落叶松属的分子进化与生物地理学

　　松科植物的核基因组十分庞大，基因常形成复杂的基因家族，核rDNA ITS 区在基因组内和基因组间存在广泛的长度和序列变异，但染色体数目和核型却高度保守，几乎均为二倍体(2n＝24)，与被子植物频繁的多倍化和高度均一的ITS区形成鲜明对比;叶绿体、线粒体和核基因组分别为父系、母系及双亲遗传，这种独特的遗传体系组合为系统发育重建研究提供了便利条件。因此，松科植物不仅是阐明基因树/物种树这一理论问题的理想试材，而且是基因和基因组进化及核rDNA致同进化机制研究的好材料。此外，松科植物的进化历史悠久，很多类群经历了多次重大的地质历史事件，并呈各种间断分布格局，其生物地理学问题受到广泛关注。本文对落叶松属所有物种(L. lyallii除外)和大部分变种的叶绿体基因组trnT-trnF区、低拷贝核4CL基因家族 (4-香豆酸辅酶A连接酶基因)及多拷贝核rDNA ITS区进行了序列分析，重建了该属的系统发育并揭示了其地理分布格局的形成过程，同时基于克隆和基因谱系分析，探讨了核4CL和rDNA ITS这两个基因家族的进化式样及规律。 　　1. 叶绿体trnT-trnF区和核rDNA ITS区的研究结果表明：落叶松属的种间遗传分化程度很低，北美的种类构成一个单系分支，并为欧亚种类的姐妹群。短苞鳞的欧亚落叶松组和长苞鳞的欧亚红杉组之间的分化较早，接近欧亚和北美种类间的分化时间。换句话说，苞鳞长短的分化在落叶松属中至少发生过两次，其中一次在落叶松属分化的初期，另一次在北美的种类中。结合化石、地史及气候资料，我们推测：落叶松属的共同祖先通过白令陆桥扩散，并形成欧亚和北美两支,然后在不同的板块上独立进化。落叶松组的泛北极分布是冰期后的回迁形成的，而红杉组的物种在第三纪全球气温降低时向南迁移，进而形成东亚－北美间断分布，特别是欧亚红杉组的祖先曾伴随青藏高原的隆升而发生辐射分化。 　　2. 在落叶松属4CL基因家族的研究中共获得44个差异的克隆，除华北落叶松外，其它种类均含2-4个成员。系统发育分析表明： 4CL基因频繁发生重复/丢失，并导致谱系拣选。该基因在落叶松属的共同祖先中发生一次重复，形成4clA和4clB，4clA再次发生基因重复形成4clA1和4clA2。重复产生的这两对并系基因拷贝在进化速率上呈显著差异，其中一个拷贝的进化速率明显加快，可能与进化制约的减弱或功能分化有关。结合其它核基因的研究结果，我们推测频繁的基因重复/丢失可能是形成和维持松科植物庞大核基因组的重要机制之一。 　　3. 对落叶松属101个nrDNA ITS克隆进行了序列及分子进化分析，发现极少数克隆存在较大的长度及（或）序列变异，并可能为假基因或重组体，其它克隆间的序列分化水平较低。因而，落叶松属核rDNA的致同进化速率比松科中两个古老的属（松属和云杉属）快。该致同进化速率的加快可能与落叶松属年轻的进化历史及染色体上较少的rDNA位点数目有关。由于一些特异克隆含嵌合序列及极高的序列变异，推测它们可能来源于物种进化过程中染色体重排形成的小位点(minor loci)或为孤独基因(orphons)。此外，我们发现nrDNA ITS克隆的分布式样与落叶松属的分化及地理分布格局的形成有密切关系：在欧亚红杉组中，克隆常按分类群（物种或变种）形成单系分支，表明这些类群的分化曾伴随着强烈的nrDNA ITS奠基者效应;相反，在欧亚落叶松组中，所有物种的克隆均混杂在一起，说明这些物种的分化时间较晚或在冰期后回迁的过程中曾发生频繁的种间基因交流。

