A novel fusion gene, TRIMS-Cyclophilin A in the pig-tailed macaque determines its susceptibility to HIV-1 infection

Objective: In Old World monkeys, the tripartite motif Sec (TRIM5 alpha) protein confers resistance to HIV-1 infection following virus entry into host cells. However, the pig-tailed macaque (Macaca nemestrina) is an exception and is susceptible to HIV-1 in

Adaptive evolution of primate TRIM5 alpha, a gene restricting HIV-1 infection

Recent studies showed that nonhuman primate TRIM5 alpha can efficiently block HIV-1 infection in human cell lines. It can also restrict other retroviruses, therefore, suggested as a general defender against retrovirus infection. Here, we present an evolutionary analysis of TRIM5 alpha in primates. Our results demonstrated that TRIM5a has been evolving rapidly in primates, which is likely caused by Darwinian positive selection. The SPRY domain of TRM5 alpha, which may be responsible for recognition of incoming viral capsids showed higher nonsynonymous/synonymous substitution ratios than the non-SPRY domain, indicating that the adaptive evolution of TRIM5a ill primates might be an innate strategy developed in defending retrovirus infection during primate evolution. In addition, the comparative protein sequence analysis suggested that the amino acid substitution pattern at a single site (344R/Q/P) located in the SPRY domain may explain the differences in Susceptibilities of HIV-1 infection in diverse primate species. (c) 2005 Elsevier B.V. All rights reserved.

A novel heme-containing protein with anti-HIV-1 activity from skin secretions of Bufo andrewsi

A novel protein, named BAS-AH, was purified and characterized from the skin of the toad Bufo andrewsi. BAS-AH is a single chain protein and the apparent molecular weight is about 63 kDa as judged by SDS-PAGE. BAS-AH was determined to bind heme (0.89 mol heme/mol protein) as determined by pyridine haemochrome analysis. Fifty percentage cytotoxic concentration (CC50) of BAS-AH on C8166 cells was 9.5 mu M. However, at concentrations that showed little effect oil cell viability, BAS-AH displayed dose dependent inhibition oil HIV-1 infection and replication. The antiviral selectivity indexes corresponding to the measurements of syncytium formation and HIV-1 p24 (CC50/EC50) were 14.4 and 11.4, respectively, corresponding to the . BAS-AH also showed an inhibitory effect on the activity of recombinant HIV-1 reverse transcriptase (IC50 = 1.32 mu M). The N-terminal sequence of BAS-AH was determined to be NAKXKADVIGKISILLGQDNLSNIVAM, which exhibited little identity with other known anti-HIV-1 proteins. BAS-AH is devoid of antibacterial, protcolytic, trypsin inhibitory activity, (L)-amino acid oxidase activity and catalase activity. (c) 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.

树突状细胞与 HIV-1 辅助蛋白相互作用的体外研究——细胞系模型研究价值的验证和新的研究方向的确立

树突状细胞（Dendritic cells，DCs）作为人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）感染的第一靶细胞和第一道防线， 在HIV-1感染 和传播过程当中发挥重要的功能。DC的免疫功能主要包括抗原的捕获、加工、 递呈并激活T细胞对HIV-1作出免疫反应，这些功能的发挥依赖于其自身接受刺 激有效地分化和成熟。 与其它慢病毒（lentivirus）相同，HIV-1所具有的6种辅助蛋白（Nef，Rev， Tat，Vif，Vpr和Vpu），决定着病毒自身的复制增殖和对机体的感染和致病力。 目前，HIV-1辅助蛋白对CD4+ T细胞影响的研究较为深入，是否影响和调节DC 的分化和成熟尚不够清楚，现有的文献报道很少，且相互不一致甚至矛盾。因此， 建立合适的体外研究体系和细胞模型，有针对性地进行研究DC与HIV-1之间的相 互作用，将有助于加深对HIV/AIDS致病和发病机理的理解，具有重要的生物医 学意义。 本实验选择了可被HIV-1感染的白血病细胞系THP-1为实验模型，首先评价 了THP-1作为DC前体在研究DC分化、成熟中的可用性，特别是判定DC分化成熟 和功能状态的主要细胞表面标记的动态变化和规律。进而在相同条件下分析了6 个辅助蛋白基因对THP-1的凋亡诱导作用，证实了Nef和Tat确可诱导转染细胞自 身凋亡，而Rev和Vpr可在THP-1细胞中持续表达，形成了稳定的细胞系，为进一 步研究和比较Rev、Vpr对DC的分化、成熟的影响奠定了实验基础。更重要的是， 我们发现，Vif和Vpu不能在THP-1中有效表达，其原因可能直接与限制性因子 APOBEC3G的存在有关，提示Vpu与APOBEC3G可能存在着新的相互作用——这 一线索已作为实验室新的研究方向，进一步深入的研究可能为HIV/AIDS致病、 发病机理和机体的抗病机制提供新的科学依据。

