贾第虫microRNA 及其靶基因的预测与验证

MicroRNAs (miRNAs)是一类长约21-25nt 的非编码小分子RNAs，通过与靶基因的互补结合在转录水平及转录后水平来负调控基因表达。人们已在众多高等多细胞生物中如人、果蝇、线虫、拟南芥等鉴定出众多microRNAs 分子。近来报道单细胞原生生物衣藻中也存在大量microRNAs。然而到目前为止，在被很多证据证实是最原始的单细胞真核生物贾第虫中却仍未有microRNAs 的报道。那么到底贾第虫这种具有特殊进化地位的单细胞原生动物是否存在有microRNAs 呢？如果存在的话，其microRNAs 的特点是什么？与高等多细胞生物及单细胞衣藻的 microRNA 相比又有何异同点呢？贾第虫的microRNAs 是否与其致病性相关呢？已有研究表明，贾第虫基因组中存在与RNAi 相关的Argonaute（AGO）家族蛋白和Dicer 酶。有意思的是，这些与siRNA 引起RNAi 作用关键的蛋白AGO 和Dicer 同样也是miRNA 系统的关键成份，这就提示我们在贾第虫中很有可能也存在有miRNA 并发挥功能。有研究发现在贾第虫基因组中存在大量的非编码转录物，这些大量的非编码转录物中，是否都是后来所认为的为双向启动子转录有用基因时的副产物，还是也存在一些起调控作用的RNA 分子（如miRNAs 等），需要进一步的研究。本文利用生物信息学的手段，依据miRNAs 的生物学特征，结合多种计算机预测的方法，在贾第虫基因组中筛选可能的microRNAs 分子，结果共鉴定出50 个miRNAs 候选分子，这50 个可能的贾第虫miRNAs 不具有保守性，在已知的其他物种的miRNAs 中找不到同源物。用这50 个microRNAs BLASTN 贾第虫的蛋白质编码序列及其相邻5’端和3’端各200bp 的序列，来寻找这些microRNAs 所调控的靶基因。结果表明，寻找到的贾第虫miRNA 的靶基因除很大一部分未知功能的蛋白外，还包括了很多涉及不同功能的蛋白，如VSP 蛋白（various surface proteins）这样一类表面抗原蛋白，提示我们贾第虫miRNA 可能与其致病性相关。接下来我们对其中14 个预测的贾第虫microRNAs 进行了RT-PCR 检测并克隆测序，结果表明gla-mir-6, gla-mir-35 在贾第虫滋养体细胞中稳定表达。我们的研究第一次用生物信息学结合实验的方法在贾第虫寻找到了microRNAs，为下一步深入研究这些microRNAs 在贾第虫中的功能提供了可能。

Roles of microRNA in plant defense and virus offense interaction

MicroRNAs (miRNA) that are around 22 nucleotides long non-protein-coding RNAs, play key regulatory roles in plants. Recent research findings show that miRNAs are involved in plant defense and viral offense systems. Advances in understanding the mechanism of miRNA biogenesis and evolution are useful for elucidating the complicated roles they play in viral infection networks. In this paper a brief summary of evolution of plant anti-virus defense is given and the function of miRNAs involved in plant-virus competition is highlighted. It is believed that miRNAs have several advantages over homology-dependent and siRNA-mediated gene silencing when they are applied biotechnologically to promote plant anti-virus defense. miRNA-mediated anti-virus pathway is an ancient mechanism with a promising future. However, using miRNAs as a powerful anti-virus tool will be better realized only if miRNA genomics and functions in plant viral infection are fully understood.