芍药属芍药组的变异与进化：形态、染色体和分子证据

芍药属Paeonia是芍药科Paeoniacea内唯一的一个属。包括大约35个种，间断性的分布于北温带地区。其内三个组分别是牡丹组(sect. Moutan)、北美芍药组(sect. Onaepia)和芍药组(sect. Paeonia)。芍药组是芍药属中最大，也是唯一具有染色体倍性变化的一个组，现有大约25个种。其中，大约半数的种是四倍体（2n＝20），主要分布于地中海地区。虽然有证据表明四倍体类群大多为异源起源，但芍药属内一致的核型、相似的形态和重叠的地理分布使得它们的起源和分类一直存在很大的争议。本研究利用了4个细胞核DNA片段（乙醇脱氢酶基因－Adh1和 Adh2;nrDNA的内转录间隔区－ITS;甘油－3磷酸乙酰转移酶基因－GPAT）和4个叶绿体DNA片段（matK基因;基因间隔区trnL-trnF、psbA-trnH和rps16－trnQ）对芍药组的网状进化进行部分重建。并在此基础上，对推测为杂交起源的P. anomala进行了形态学和细胞发生的研究。主要研究结果如下： 1． 芍药组的系统学 利用多个DNA分子标记(cpDNA: matK, rps16-trnQ; nrDNA: ITS, Adh1, Adh2)，芍药组的二倍体和四倍体类群的系统发育被部分重建。基于最大简约法、贝叶斯法和最大似然法的系统发育分析表明： (a) 除P. tenuifolia之外，所有地中海地区分布的二倍体类群构成一个单系分支。该支与亚洲分布的二倍体类群以及P. tenuifolia成并系关系。 (b) 核和叶绿体DNA系统发育树的不一致，以及ITS、Adh基因的多态性的分析，表明部分二倍体类群间和四倍体类群间都存在杂交事件。这些类群包括：中国新疆阿勒泰地区分布的二倍体种P. anomala和P. intermedia（杂种个体XJ053）;高加索地区分布的二倍体种P. tenuifolia和P. daurica（杂种个体H9933）;土耳其分布的四倍体种P. mascula和P. kesrouanensis（杂交个体在两个居群中检测到）。 (c) 不一致的核和叶绿体DNA系统发育树，以及Adh基因表现出的相同多态性模式进一步支持早先的推测，即四倍体类群P. arietina是异源四倍体。同时扩大的数据分析显示P. obovata近缘类群为其母系亲本，P. tenuifolia近缘类群为其父系亲本。此外，形态上具有一定分化的两个亚种P. arietina ssp. arietina和P. arietina ssp. parnassica是多次起源。 (d) 现今地中海分布类群的近缘种参与了四倍体种P. kesrouanensis 和P. coriacea，以及P. wittmanniana和P. mascula的物种形成。依据Adh序列种内的多态性，初步推测P. kesrouanensis 和P. coriacea可能是异源四倍体，其另一个亲本与P. arietina母系亲本近源。而P. wittmanniana和P. mascula可能是同源四倍体。 (e) P. saueri和P. peregrina的两个亲本类群分别与P. tenuifolia和现今地中海分布二倍体种的近缘类群。 (f) Adh1基因序列中近缘的重组类型暗示：四倍体种P. macrophylla和P. banatica很可能是同倍性杂种。 2． P. anomala的杂交起源和细胞发生 P. anomala新疆阿勒泰地区分布的居群核型第一次被报道。该地区分布的类群核型为2A型(核型公式：2n = 2x = 10 = 6m+2sm+2st)。减数分裂的观察统计显示：阿勒泰地区所有检测个体都是臂内倒位杂合子。基于断片大小以及不同个体染色体桥和/或断片出现率的差异，我们发现该类群臂内倒位存在多态性。荧光原位杂交（FISH）证实P. anomala共有8个18S rDNA位点，并且定位了一个倒位片段在3号染色体的短臂上。此外，高频率的棒状二价体和单价体，以及低的同源染色体的配对系数说明该类群同源染色体间存在分化。染色体结构杂合能够导致部分花粉败育，所有被检测个体的花粉败育率约为8.8 – 29.4%。 扩大的居群取样以及多基因(cpDNA: matK, psbA-trnH, rps16-trnQ, trnL-trnF; nrDNA: ITS, Adh1, Adh2, Gpat)的系统发育分析，进一步支持P. anomala杂交起源于P. veitchii 和P. lactiflora的近缘类群。cpDNA片段和核DNA片段（ITS、GPAT）基因树间的不一致，以及P. anomala Adh1和Adh2序列表现出的多态性都支持该类群杂交起源的推测。不过，表型分析显示P. anomala在形态上偏向于P. veitchii。 3． P. obovata Maxim.四倍体类群的起源 与原先基于形态性状的认识不同，P. obovata 四倍体类群并不是一个严格意义上的同源四倍体。它起源于二倍体P. obovata中国和日本分布的两个地理亚种之间的杂交。Adh2基因仅在中国分布二倍体居群的扩增失败支持这一推测。此外，Adh基因系统发育分析显示：间断性分布于中国中部和中国东北部的四倍体类群是独立起源。

