏实验对假根羽藻Cyt b6f中α-胡萝卜素的功能进行了研究。结果表明，Cyt b6f中α-胡萝卜素可以将它吸收的光能传递给Chl a，其能量传递效率为62.4%，提出α-胡萝卜素分子与Chl a分子之间的单线态能量传递是遵从Föster 机制进行的;α-胡萝卜素分子对Chl a分子有一定的光保护作用，这种保护作用是通过清除单线态氧来实现的。另外还发现Cyt b6f中的Chl a分子可能与其周围的氨基酸残基存在相互作用，认为这是其进行自我光保护的一种方式。 此外，还采用HPLC研究了光和暗交替对假根羽藻Cyt b6f中α-胡萝卜素构型的影响，并对假根羽藻Cyt b6f选择结合α-胡萝卜素的原因进行了初步的分析。

光系统I及其亚组分的分离纯化与光破坏特性的研究

光系统I（photosystem I，PSI）是光合膜上参与光合作用原初反应过程的主要膜蛋白超分子复合体之一。高等植物的PSI是由核心复合体（14个亚基）和捕光色素蛋白复合体I（light-harvesting complex I, LHCI，含4个Lhca蛋白）组成的超分子复合体，它的主要功能是调节光诱导的从囊腔侧的质体兰素（plastocyanin，PC）向基质侧的铁氧还蛋白（ferredoxin，Fd）的电子传递。研究PSI的结构与功能对于揭示植物光合作用高效吸能、传能的分子机理具有重要意义。在本文中，我们首先建立了分离制备PSI及其亚组分的方法（Qin et al., 2007），并在此基础上对PSI在强光破坏的过程中结构与功能的变化进行了比较深入的研究。本论文的主要研究结果如下： 1．快速、高效分离纯化PSI及其亚组分方法的建立。 国际上传统的PSI分离方法（Bassi and Simpson, 1987; Croce et al., 1998; Påsllon et al.1995; Schmid et al. 2002），耗时长较长（分离PSI颗粒一般需要多于20h的蔗糖超速离心过程，而分离PSI的亚组分则需要25-60h的蔗糖超速离心过程）、得率较低，这不便于PSI方面的研究，为此我们首先改进了传统的分离纯化方法。新方法以高等植物菠菜叶片作为原材料，使用Triton X-100作为增溶剂，通过差速离心技术获得的粗制品，然后使用十二烷基麦芽糖苷(n-Dodecyl β-D-maltoside, DDM)增溶PSI粗制品，之后采用100,000×g，垂直转头（Beckman VTi 50）0.1-1 mol/L蔗糖梯度离心3h获得纯度较高的PSI颗粒。然后使用DDM和3-(N, N-Dimethylpalmitylammonio) propanesulfonate （zw 3-16）两种增溶剂处理PSI，后经100,000×g，垂直转头（Beckman VTi 50）蔗糖梯度离心4h获得纯度较高的PSI core、LHCI-680、LHCI-730复合体。采用吸收光谱、荧光光谱技术研究了各样品的基本光谱学特性，采用HPLC分析了各样品的色素组成，结果显示平均每个Lhca蛋白结合1.5-1.6黄体素，1.0紫黄质, 0.8-1.1 β-胡萝卜素，该方法制备的LHCI比传统方法制备的LHCI减少了类胡萝卜素的丢失。