Small but influential: the role of microRNAs on gene regulatory network and 3 ' UTR evolution

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous similar to 22 nucleotide noncoding RNAs that regulate the expression of complementary messenger RNAs (mRNAs). Thousands of miRNA genes have been found in diverse species, and many of them are highly conserved. With the mi

PLOD3基因3'调控区的人类特异突变改变miR-124a对PLOD3的调控

microRNAs(miRNAs)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小RNA(长度20-24个碱基).其中,miR-124a是一个在哺乳动物中枢神经系统高度表达的miRNA,在神经前体细胞向神经元分化的过程中起着举足轻重的作用.由于miRNAs特异性地识别靶基因的3'端调控区(3'UTR)的靶序列,因此,在人类起源过程中基因3'UTR的单核苷酸序列变异有可能导致miRNA调控的改变.通过靶基因预测和3'UTR区在哺乳动物代表物种间的同源序列比较,我们发现miR-124a的靶基冈中有一个基因(PLOD3)3UTR的靶位点中存在人类特异突变位点.利用体外报告基因系统,发现PLOD3基因3'UTR靶位点中所含的一个人类特异的突变导致miR-124a对PLOD3的调控效率降低.研究表明,miRNAs靶基因3'UTR的序列变异具有功能效应,它有可能足人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一.

一个快速进化的microRNA家族

microRNAs(miRNAs)是长约22nt的非编码RNA,它可通过降解mRNA或抑制其翻译来调控基因.本文简要介绍了miRNAs的研究背景,阐述了通过比较近缘物种中非保守的miRNA基因来研究miRNAs分子进化的理由.我们的研究结果证实miRNA基因会受到达尔文正选择的影响,发生快速的进化.这一结果将为我们了解非蛋白编码基因的功能与进化提供崭新的视角.

Rapid evolution of mammalian X-linked testis microRNAs

Background: MicroRNAs (miRNAs), which are small, non-coding RNAs approximately 21-nucleotides in length, have become a major focus of research in molecular biology. Mammalian miRNAs are proposed to regulate approximately 30% of all protein-coding genes. P

单细胞真核生物的miRNA系统及其进化意义

miRNA系统在高等多细胞真核生物中得到了广泛深入的研究。近年来,人们在单细胞真核生物上的miRNA研究也取得了重要进展。这不仅丰富了人们对miRNA在整个生物界中的认识,更重要的是对于揭示miRNA这一表达调节系统是如何在生物界中起源进化的问题具有重要意义。该文结合作者在最低等单细胞真核生物——贾第虫上的研究结果,对该领域的研究进展作一概述,并对有关miRNA这一系统的起源进化问题进行了探讨。

Genome-wide computational identification of microRNAs and their targets in the deep-branching eukaryote Giardia lamblia

Using a combined computational program. we identified 50 potential microRNAs (miRNAs) in Giardia lamblia. one of the most primitive unicellular eukaryotes. These miRNAs are unique to G. lamblia and no homologues have been found in other organisms; miRNAs.

大脑表达 miRNA 在大脑进化中的作用及其遗传机制初步研究

人类区别于其它动物的最本质特征是其拥有其他动物所无法比拟的大脑容量及高 级的认知能力。即使与其近亲－非人灵长类相比，人也拥有比非人灵长类大好几倍的脑 容量和更为发达的认知能力。现在一般认为，人类大脑的形成是适应性选择(达尔文正 选择)的结果。但是到目前为止，对人类起源过程中大脑容量增大及认知能力提高的遗 传学机制却知之甚少。以前的研究表明，几个与大脑发育相关的蛋白质编码基因在人类 起源中受到了正向选择。同时，也有证据表明人类大脑的进化也可能是基因表达调控变 化的结果。因此寻找人与非人灵长类大脑表达基因的调控差异或许能够进一步为人与非 人灵长类为何有如此巨大的差异提供分子生物学水平上的解释。 MicroRNA(miRNA)是一类在转录后水平调控基因表达的不编码蛋白质的小 RNA(长度20－24个碱基)。通过调控靶基因的表达，miRNA参与了众多的生理过程。而 很多大脑表达的miRNA的表达量在大脑发育过程中呈显著的变化，这表明miRNA参与 了大脑的发育调控。由此可知，miRNA对其靶基因调控效率的改变很可能引起大脑发育 调控的改变。 本文通过寻找大脑表达的保守microRNA 及对其靶基因的预测，同时用比较基因组 学的方法发现：有很多microRNA 的靶基因3’UTR 的靶位点中存在人类特异突变位点。 我们推测这些人类特异突变位点可能改变microRNA 对其靶基因的表达调控效应，而调 控效应的改变可能在进化过程中对认知能力的提高发挥重要作用。利用体外报告基因系 统，我们发现有几个预测的靶基因是对应miRNA 的真实靶基因。其中，miR-127 的靶 基因（SEMA3F）3’UTR 的靶位点中所含的一个人类特有的突变增强了miR-127 对 SEMA3F 的调控效率。将该位点突变回复为黑猩猩的位点使得miR-127 对SEMA3F 的 调控效率降低到黑猩猩的水平。这表明miR-127 对SEMA3F 的调控效率的改变确实是 由该人类特异突变位点引起的。我们提供了人类特异突变位点能够引起miR-127 对SEMA3F 的调控效率的改变的体外证据，但是体内的调控模式是否如此尚需进一步的工 作。 总之，本文通过体外试验表明，miRNA靶基因3’UTR的序列变异具有功能效应，它 有可能是人类中枢神经系统在起源和演化中发挥关键作用的重要遗传机制之一。