苔藓植物一些东亚特有属的分子系统学研究

苔藓是高等植物（有胚植物或陆地植物）中最原始的一类，但种类却丰富多样，其形态和生长环境的多样化程度高于蕨类和裸子植物，且对极端环境的忍耐力更强，分布范围也更广。“特有”是一个地理概念，它是相对广布而言，当一个类群的分布范围有一定的限制时即为特有现象。“东亚特有”是指分布范围主要局限于中国，朝鲜，日本和蒙古等，向北可及俄罗斯远东地区，少数可分布至中国南部相邻地区的植物类群。东亚地区主要以温带植物区系为主，但也包含一些热带植物区系成分，还因为第四纪以来受冰川活动影响较少，因此植物种类非常丰富。东亚地区也是苔藓植物的多样性中心之一，这里有较多的特有成分。在我国总共分布有苔藓植物东亚特有属35属，其中苔类5属，藓类30属。长期以来，特有成分始终引起人们的极大关注，不仅是因为其在植物地理学上的重要性，还因为特有类群中包含了孓遗类群，往往系统位置比较关键，此外，大部分特有类群对人为干扰比较敏感，对其保护就愈加重要，因为它在这个地区的消失就意味着一个类群的灭绝。 我国对苔藓植物东亚特有类群已有较好的认识，在前人知识积累的基础之上，我们期望通过分子系统学的方法，开展对东亚特有苔藓属的研究，逐步揭开特有属植物的神秘面纱，最终在系统树上找到它们各自应该属于自己的位置。 在本次研究中，我们总共得到十一个苔藓植物东亚特有属的新鲜材料。在实验室中我们对这十一个特有属叶绿体和核的六个基因（叶绿体atpB, rbcL, cp-SSU, cp-LSU 和核18S，26S rDNA）进行了测序，并在此基础之上，构建了来自苔藓植物106个属上述六个基因的联合矩阵，并对它们进行了系统学分析。本文所选十一个特有属中除三个苔类属和一个线齿藓类的属之外，其它七个特有属都属于侧蒴藓类。根据近几年的研究结果，侧蒴藓类中灰藓目被认为是起源自一次快速辐射演化，灰藓目各科之间的关系以及各科的范围都很难确定。即便本实验测序一万多bp，这一支之内的关系仍不能解决。 在以上结果的基础上，本文对线齿藓类的树发藓属（Microdendron）进行了较为详细的研究，我们用最大简约法分析了金发藓目15属，33种的18S, rbcL和trnL-F序列的联合矩阵。对树发藓属的微形态进行了电镜扫描。形态和分子数据的分析结果表明，这个特有属在属级水平是不成立的，它仅是小金发藓属的一个种。此结果支持将这个东亚特有属降为种的等级。此外，本文还对囊绒苔属（Trichocoleopsis）和新绒苔属（Neotrichocolea）的系统位置做了比较详细的研究。我们分别分析了一个苔类植物57属的四基因（cp-SSU, cp-LSU, atpB and rbcL）矩阵和一个苔类植物24属的九基因（cp-SSU, cp-LSU, atpB, psbA, rps4, rbcL, 18S, 26S and nad5）联合矩阵，结果显示囊绒苔属和新绒苔属互为姐妹群关系，而毛叶苔属（Ptilidium）又是它们二者的姐妹群。研究结果支持了囊绒苔属和新绒苔属组成新绒苔科（Neotrichocoleaceae），而不同于前人的观点：将上述两属放置于毛叶苔科（Ptilidiaceae）、绒苔科（Trichocoleaceae）或多囊苔科（Lepidolaenaceae）。另外值得注意的是这两个特有属和毛叶苔属组成的一支位于叶苔类（Leafy liverwort）中“Leafy I”和“Leafy II”两大支之间，但这一支确切的系统位置没有解决，仍有待于进一步研究。 除此之外，本文还利用GenBank中的数据对东亚特有属日鳞苔属（Nipponolejeunea）和耳坠苔属（Ascidiota）（未获得实验材料）进行了初步的系统学分析。结果表明传统上放在细鳞苔科的日鳞苔属与毛耳苔科的毛耳苔属（Jubula）为姐妹群关系，建议将日鳞苔属置于毛耳苔科;耳坠苔属是光萼苔科的成员，属的分类等级是合理的。 最后本文利用罚分似然法，选取多个化石作为标定点，对来自苔藓植物主要类群及其它陆地植物共115个类群5个基因（atpB, rbcL, cp-SSU, cp-LSU, 18S）的矩阵进行了分子钟的分析，初步估算11个东亚特有属的分化时间。