这一工作为以后结构与功能的研究工作奠定了良好的基础。 2．PSI复合体及其亚组分的特性研究。 PSI颗粒具有一定的适应环境酸碱变化的能力，在我们的试验条件下PSI颗粒在pH 5-10相对稳定。PSI、LHCI很难通过加入Mg2+、Ca2+、Na+阳离子聚集沉淀。经绿胶鉴定我们制备的LHCI-680、LHCI-730是二聚体形式;而把PSI绿胶后再进行第二向十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳，结果发现在稍强烈的绿胶增溶条件下，LHCI-730是以二聚体的形式存在，但是LHCI-680却是以单体的形式出现。这说明LHCI形成的二聚体，尤其是LHCI-680，较容易受到增溶处理而分离成单体形式，解释了以生化分离手段得到的LHCI-680的聚集形式是单体还是二聚体这个目前国际上还有有争议的问题。 3．PSI、LHCI光破坏的基本特点。 采用白光（2500 μmol•m-2•s-1）照射PSI颗粒，通过SDS-PAGE及室温吸收光谱检测光照过程中PSI复合体的变化，结果表明：去氧处理能够大大延缓PSI的光破坏，而PSI脱辅基蛋白不会发生光破坏，这说明PSI发生的光破坏可能与Chl与O2的相互作用有关。采用白光（1000 μmol•m-2•s-1、300 μmol•m-2•s-1）处理LHCI-680、LHCI-730，发现LHCI-680被破坏的速度明显快于LHCI-730被破坏的速度，这是首次在体外分离的水平上揭示了不同LHCI光破坏方面的差异。LHCI-680与LHCI-730在光破坏方面的差异可能与两种天线蛋白结合的类胡萝卜素的种类和数量不同有关，还可能与二者结合的长波长Chl的情况有关，但是具体的原因还有待于进一步的研究。 4．结合不同的捕光色素蛋白复合体（light-harvesting complex，LHC）对PSI光破坏的影响。 为了研究结合不同的捕光天线对PSI光破坏的影响，我们制备了PSI-LHCII、PSI、PSI core三种复合体。使用白光（2500 μmol•m-2•s-1）照射这三种复合体，并通过测定各复合体在光破坏过程中蛋白亚基、吸收光谱、PSI活性及P700含量的变化，对比三者光破坏的速度，结果发现PSI-LHCII在这三种复合体中光破坏速度最快，而PSI和PSI core两种复合体光破坏速度基本一致。我们推测在光照过程中部分光系统II捕光Chl a/b蛋白复合体II（light-harvesting complex II，LHCII）能够向PSI core传递能量，另外PSI-LHCII绿胶分析的结果表明发生了LHCII三聚体向单体的转变，这种强光下发生的LHCII聚合形式的转化可能是高光强下调节光能捕获的一种机制，由于植物体内具有较完整的保护系统，体内PSI-LHCII的光破坏可能与体外情况不同;另外LHCI与PSI core的解离可能发生在强光照射的早期，具有保护PSI core减少光破坏的积极作用。该部分的研究首次观察了结合不同的捕光天线对PSI光破坏的影响。