microRNA 在灵长类中的进化及其对靶基因表达变异度的影响

microRNAs（miRNAs）是基因组中广泛编码的一类小RNA 基因，存在于绝大多数多细胞生物中，而且在各种生物学过程中都起着举足轻重的作用。miRNAs 在转录后水平通过与mRNAs 的3’UTRs 序列互补识别靶基因，并引起靶基因的降解或阻遏其翻译。在动物中，一个miRNA 可以调控数百个靶基因的表达。大多数miRNAs 在物种间高度保守，暗示了其功能的重要性。然而，非保守的miRNAs可能对物种特有新功能的产生有贡献。为了回答miRNAs是如何起源，如何进化的问题，我们研究了两个非保守miRNA 家族在灵长类中的进化历史。第一个miRNA 家族位于X 染色体上，在灵长类中的数目比狗或啮齿类中的多。我们比较了这一家族在灵长类主要分支－人、大猿、小猿、旧大陆猴和新大陆猴中的序列情况，发现了这一家族在灵长类中的快速进化。这种快速进化包括频繁的串联重复和碱基替换现象。此外，在人和黑猩猩中还发现了相应进化分支特有的替换，可能会导致分支特有的新miRNAs 的产生。对这一miRNA 家族在不同发育阶段恒河猴睾丸中的表达分析揭示了miRNA 表达变化和雄性性成熟之间的负相关，暗示这一家族在睾丸发育和精子成熟中可能起的调节作用。最后，我们认为，像蛋白编码基因一样，与雄性生殖功能相关的miRNAs 容易受到性选择而发生适应性进化。第二个miRNA 家族是位于19 号染色体上的一个灵长类特有的家族。通过分析和比较这一家族以及其临近区域在9 个不同灵长类物种中的序列，我们发现了 Alu 介导的这一家族的产生和扩张。序列比较表明，物种内和物种间miRNAs 的序列分歧相似；同时，在各个灵长类分支中均存在基因拷贝的获得和丢失，也存在基因的假基因化。由此表明，这一家族在灵长类中经历了典型的“生－死”进化历程，暗示这个家族的miRNA 基因在灵长类的进化中其功能可能发生了多样化，以适应不同灵长类物种在发育过程中的需要。此外，二级结构的保守性和前体miRNAs 区域的低SNP 密度都表明这一家族受到功能性约束。最后，我们进一步分析了这一家族在胎盘和胎儿大脑中的表达，揭示其对灵长类胚胎发育可能的重要性。除了研究miRNAs 在灵长类中的进化，我们还探讨了miRNAs 对基因表达变异度的影响。通过对已发表的193 例人类大脑基因表达谱的分析发现，基因在人群中的表达变异的大小和调控它的miRNA 数目呈正比，这暗示了miRNAs 对基因表达变异度的直接影响。相比于不受miRNA 调控的基因，受到两个以上 miRNA 核心区调控的基因有较高的表达变异度，不受miRNA 类型的影响。同时，我们还证明，人群中靶基因miRNA 识别序列上的变异（SNPs）会进一步导致靶基因表达变异的增加。我们的研究表明miRNAs 是影响人群中基因表达变异度的因素之一。

Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates

MicroRNAs (miRNAs) are a growing class of small RNAs ( about 22 nt) that play crucial regulatory roles in the genome by targeting mRNAs for cleavage or translational repression. Most of the identified miRNAs are highly conserved among species, indicating

Molecular evolution of a primate-specific microRNA family

Lineage-specific microRNA (miRNA) families may contribute to developmental novelties during evolution. However, little is known about the origin and evolution of new miRNA families. We report evidence of an Alu-mediated rapid expansion of miRNA genes in a

Diversity and evolution of MicroRNA gene clusters

microRNA (miRNA) gene clusters are a group of miRNA genes clustered within a proximal distance on a chromosome. Although a large number of miRNA clusters have been uncovered in animal and plant genomes, the functional consequences of this arrangement are

紧密连接分子Symplekin 在肝脏疾病中表达及调控机制的研究

肝细胞癌是世界上多发的肿瘤之一，在中国及东南亚地区尤为多见，其死亡率高且预后差。肝癌具有多种发病原因且伴有多种肿瘤相关基因的分子突变。细胞连接分子（紧密连接、粘着连接、桥粒）在维护细胞极性及上皮细胞屏障方面起着重要作用，其表达异常与恶性肿瘤发生、发展有很大相关性。Symplekin 是新近发现的紧密连接相关分子，紧密连接分子 Symplekin 是多定位与多功能的蛋白，除参与上皮细胞紧密连接的形成外，Symplekin 还参与RNA 3’端腺苷酸化的过程，并且具有调节细胞增殖的作用。我们前期工作发现Symplekin 在癌前病变、恶性病变的肝细胞中明显降低，可能参与肝细胞的恶性转化。研究紧密连接分子Symplekin 在肝脏疾病中表达及调控机制对于阐明肝癌发生的机理及对于肝癌的预防和治疗具有十分重要的意义。多种分子调控机制导致基因表达水平的降低，如：基因启动子区域的超甲基化现象，基因核心启动子区域的碱基缺失，炎症相关因子TNF-alpha 和/或 INF-gamma导致基因表达水平的下降以及microRNAs对于靶基因的下调作用。