松科nrDNA 的进化研究Evolution of nuclear ribosomal DNA in Pinaceae

核核糖体DNA（nrDNA）已被作为一个重要的标记，用于推断很多分类等级上的系统发育关系。相对于在被子植物中的快速致同进化，nrDNA在裸子植物中的致同进化速率低，且ITS和5S-NTS区有着较大的长度变异，这种现象在松科植物中尤为明显。在本研究中，我们克隆并测定了银杉属的5S rDNA以及冷杉属、银杉属、雪松属、油杉属、长苞铁杉属、金钱松属与铁杉属的ITS序列。基于获得的新数据，再结合前人报导的其它属的数据，我们探讨了如下四个问题： （1）松科 nrDNA ITS1 亚重复单位的组成、分布及进化;（2）ITS1区的长度变异与亚重复单位数目的关系以及它们的系统学意义;（3）松科ITS1的二级结构特征;（4）银杉5S rDNA编码区及非转录间隔区的结构特征。主要研究结果如下： 1. ITS区的序列分析ITS区的克隆及序列分析发现：（1） 松科ITS1的长度变异范围为 944-3271 bp, 这是目前已报导的真核生物中属间ITS变异最大的类群之一;（2） 所有松科植物的ITS区域都包含亚重复单位，亚重复单位的数目从2到9，并且这些亚重复单位可分为两种类型，即不含保守核心序列（5’-GGCCACCCTAGTC ） 的长亚重复单位（LSR）和含上述保守核心序列的短亚重复单位（SSR）;（3） ITS1区的巨大长度变异主要归因于亚重复单位的数量变异; （4） ITS1区的GC含量与 它的序列长度和亚重复单位的数目有一定关系，并能够提供一些系统发育信息，特别是支持云杉属、松属和银杉属三者具有很近的亲缘关系。 2. ITS1亚重复单位的系统发育分析为了研究亚重复单位的进化关系，我们用最大似然法和最大简约法构建了松科ITS1亚重复单位的系统发育树。结果表明：（1）在ML和MP树中可发现有共同的五个分支; （2） 银杉比松科其它属拥有更多的SSR，且该属的所有9个SSR在系统树中构成一个单系支，表明它们是在银杉属内发生重复的;（3）一些SSR在属间和种间具有同源性，可为nrDNA ITS 的进化历史以及松科的系统发育 研究提供重要信息;（4）亚重复单位的多次重复以及伴随的重组可能是导致LSR 和SSR在松科不同属中分布式样不同的原因。 3. 松科ITS1的二级结构 用 Mfold 3.2 软件对松科所有11个属的ITS1区进行了二级结构预测，共获得了563个最低自由能折叠。结合以前关于松科二级结构的报导，我们分析的结果表明：（1） 松科ITS1的二级结构主要由几个延展的发夹结构组成;（2） 构象的复杂性与亚重复的数目呈正相关;（3）配对的亚重复单位通常在保守核心区（5’-GGCCACCCTAGTC ） 处有部分重叠，并且构成一个长茎，而其它的亚重复单位通常会自身折叠，且保守核心区的部分出现在发夹结构的环中。 4. 银杉5S rDNA 序列分析 我们对来自银杉不同群体的3个个体的5S rDNA进行了克隆，共获得 45 条序列，分析结果表明：（1） 绝大多数银杉5S rDNA编码区长度为120 bp, 以GGG 开头，以CTC结尾，编码区出现的碱基替代主要为转换;（2） 银杉与其它裸子植物相比，5S rDNA基因编码区具很高的相似性（90-99%）; （3）间隔区含有一个poly-C和一个poly-T结构、两个TC丰富区以及五个GC丰富区。根据长度和序列特征，银杉的5S rDNA间隔区可分为三种类型：Type A 长751-764 bp，Type B 长770-807 bp （含一个32 bp的插入），Type C 长581-594 bp; （5）长间隔区（Type A，Type B ）中含有两个148-175 bp的串联亚重复单位，该亚重复单位与短间隔区（Type C ）中的一段143 bp的序列具有较高的相似性（56.0-66.8%）。 5. 银杉5S rRNA的二级结构 Mfold 3.2 预测结果表明：（1）银杉5S rRNA二级结构包括5个双螺旋区（干区）（Ⅰ-Ⅴ）、2个发夹结构环区（C和D）、3个中间环区（B1、B2 和 E）和1个铰链区（A）, 铰链区为三个双螺旋的结合处;（2） 二级结构中的环区通常比双螺旋区更加保守;（3）在5个双螺旋中，I 和 IV 区有较高的碱基替代率。