芍药花色形成的化学机制及其化学分类研究

本文以9 个芍药野生种（15 份种质）、104 个品种及2 个牡丹芍药组间杂种的花瓣为材料，利用液质联用技术鉴定了花瓣中的色素成分并探讨了芍药花色形成的化学机制和化学分类法。 结果表明，芍药花中主要含有5 种花青素，即芍药花素-3，5-二葡糖苷（ peonidin-3,5-di-O-glucoside ， Pn3G5G ）; 矢车菊素-3 ， 5- 二葡糖苷（ cyanidin-3,5-di-O-glucoside ， Cy3G5G ）; 天竺葵素-3 ， 5- 二葡糖苷（ pelargonidin-3,5-di-O-glucoside ， Pg3G5G ）; 芍药花素-3- 葡糖苷（peonidin-3-O-glucoside，Pn3G）和矢车菊素-3-葡糖苷（cyanidin-3-O-glucoside，Cy3G）。此外，3 种微量的花青素首次在芍药中发现：它们分别为芍药花素-3-葡萄糖-5-阿拉伯糖苷（peonidin-3-O-glucoside-5-O-arabinoside，Pn3G5Ara）、矢车菊素-3- 葡萄糖-5- 半乳糖苷（ cyanidin-3-O-glucoside-5-O-galactoside ，Cy3G5Gal）和天竺葵素-3-葡萄糖-5-半乳糖苷（pelargonidin-3-O-glucoside-5-Ogalactoside，Pg3G5Gal）。特征花青素Cy3G5Gal 和Pg3G5Gal 仅在新疆芍药（Paeonia anomala L.）及其亚种川赤芍（P. anomala subsp. veitchii(Lynch) D. Y.Hong & K. Y. Pan）中被检测出来，表明它们属于同一个种。Pn3G5Ara 仅存在于欧洲的野生芍药花瓣中，表明中国野生芍药和欧洲芍药的花青素代谢途径不同。 芍药花瓣中主要含有11 种花黄素，均为黄酮醇类物质。包括栎精-3，7 二葡糖苷（ quercetin-3,7-di-O-glucoside ）、山奈酚-3 ， 7 二葡糖苷（kaempferol-3,7-di-O-glucoside）、异鼠李素-3，7 二葡糖苷（isorhamnetin-3,7-di-Oglucoside）、栎精-3-O-(6”-没食子酰基)-葡糖苷 [quercetin-3-O-（6”-O-galloyl）-glucoside] 、栎精-3- 葡糖苷（ quercetin-3-O-glucoside ）、山奈酚-7- 葡糖苷（ kaempferol-7-O-glucoside ）、山奈酚-3-O- （ 6”- 没食子酰基） - 葡糖苷[kaempferol-3-O-（6”-O-galloyl)-glucoside]、异鼠李素-3-O-（6”-没食子酰基）-葡糖苷 [isorhamnetin-3-O- （ 6”-O-galloyl ） -glucoside] 、山奈酚-3- 葡糖苷（kaempferol-3-O-glucoside）、异鼠李素-3-葡糖苷（isorhamnetin-3-O-glucoside）和山奈酚-丙二酰葡糖苷（kaempferol-malonyl-glucoside）。此外，查耳酮在黄色的栽培品种‘黄金轮’和牡丹芍药组间杂交种‘伊藤杂种’中首次被检测到。其化学结构为查耳酮-2’-葡糖苷（chalcononaringenin 2’-O-glucoside），它是花瓣表现出黄色的主要色素，它与黄色牡丹野生种‘滇牡丹’（P. delavayi Franchet）花瓣中主要黄色色素成分一致。 通过对所有芍药野生种和栽培品种的色素分析，研究发现花青素是芍药花瓣中主要的色素，其中Pn3G5G 是花瓣中含量最高的花青素苷，其次为Cy3G5G。3G 型糖苷仅在少数品种中检测出来。此外，黄酮醇是芍药花瓣中重要的辅助色素。山奈酚苷是花瓣中含量最高的黄酮醇类，其次是栎精。 多元线性回归分析的结果表明，芍药花色的形成主要与花瓣中Pn3G5G、Cy3G5G 和Pg3G5G 的含量及总花青素量（TA）有关。根据8 种花青素结构与花色组成，将国内的野生种和大部分品种进行了化学分类：所有样本聚成3 大类，聚类后的树状图与其花色、花色素组成数据相一致，直观反映了野生种和栽培品种花色形成的化学背景和表型相似性程度。 芍药成色机理和化学分类的初步研究，对芍药新花色育种具有重要意义：芍药鲜红色花的育种中，育种亲本应具有高的Cy3G 含量、低的辅助色素效应指数。选育深紫色花或紫黑色花的品种，亲本应具有高的Pn3G5G 含量和低的Pg3G5G 含量。