因此，本研究利用Bisulfite restriction PCR、半定量PCR、q-RT-PCR、Western-blot等方法检测Symplekin在肝硬化、肝癌及多种癌细胞系中表达水平改变，及其在肝癌及肝癌细胞系中表达降低的机理——启动子区域发生 CpG岛的甲基化；启动子区域缺失；细胞因子TNF-alpha 和 IFN-gamma 对Symplekin 表达水平的影响；MicroRNAs在癌细胞系中与Symplekin的相对表达情况。实验结果显示（1）Symplekin 在肝硬化和肝癌组织中mRNA 表达水平呈下降趋势， Symplekin 在癌细胞系如肝癌细胞系（ HepG2 、HuH-7 ）、肺癌细胞系（GLC,Spca-1,Ncih446,801D）、宫颈癌细胞系（Hela）、乳腺癌细胞系（Mcf-7）中表达均下降。（2）利用细胞因子TNF-alpha、INF-gamma 同时处理HepG2 细胞系，Symplekin mRNA、蛋白均表达下降。（3）应用q-RT-PCR 检测5 个细胞系中Symplekin、Mir-124 的相对表达量，发现Mir-124 和Symplekin 表达量变化有相反趋势。（4）应用bisulfite restriction PCR 对13 例肝癌组织、10 例肝硬化组织、4 例正常肝组织以及肝癌细胞系HepG2 、Huh7 启动子区域甲基化状态进行检测，发现Symplekin 启动子区域都无甲基化现象；（5）同时，对8 例肝癌组织、10 例正常肝组织、5 例上皮细胞系及6 例白血病细胞系启动子区域缺失进行检测，发现Symplekin 启动子区域确实有碱基缺失，但其在肝癌组织、肝硬化组织、正常肝组织间没有统计学意义。实验结果提示Symplekin 很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用，此外 Symplekin 表达下降可能不仅参与肝癌发生且与其它肿瘤的发生具有相关性。推测在肝炎、肝硬化中，Symplekin 的下降可能会导致紧密连接功能下降，肝胆管上皮屏障功能降低， CB(结合胆红素)返流入血中，可能也是造成黄疸形成的原因之一。在肝脏疾病炎症反应过程中，细胞因子可能会协同作用影响Symplekin 的表达。Mir-124 有可能直接负调控Symplekin 的表达从而导致其表达降低。而Symplekin 启动子区域甲基化或缺失与肝癌发生无相关性。结论：（1）Symplekin 在大部分肝炎、肝硬化、肝癌组织中mRNA 表达水平呈下降趋势，这表明Symplekin 很可能在肝细胞的恶性转化中起着重要的作用。（2）Symplekin 在癌细胞系如肝癌细胞系（HepG2,HuH-7）肺癌细胞系（GLC,Spca-1,Ncih446,801D）、宫颈癌细胞系（Hela）、乳腺癌细胞系（Mcf-7）中表达均下降，这提示Symplekin 表达下降可能不仅参与肝癌发生而且参与其它肿瘤的发生。（3）Symplekin 启动子区域甲基化或缺失在肝癌、肝硬化及正常肝组织之间无显著性差异，表明在肝癌发生时Symplekin 的表达下降可能与启动子DNA 甲基化和缺失无关。（4）体外实验表明炎症细胞因子TNF-alpha 与INF-gamma 的协同参可能是体内Symplekin 表达及调控的机制之一。（5）Mir-124 对于Symplekin 的负调控作用也可能是体内Symplekin 表达及调控的机制之一。炎症细胞因子TNF-alpha 与INF-gamma 及Mir-124 可能在肝脏疾病及肝癌发生过程中起着重要作用。