蔷薇类的分子系统学研究—兼论系统发育基因组学的原理和方法(以SET基因超家族为例)

分子系统发育分析的主要任务包括：（1）帮助建立生命之树（tree of life）;（2）追踪基因和基因家族（gene family）的起源和进化, 以获知基因在进化过程中的功能分化和伴随发生的重要分子事件（key molecular events）和形态性状的关键创新（key innovation）。这两个方面在本研究中都有所涉及。对于前者，选用植物线粒体matR基因重建被子植物蔷薇类群的系统发育关系;对于后者，则以SET基因超家族为例，探讨其在真核生物中的进化分类以及与功能多样性的关系。 I 蔷薇类的分子系统学 蔷薇类（rosids）是基于分子数据建立的被子植物的主要分支之一，包含13个目，大约三分之一的被子植物物种。两个主要蔷薇类内部分支是豆类fabids（包含7个目）和锦葵类malvids（包含3个目）。然而，这两个分支内部，以及这两个分支与蔷薇类基部类群，包括牻牛儿苗目（Geraniales）、桃金娘目（Myrtales）和流苏子目（Crossosomatales）之间的关系大多是不清楚的。本研究中，我们选取174个物种来代表72个蔷薇类（rosids）的科，利用两个数据集，即线粒体matR单基因数据集和包括线粒体matR基因、两个质体基因(rbcL、 atpB)和一个核基因(18S rDNA) 的4基因数据集，重建蔷薇类在科以上分类阶元水平的系统发育关系。同时，还对线粒体matR基因的进化特征和用于大尺度系统发育分析的适合度和潜力进行了评价。 线粒体matR单基因数据支持malvids和大多数蔷薇类目的单系性质，然而，豆类（fabids）成员没有形成一个分支，其COM亚支，包括卫矛目（Celastrales）、酢浆草目（Oxalidales）、金虎尾目（Malpighiales）和蒜树科（Huaceae），分辨为锦葵类（malvids）的姐妹群。这个关系在最近根据花结构特征曾被提出过，但从未在之前的分子系统发育分析中得到分辨。4基因数据集支持首先是牻牛儿苗目（Geraniales），接着是桃金娘目（Myrtales）作为蔷薇类（rosids）的最基部的分支;流苏子目（Crossosomatales）是锦葵类（malvids）姐妹群，以及蔷薇类（rosids）的核心部分包括豆类（fabids），锦葵类（malvids）和流苏子目（Crossosomatales）。线粒体matR基因的进化特征分析显示，与两个叶绿体基因(rbcL 和atpB)比较，同义替代速率约是它们的1/4，而非同义替代速率接近于自身的同义替代速率，表明matR 基因具有松弛的选择压力。线粒体matR基因相对慢速的进化使非同源相似（homoplasious）突变减少，提高了系统发育信息的质量，同时，松弛的选择压力使非同义替代数量增加，弥补了慢速进化导致的系统发育信息数量不足的缺陷，这两个方面的结合使线粒体matR基因非常适用于被子植物在科以上水平的系统发育研究。 II SET基因超家族的系统发育基因组学分析 SET基因超家族基因编码含有SET结构域的蛋白，在真核生物中，SET-domain蛋白一般是多结构域（multi-domain）的。SET-domain蛋白具有对组蛋白H3和H4的N末端尾部进行赖氨酸残基甲基化修饰的酶活性;从异染色质形成到基因转录，甲基化的组蛋白广泛影响染色质水平的基因调控。依据SET结构域一级序列的相似性和结构域组织（domain architecture）特征，目前，SET-domain基因超家族被划分为4-7个家族。由于这些划分或者使用动物或者使用植物SET基因，只有少数其它类群的物种加入分析，因此这样的划分可能是不完整的。本研究采用系统发育基 因组学方法（phylogenomic approach），在真核生物范围内广泛取样，期望获得相对完整的SET-domain基因家族的 进化分类方案，在此基础上加深理解SET-domain基因的进化机制和功能多样性。 在提取了17个物种，代表5个真核超群的SET蛋白序列基础上，系统发育分析结合“结构域组织特征”鉴别了9个SET基因家族，其中一个是新的SET基因家族。以前的SET8和Class VI家族,及SMYD和SUV4-20家族分别合并为一个家族。大部分家族在进化过程中发生了2次以上的基因重复事件，通过获得不同的结构域产生具有不同功能的新基因。一个SET基因家族在进化过程中推测发生了从脊椎动物祖先向盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）的水平基因转移。