葡萄果皮花色苷构成特点、遗传规律及其在果实成熟过程中的变化

通过利用高效液相色谱-质谱联用技术，研究110 个不同基因型（包括3 个种和5 个种间杂种）葡萄品种的花色苷含量和成分特点。在所有品种中，最多鉴定出29 种花色苷。对葡萄的花色苷总量来说，一般情况下，欧亚种和欧美杂交种的花色苷含量较低，而野生种和砧木品种显著高于其它的种间杂种；在同一个种内，酿酒品种高于鲜食品种；在大多数高花色苷含量的种质中，二甲基花翠素类花色苷是主要的花色苷，而在低总花色苷量的品种，花青素类和花翠素类花色苷是主要的成分。此外，在欧亚种葡萄中，仅检测到单糖苷类花色苷，而在其它葡萄种质中，既有单糖苷花色苷又有双糖苷花色苷。在欧亚鲜食葡萄中，Pn-3-glucoside 是主要的花色苷，而在欧亚酿酒葡萄中，Mv-3-glucoside 是主要的花色苷。通过主成分分析，最终根据花色苷总量的不同和单、双糖苷含量的不同，110 个品种在散点图中被明显的分成3 部分。 通过连续两年调查3 个欧亚鲜食葡萄杂交组合的亲本和后代的花色苷含量来分析花色苷的遗传特点。共鉴定出16 种花色苷，且均为单糖苷类。母本中各花色苷的比例决定了后代中花色苷含量的比例，但是后代中花色苷的绝对含量不受亲本影响。不论亲本还是后代中，Peonidin 3-O-glucoside 和Malvidin3-O-glucoside 都是含量最高的花色苷。花色苷的有或无是寡基因控制的质量性状，而含量的多少是多基因控制的数量性状。通过主成分分析可以得知：在杂交后代中， peonidin 3-O-glucoside, malvidin 3-O-glucoside, delphinidin3-O-glucoside, cyanidin 3-O-glucoside, petunidin 3-O-glucoside, peonidin3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside 和malvidin 3-O-(6-O-coumaryl)-glucoside 是影响果皮中花色苷总量的主要种类。花色苷的含量是一种高广义遗传力的性状，而且这种性状在两年间是稳定的（0.65-0.98）。 5 个不同基因型葡萄品种在成熟过程中果实品质的变化也被研究。始熟期开始后，果粒重量继续增加，果粒较大的鲜食品种增长很慢，而果粒较小的制汁和酿酒品种增长幅度很大；果实内两种主要的糖（葡萄糖和果糖）开始快速上升，且在整个成熟过程中保持1：1；有机酸的含量开始快速下降，苹果酸下降的幅度大于酒石酸。多酚物质在果实始熟期也发生巨大变化，花色苷快速积累。 ‘北紫’和‘梅鹿辄’中的花色苷在成熟前1-2 周达到最大值，‘黑奥林’、‘康可’和‘北醇’在整个成熟过程中花色苷一直增加；对非花色苷类多酚来说，‘黑奥林’和‘梅鹿辄’在果实成熟过程中一直增加，而在另3 个品种中是下降的；花色苷之间以及与黄酮醇之间成正相关，花色苷和酚酸成负相关关系，酚酸和黄酮醇也成负相关关系，黄烷醇物质之间以及与其它类黄酮物质之间成负相关关系。

茉莉酸结构类似物的合成及其对银杏次生代谢的影响

茉莉酸类化合物是一种具有诱导植物次生代谢，抵抗外来侵害，提高植物抗逆防御性等重要作用的植物激素，主要包括茉莉酸（JA）、茉莉酸甲酯（MeJA）及其异亮氨酸衍生物等。茉莉酸的化学合成已报道有十几种之多，但都还无法实现工业化生产，满足农业需求。 本文以α-羧基肉桂酸为起始原料，经过加氢还原、AlCl3-NaCl离子液体中的分子内F-C酰基化反应，HATU催化下与异亮氨酸结合三步反应，合成了一种茉莉酸类似物吲哚异亮氨酸甲酯结合物（Ind-IleMe），总收率约70 %。 用合成的Ind-IleMe、coronalon及MeJA对银杏叶进行诱导，银杏叶经盐酸甲醇溶液加热水解提取黄酮苷元，HPLC检测发现，经诱导后的银杏叶与对照相比银杏黄酮含量均有所增加，最高可诱导银杏叶黄酮含量增长15%—20%，最高诱导浓度coronalon 最低，为1 μmol/L，Ind-IleMe是10 μmol/L，MeJA的诱导浓度最高，大于等于100 μmol/L。 对MeJA诱导后银杏叶的生理生化中几个重要指标进行了测定，发现经诱导后SOD、MDA、PAL、蛋白活性或含量相对升高，叶绿素、可溶性糖含量相对降低，这与MeJA诱导提高银杏叶的逆境防御及次生代谢有关。 在植物的次生代谢中，挥发性气体（VOCs）具有防御草食动物及实现同种及不同种植物间信息交流的重要作用。本文应用自组装的炭阱吸附装置和固相微萃取（SPME）来收集诱导后的银杏叶、利马豆及三种酒中的挥发物，GC-MS检测进行定性定量分析，发现诱导后的银杏叶释放出更多的挥发性有机物，主要是石竹烯等一些参与植物防御机制的倍半萜类，通过对比炭阱吸附和SPME在挥发物的收集上，发现炭阱吸附具有吸附效率更高、样品可短期保存、重复进样分析、可定量等优越性，因此具有很好的发展前景。