树突状细胞体外分化成熟的时程、mi/mRNA 表达谱分析和共生菌影响的研究

树突状细胞（dendritic cells, DC）作为机体天然免疫和获得性免疫反应的桥梁和枢纽，发挥着重要的启动和调控作用。随着体外诱导方法的建立和生物学技术的进步，有关DC 的基础生物学研究得到了快速的发展，在诱导方法、个体发生及基因表达和调控等方面，涌现出很多新的、未解的关键问题。同时，随着对粘膜免疫机理研究的深入，DC 在粘膜生态环境中的功能和影响，渐已成为免疫学研究前沿领域中的热点和要点。在本研究中，为了确定DC 体外分化成熟的最短时程，同时为了研究DC 分化成熟相关的基因表达调控，我们建立了快速的DC 体外诱导方法，分析了体外快速诱导 DC 的mi/mRNA 表达谱。此外，在原始分离的女性生殖道共生乳酸杆菌的基础上，以THP-1作为DC 前体细胞的细胞系模型，开展了女性生殖道共生乳酸杆菌刺激活化 THP-1 的研究，希望能够为乳酸杆菌作为生殖道粘膜免疫疫苗的应用提供理论基础。首先，采用外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）来源的CD14+细胞为DC 前体，经过GM-CSF 和IL-4 的刺激，1-6 天后得到未成熟DC （immature dendritic cells, iDC），并经成熟因子（TNF-α, IL-1β, IL-6 与PGE2）诱导 1-2 天后，获得成熟DC（mature dendritic cells, mDC）。经过比较和分析，明确了完全分化和成熟各2 天，即“2+2”，为DC 诱导分化的最佳和最短时程，从而证实和建立了DC 体外快速诱导的体系和方法。该方法获得的iDC 与mDC，具有与传统的“6+2” 方法获得的DC 相同的形态与表型，而且，利用该方法获得的DC 总数高于“1+1”， “1+2”与“6+2”的方法，为DC 的生物学研究提供了基础数据。我们进而采用芯片技术，对体外快速分化成熟的DC 进行了mi/mRNA 表达谱分析，确定了DC 不同分化发育阶段特征性的mi/mRNA 表达差异。结果发现，与CD14+ 单核细胞即DC 前体相比，iDC 与mDC 之间具有更加相近的mi/mRNA 表达方式。 miRNA 表达谱分析则表明，不同的miRNA 表达与DC 的不同分化和发育阶段相关。而且，位于同一基因簇内的miRNA，呈现协同表达的情况。特别值得注意的是，本研究发现了在DC 的某些发育阶段特异表达的miRNA，它们在DC 发育过程中的功能，还未得到诠释，它们在DC 某些分化阶段的特异表达，提示了DC 各分化阶段的相关性与特异性。结合mRNA 表达谱分析，我们发现miRNA 的表达与其目的基因的表达在mRNA 水平呈现负相关的特性。同时，免疫相关mRNA 与miRNA 在DC 体外不同发育阶段的表达亦呈现差异，其中，miRNA（如hsa-miR-181a, hsa-miR-223, hsa-miR-155, hsa-miR-146, hsa-miR-106a 与hsa-miR-20a 等）与mRNA（如ALM1 等）参与了特定的与免疫相关的GO（Gene Ontology）与通路（Pathway），提示这些miRNA 与mRNA 可能通过不同的方式调节控制着DC 的体外诱导过程。在有关粘膜生态环境中DC 的分化、成熟及其功能影响的研究中，我们首先通过各种乳酸杆菌鉴定方法的综合应用，确定了6 种原始分离的女性生殖道主要共生乳酸杆菌：发酵乳酸杆菌（L.Fermentum）、约氏乳酸杆菌（L.Johnsonni）、卷曲乳酸杆菌（L.Crispatus）、革氏乳酸杆菌（L.Gasseri）、詹氏乳酸杆菌（L.Jensenii）与德氏乳酸杆菌（L.Delbrueckii ）。其中，德氏乳酸杆菌（L.Delbrueckii）和发酵乳酸杆菌（L.Fermentum）具有较高的产H2O2 的能力。在此基础上，我们在与THP-1 的共同培养体系中，将乳酸杆菌对DC 前体的作用和影响进行了比较和研究。结果发现，L.Crispatus 在分离的各原始菌株中，具有最强的刺激THP-1 活化的能力，而且，在相同刺激比例下，L.Crispatus 活菌具有比死菌更强的免疫刺激能力，表现为明显上调THP-1 细胞表面标志CD40、CD80、CD86、 CD1a、CCR6 与CD324 的表达水平，同时可诱导活化THP-1 上调表达Th1 型细胞因子。通过FITC-Dextran 吞噬实验，我们发现，经过L.Crispatus 刺激的THP-1 细胞，其吞噬外来抗原的能力明显下降，但尚未检测到经过活化的THP-1 细胞刺激T 细胞增殖的能力。通过流式细胞术分析的方法，我们检测了TLR1、TLR2、TLR4 与TLR6 在不同的刺激分化阶段的表达水平，结果表明，THP-1 主要通过TLR2 与TLR6 识别女性生殖道L.Crispatus。综上所述，本研究首先通过对DC 体外分化成熟的最短时程的分析，确立了快速诱导DC 的最佳方法，进而利用芯片技术，研究了快速诱导DC 的mi/mRNA 表达谱，揭示了DC 体外分化发育过程中可能的调控途径，为进一步研究DC 的基础生物学提供了恰当的模型和具有指向性的线索。同时，通过与DC 前体THP-1 的共同培养体系，证实了生殖道共生乳酸杆菌的免疫调节作用，为以乳酸杆菌为载体的生殖道粘膜免疫疫苗的研究和应用提供了实验依据