东亚—北美间断分布类群的分子生物地理学研究—以莲科和菖蒲科为例

在洲际间断生物地理学研究中，东亚—北美间断分布类群的分子生物地理学研究一直是关注和研究的热点。在本论文中我们选取了水生和半水生的植物代表类群，莲科（Nelumbonaceae）和菖蒲科（Acoraceae）作为研究对象，通过来自叶绿体、线粒体和核基因组的DNA 序列分析和微卫星分析，一方面探讨莲科的系统位置、揭示其间断地理格局的形成过程、重建菖蒲科的系统发育及其地理格局的形成过程的同时，另一方面，在总结前人研究成果的基础上，总结东亚—北美间断分布的基本特点。主要成果总结如下。 1. 菖蒲科的系统发育和分子生物地理学 菖蒲科仅含一属，菖蒲属（Acorus），共5 种。其中北美菖蒲（A. americanus） 分布于北美，其余4 种（A. calamus, A. gramineus, A. tatarinowii and A. rumphianus） 分布于亚洲的东部和南部。北美菖蒲和菖蒲（A. calamus）叶片中间具有明显的中肋；其余3 种不具有明显的中肋。本论文的19 份材料包含了4 个种，（不含较狭域分布的长苞菖蒲A. rumphianus），利用4 个叶绿体基因片段（trnL-F, psbA-trnH, rps16-trnK, rbcL）和1 个核基因片段（ITS）的序列重建菖蒲属的系统发育。结果表明（1）具有中肋和不具中肋的物种各自聚为一支；（2）具有中肋的菖蒲和北美菖蒲亲缘关系最近，构成东亚—北美间断种对关系；（3）在不具有中肋的一支内部，来自台湾的材料与其它材料差异最大，其余的材料也明显的分为了两类。基于rbcL 序列，使用松散分子钟模型、贝叶斯算法估算菖蒲属起源时间约为135.17 百万年（mya），菖蒲和北美菖蒲的间断分歧时间约为3.72mya。该结果支持菖蒲属为古老的单子叶植物，但东亚—北美间断物种分化时间较年轻。我们推测间断的种对可能通过白令陆桥，从东亚扩散到了北美。 2. 莲科的系统位置和分子生物地理学 莲科仅含一属，莲属（Nelumbo），两个种莲（N. nucifera）和美洲黄莲（N. lutea），间断分布于东亚、澳大利亚北部和北美东部。莲科的系统位置在形态和分子证据不一致。本论文使用了核基因18S rDNA、26S rDNA，叶绿体基因atpB、rbcL，线粒体基因NAD1 的序列重新构建莲科的系统位置并进行了分化时间推算。结果为：（1）叶绿体和核基因构建的严格一致树的拓扑结构不一致，叶绿体数据支持莲科和山龙眼科、悬铃木科具有较近的亲缘关系，核基因数据显示莲科位于真双子叶植物的基部；（2）5 个基因片段的合并分析结果显示，莲科与山龙眼科、悬铃木科聚为一支但支持率不高；（3）基于核基因、叶绿体和5 个基因的分别合并数据，使用松散分子钟模型、贝叶斯算法估算莲科起源时间分别为，113.13 、109.38 和110.35mya ，两个间断物种的分化时间为，3.77、4.34、5.85mya；（4）根据间断的时间和两个物种的遗传差异程度，现存的两个物种应是来自于东亚或北美的冰期残遗，而不是来自于两个大陆祖先种的独立进化后裔。 3. 莲的分子谱系地理学研究 我们采集了37 份莲的材料，10 份美洲黄莲的材料，代表了两者的主要分布区。我们选取了叶绿体基因（trnL-trnF, trnS-trnG, petB-petD 和psbA-trnH），线粒体基因COX1，以及11 个微卫星位点进行莲的分子谱系地理研究。DNA 序列显示莲和美洲黄莲均具有很低的遗传多样性；微卫星数据揭示了稍高于DNA 序列的遗传多样性。两物种相比，美洲黄莲的多样性较高。基于微卫星数据的遗传结构分析表明，莲存在明显的3 个地理分化区域，这三个区域的遗传分化显著（FST=0.542），说明莲远距离群体间基因交流有限。基于DNA 序列和微卫星数据的单倍型地理分布关系，我们推测东南亚地区是莲的避难所或冰期残遗区，冰期后群体分别向西和向北扩张。 4. 东亚—北美间断分布的一般特点 （1）东亚—北美东部间断分歧时间范围较长，从始新世中期甚至更早一直持续到1mya 左右；东亚—北美西部间断类群分化时间跨度相对小，集中在中新世时期；东亚—整个北美间断分化时间与东亚—北美东部间断类群一样经历较长时间；草本类群晚于木本类群形成间断分布式样，洲际间断分化时间与类群的起源时间并无相关性。（2）东亚与北美间断分布类群的起源地因类群而异。（3） 东亚与北美间断分布类群扩散方向呈不确定性。（4）东亚与北美间断类群扩散有三条可能的路径，即大西洋陆桥、白令陆桥和南半球跨洋长距离传播。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