棕点湍蛙皮肤分泌液中促胰岛素释放肽的分离纯化、基因克隆及活性分析

通过分离纯化棕点湍蛙(Amolops loloensis)皮肤分泌液中的生物活性物质,得到有促胰岛素释放活性的分离峰,并鉴定其结构.采用葡聚糖Sephadex G-50凝胶层析和反相高效液相(RP-HPLC)等手段对棕点湍蛙皮肤分泌液进行分离纯化,利用胰岛素释放实验进行活性检测,Edman降解法测定活性峰的氨基酸序列,反转录法构建cDNA文库并克隆其基因.得到一个具有显著的促胰岛素释放活性的十六肽,测得其氨基酸序列为:FMPIvGKsMSGLSGKL-NH2,命名为amolopin-1.由cDNA(开放阅读框为192bp)推导的氨基酸一级结构显示,其前体由64个氨基酸残基(aa)组成,包括高度保守的信号肽(22aa),酸性肽以及成熟肽.经过数据库序列比对,从棕点湍蛙皮肤中得到一个新的促胰岛素释放肽,进一步分析其作用机理和药代动力学,极有可能得到一个新的治疗糖尿病的降糖药物.

金环蛇蛇毒中的一种新型胰蛋白酶抑制剂

目的:从金环蛇蛇毒中分离纯化名为bungaruskunin 1的一种新型胰蛋白酶抑制剂,并从其毒腺的cDNA文库中克隆出该胰蛋白酶抑制剂的cDNA全序列.方法:通过Sephadex G-50, CM-Sephadex C-25, HPLC, RP-HPLC (C4 column)方法分离纯化bungaruskunin 1.样品的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性则是在室温条件下50mmol·L-1 Tris-HCl, pH 7.8的缓冲液中通过对显色底物的水解抑制作用来检测的.金环蛇毒腺RNA用TRIZOL提取,并用SMARTM PCR cDNA synthesis kit (Clontech)建成cDNA文库.根据其信号肽的保守区域合成引物从该文库中扩增出bungaruskunin 1的cDNA全序列,进行胶回收,酶连到pMDl8-T载体中转化测序.结果:bungaruskunin 1的前体由83个氨基酸组成,其中信号肽含有24个氨基酸,成熟肽即:bungaruskunin 1合有59个氨基酸.bungaruskunin 1的cDNA序列与从红腹伊澳蛇Pseudechis porphyriacus中分离纯化得到的丝氨酸蛋白酶抑制剂blackelin的cDNA序列的相似性高达64%.bungaruskunin 1是一种含有保守Kunitz端的Kuntiz蛋白酶抑制剂家族的一员,从而能够抑制蛋白酶和弹性酶的活性.在cDNA文库中,我们同时还筛选到了2种新的β-bungarotoxin B链的序列.结论:这些发现很好地证明了蛇中Kunitz/BPTI胰蛋白酶抑制剂和毒性神经的家族可能起源于共同的祖先.

Characterization of three fibrinogenolytic enzymes from Chinese green tree viper (Trimeresurus stejnegeri) venom

Rong Gao, Yun Zhang, Qing-Xiong Meng, Wen-Hui Lee, Dong-Sheng Li, Yu-liang Xiong and Wan-Yu Wang. Characterization of three fibrinogenolytic enzymes from Chinese green tree viper (Trimeresurus stejneger ) venom. Toxicon 36, 457-467, 1998.-From the venom of Chinese green tree viper (Trimeresurus stejnegeri), three distinct fibrinogenolytic enzymes: stejnefibrase-l, stejnefibrase-2 and stejnefibrase-3, were purified by gel filtration, ion-exchange chromatography and reverse-phase high-performance chromatograghy (HPLC). SDS-PAGE analysis of those three enzymes showed that they consisted of a single polypeptide chain with mel. wt of -50 000, 31 000 and 32 000, respectively. Like TSV-PA (a specific plasminogen activator) and stejnobin (a fibrinogen-clotting enzyme) purified from the same venom, stejnfibrase-1, -2 and -3 were able to hydrolyze several chromogenic substrate. On the other hand, different from TSV-PA. and stejnobin, stejnefibrase-l, -2 and -3 did not activate plasminogen and did not possess fibrinogen-clotting activity. The three purified enzymes directly degraded fibrinogen to small fragments and rendered it unclottable by thrombin. Stejnefibrase-2 degraded preferentially BE-chain while stejnefibrase-l and -3 cleaved concomitantly Ax and B beta-chains of fibrinogen. None of these proteases degraded the gamma-chain of fibrinogen. When correlated with the loss of clottability of fibrinogen, the most active enzyme was stejnefibrase-l. The activities of the three enzymes were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and p-nitrophenyl-p-guanidinobenzoate (NPGB), indicating that like TSV-PA and stejnobin, they are venom serine proteases. (C) 1998 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.