懒猴属的核糖体DNA变异及其种间分化关系

用15种限制性内切酶和人28S、18S rDNA探针构建了懒猴属各物种核糖体DNA重复单位的限制性内切酶图谱。在进化速率较高的非转录间隔区, 在大、中、小獭猴中分别定位了23、24、24个酶切位点。结果表明, 懒猴属内似只有两个有效物种, 即大懒猴和小懒猴, 中懒猴与小懒猴的分化至多到半种级别。

Chryseobacterium flavum sp nov., isolated from polluted soil

A Gram-negative, non-motile, rod-shaped bacterial strain, designated CW-E 2(T), was isolated from a polluted soil sample collected from Jiangsu Province, China. A taxonomic study of the isolate, including phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene seque

Pontibacter akesuensis sp nov., isolated from a desert soil in China

A Gram-negative, non-motile, rod-shaped bacterium, designated strain AKS 1 T, was isolated from a desert soil sample collected from Alkesu, Xin.lang Province, China. A taxonomic study, including phylogenetic analysis based on 16S rRNA gene sequences and p

Bacillus pallidus sp nov., isolated from forest soil

A Gram-positive bacterium, designated strain CW 7(T), was isolated from forest soil in Anhui Province, south-east China. Cells were strictly aerobic, motile with peritrichous flagella and rod-shaped. The strain grew optimally at 30-37 degrees C and pH 7.0-8.0. The major fatty acids of strain CW 7(T) were anteiso-C-15:0, iso-C-15:0 and anteiso-C-17:0. The predominant menaquinone was MK-7. The cell-wall peptidoglycan contained meso-diaminopimelic acid. The G + C content of the genomic DNA was 42.3 mol%. Phylogenetic analysis indicated that strain CW 7(T) belonged to a monophyletic cluster within the genus Bacillus and showed 16S rRNA gene sequence similarities of less than 96.5% to recognized species of the genus Bacillus. The results of the polyphasic taxonomic study, including phenotypic, chemotaxonomic and phylogenetic analyses, showed that strain CW 7(T) represents a novel species of the genus Bacillus, for which the name Bacillus pallidus sp. nov. is proposed. The type strain is CW 7(T) (=KCTC 13200(T)=CCTCC AB 207188(T)=LMG 24451(T)).

Molecular Phylogeny of Geographical Isolates of Bursaphelenchus xylophilus: Implications on the Origin and Spread of this Species in China and Worldwide

The genetic diversity and phylogeny of 26 isolates of Bursaphelenchus xlophilus from China, Japan, Portugal and North America were investigated based on the D2/3 domain of 28S rDNA, nuclear ribosomal Internal Transcribed Spacer (ITS) sequences, and random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. The genetic diversity analysis showed that the D2/3 domain of 28S rDNA of isolates of B. xlophilus from China, Portugal, Japan and the US were identical and differed at one to three nucleotides compared to those from Canada. ITS sequences of isolates from China and Portugal were the same; they differed at one or two nucleotides compared to those of Japanese isolates and at four and 23 nucleotides compared to those front the US and Canada, respectively. The phylogenetic analysis indicated that Chinese isolates share a common ancestor with one of the two Japanese clades and that the Canadian isolates form a sister group of the clade comprised of isolates from China, Portugal,Japan, and the US. The relationship between Japanese isolates and those from China was closer than with the American isolates. The Canadian isolates were the basal group of B. xylophilus. This suggests that B. xlophilus originated in North America and that the B. xylphilus that occurs in China could have been first introduced from Japan. Further analysis based on RAPD analysis revealed that the relationship among isolates from Guangdong, Zhejiang, Shandong, Anhui provinces and Nanjing was the closest, which suggests that pine wilt disease in these Chinese locales was probably dispersed from Nanjing, where this disease first occurred in China.