A novel antimicrobial peptide from salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis

A novel antimicrobial peptide named as ixosin was isolated from the salivary glands of the hard tick, Ixodes sinensis, by gel filtration, ion exchange chromatography and reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC). Its amino acid sequen

An immunoregulatory peptide from salivary glands of the horsefly, Hybomitra atriperoides

Horseflies are economically important blood-feeding arthropods and also a nuisance for humans, and vectors for filariasis. They rely heavily on the pharmacological propriety of their saliva to get blood meat and suppress immune reactions of hosts. Little information is available on horsefly immune suppressants. By high-performance liquid chromatography (HPLC) purification coupling with pharmacological testing, an immunoregulatory peptide named immunoregulin HA has been identified and characterized from salivary glands of the horsefly of Hybomitra atriperoides (Diptera, Tabanidae). Immunoregulin HA could inhibit the secretion of interferon-gamma (IFN-gamma) and monocyte chemoattractant protein (MCP-1) and increase the secretion of interteukin-10 (IL-10) induced by lipopolysaccharide (LIPS) in rat splenocytes. IL-10 is a suppressor cytokine of T-cell proliferative and cytokine responses. IL-10 can inhibit the elaboration of pro-inflammatory cytokines. Immunoregulin HA possibly unregulated the IL-10 production to inhibit IFN-gamma and MCP-1 secretion in the current experiments. This immunosuppression may facilitate the blood feeding of this horsefly. The current works will facilitate to understand the molecular mechanisms of the ectoparasite-host relationship. 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用

本发明涉及一种中华硬蜱神经肽及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。中华硬蜱神经肽是从中国节肢类动物中华硬蜱神经节中分离得到的一种单链小肽，分子量1005.22道尔顿，等电点8.59，小肽全序列一级结构为：NH2-LVVYPWTK-COOH。其制备方法是把中华硬蜱粘于表面皿的底部并置于冰上20min，接着沿背侧缘切开硬蜱取出神经节，将取出的神经节匀浆、离心去除沉淀、过滤膜过滤，经两次反相高效液相色谱法(RP-HPLC)分离纯化得到。中华硬蜱神经肽具有很强镇痛活性，可作为制备镇痛药物的应用。本发明具有序列简单、镇痛活性强等优点。

Characterization of a thrombin-like enzyme from the venom of Trimeresurus jerdonii

From the venom of Trimeresurus jerdonii, a distinct thrombin-like enzyme, called jerdonobin. was purified by DEAF A-25 ion-exchange chromatography, Sephadex G-75 gel filtration, and fast protein liquid chromatography (FPLC). SDS-PAGE analysis of this enzyme shows that it consists of a single polypeptide chain with a molecular weight of 38,000. The NH2-terminal amino acid sequence of jerdonobin has great homology with venom thrombin-like enzymes documented. Jerdonobin is able to hydrolyze several chromogenic substrates. The enzyme directly clots fibrinogen with an activity of 217 NIH units/mg, The fibrinopeptides released, identified by HPLC consisted of fibrinopeptide A and a small amount of fibrinopepide B. The activities of the enzyme were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and p-nitrophenyl-p-guanidinobenzoate (NPGB). However, metal chelator (EDTA) had no effect on it. indicating it is venom serine protease. (C) 2000 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.