Pseudomonas duriflava sp nov., isolated from a desert soil

A Gram-negative, rod-shaped, non-motile, non-spore-forming bacterium, designated strain HR2(T) was isolated from a soil sample from the Talklimaken Desert in Xinjiang Province, China. Strain HR2(T) grew optimally at pH 7.0-8.0 and 30-37 degrees C in the presence of 0-1% (w/v) NaCl. An analysis of 16S rRNA gene sequences revealed that strain HR2(T) fell within the radiation of the genus Pseudomonas, the highest level of similarity being found with respect to Pseudomonas luteola IAM 13000(T) (97.5%); the levels of sequence similarity with respect to other recognized Pseudomonas species were < 96.4%. DNA-DNA hybridization showed that the genetic relatedness between strain HR2(T) and P. luteola IAM 13000(T) was 53.2%. The G + C content of the genomic DNA of strain HR2(T) was 55.2 mol%. The major fatty acids were 18: 1, summed feature 3 and 16:0. The hydroxylated fatty acids 10:0 3-OH, 12:0 3-OH and 12:0 2-OH were also present. The data obtained in this polyphasic study indicated that this isolate represents a novel species of the genus Pseudomonas, for which the name Pseudomonas duriflava sp. nov. is proposed, The type strain is HR2(T) (=KCTC 221129(T) =CGMCC 1.6858(T)).

Sphingobacterium siyangense sp nov., isolated from farm soil

The taxonomic position of a novel Gram-negative strain, designated Sy1(T), isolated from a farm-soil sample obtained from Jiangsu Province, PR China, was characterized by using a polyphasic approach. The cells were non-motile, non-spore-forming rods. The organism grew optimally at 30-37 degrees C and at pH 6.0-8.0. Based on 16S rRNA gene sequence analysis, strain Sy1(T) is a member of the genus Sphingobacterium; Sphingobacterium multivorum JCM 21156(T) was the nearest relative (98.5% sequence similarity). The predominant fatty acids of strain Sy1T were isoC15:0 (32.90/o), C16:0 (10.9%) and summed feature 3 (iso-C-15:0 2-OH and/or C-16:1 omega 7c; 24.1%). The DNA G + C content was 38.5 mol%. The low level of DNA-DNA relatedness (2.2 %) to S. multivorum JCM 21156 T in combination with differential morphological and biochemical properties demonstrated that strain SY1(T) (=KCTC 22131(T)= CGMCC 1.6855(T)) should be classified as representing a novel species of the genus Sphingobacterium for which the name Sphingobacterium siyangense sp. nov. is proposed.

Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp nov (Rhabditida : Rhabditidae), a novel member of the entomopathogenic nematodes

During a recent soil sample survey in Eastern China, a new entomopathogenic nematode species, collected from the Chongming Islands in the southern-eastern area of Shanghai, was discovered. Morphological characteristics of different developmental stages of the nematode combined with molecular data showed that this nematode is a new genus of Rhabditidae, and described as Heterorhabditidoides chongmingensis gen. nov., sp. nov., for that it shares more morphological characteristics with heterorhabditids than with ste-inernematids. For males, the papillae formula of bursa is 1, 2, 3, 3, with constant papillae number in the terminal group, stoma tubular-shaped and about 1.5 head width; cheilorhabdions cuticularized, esophageal collar present and long, median bulb present. For infective juveniles, EP = 90 (80-105) mu m, ES = 104 (92-120) mu m, tail length = 111 (89-159) mu m, and a = 19.1 (15-21). The percentages of the nucleotides A, T, C and G in the ITS1 regions of the new species are significantly different from those of heterorhabditids and other rhabditids. Molecular phylogenetic trees based on 18S rDNA and the internal transcribed spacer (ITS) sequences data revealed that the new entomopathogenic nematode species forms a monophyletic group, which is a sister group of the clade comprised of some genera of Rhabditidae. (c) 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.