树突状细胞与HIV-1 辅助蛋白相互作用的体外研究——新的实验体系的建立与应用

树突状细胞（DC）是免疫系统中具有多种免疫功能的关键细胞，但在HIV/AIDS 患者 体内，虽有大量病毒及抗原存在，却不能有效地激发特异性免疫应答。最新的研究显示， HIV/AIDS 血源和性传染的途径虽有不同，但DC 均是早于T 细胞而最先遭受感染的“第一 靶细胞”。已知辅助蛋白（Nef、Rev、Tat、Vif、Vpr 和Vpu）是HIV-1 在宿主细胞内复制 和致病的根本因素。而哪种辅助蛋白、如何影响DC 功能，至今研究结果甚少，结论杂乱 不一。 本论文作为HIV-1 影响DC 功能研究的实验体系部分，旨在为系统比较研究6 个辅助 蛋白对DC 功能的调节和机理奠定基础。采用分子生物学和免疫学技术方法，把辅助蛋白 基因从DNA 和mRNA 水平导入目的细胞DC，在DC 前体及其分化、成熟的各个时相， 连续、动态地分析辅助蛋白对DC 特征性表面标志及免疫相关基因的表达水平、摄取和处 理抗原、激发和调控免疫应答等功能的影响，以期揭示HIV/AIDS 患者DC 功能明显异常 和失调的原因。 首先，分别将6 个辅助蛋白基因克隆到pEGFP-N2 和pCS2+表达载体，得到具有绿色 荧光蛋白融合基因的表达载体，将分别用于DNA 和mRNA 水平转染DC。再以K562 细胞 为模型建立mRNA 转染细胞的基本方法；以人外周血CD14 单核细胞为前体，建立了体外 “2＋2”快速诱导DC 的方法。最后，利用Amaxa 转染系统，从DNA 水平研究辅助蛋白对 DC 前体（单核细胞）的功能影响。发现单核细胞转染辅助蛋白与GFP 融合基因5h 后，胞 内蛋白大量表达，且能维持表达48h；其中Nef、Tat、Vpu、Rev、Vif、Vpr 表达效率分别 为35.42%、34.42%、43.42%、 17.07%、13.65%、10.29%；单核细胞转染基因后，表型 CD14、HLA-DR、CD80、CD83、CD86、DC-SIGN 没有明显的表达变化；转染Nef、Vpu、 Rev 辅助蛋白后，单核细胞有10％凋亡；Vpr 能抑制单核细胞IL-10 的分泌，Nef 能促进分 泌IL-6。 总之，通过构建辅助蛋白的表达载体，优化DC 的体外培养过程以及mRNA 转染方法， 并成功将辅助蛋白导入DC 前体，鉴定其表型和功能变化。为研究辅助蛋白影响DC 的功 能和机制建立了稳定而可行的实验系统。

一种多皱软磺酸在抗HIV-1病毒中的应用

本发明涉及抗HIV-1病毒活性的化合物，具体地说是一种多皱软磺酸在抗HIV-1病毒中的应用，多皱软磺酸的结构式为，以所述多皱软磺酸为抑制HIV-1病毒活性的有效成分，该化合物在细胞水平的活性检测中，对1型人类免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virustype I，HIV-1)表现出很好的抑制活性，而对宿主细胞的毒性非常小，作为药物先导化合物具有良好的应用前景。

稳定表达HIV-1辅助蛋白Rev的THP-1细胞模型的建立和鉴定

Human immunodeficiency virus-1(HIV-1)辅助蛋白在其感染和艾滋病发病过程中起着非常重要的作用.Regulator of expression of virion proteins(Rev)作为HIV-1辅助蛋白之一,可以调节病毒结构蛋白mRNA出核转运和蛋白表达,对于病毒的复制至关重要.为研究Rev蛋白对靶细胞表犁和功能的影响,本实验采用电穿孔的方法,将HIV-1的rev基因导入THP-1细胞,通过流式分选结合G418筛选的方法建立稳定表达Rev蛋白的细胞模型;并通过RT-PCR、荧光观察及流式检测的方法,在mRNA和蛋白两个水平对所建立的细胞模犁进行鉴定.结果证实rev基凶成功导入了THP-1细胞并稳定表达,为后续rev基因产物与细胞相互作用的研究提供了平台.

两种AZT-氟喹诺酮偶联物体外抗HIV-1及抗菌活性的研究

目的 体外测定两种AZT-氟喹诺酮偶联物SRLZ和SROZ的抗HIV-1活性及抗菌活性.方法 通过合胞体抑制、HIV-1感染细胞保护、HIV-1 p24抗原测定等方法检测急性感染中化合物对HIV-1实验株、临床分离株的抑制作用和对慢性感染细胞中的病毒复制影响;通过体外金黄色葡萄球菌的抑制实验检测化合物的抗菌活性.结果 AZT-氟喹诺酮偶联物SRLZ和SROZ能抑制HIV-1实验株诱导的合胞体形成,减少病毒感染细胞的死亡和抑制病毒在细胞内的复制;SRLZ和SROZ对HIV-1临床分离株也有较好的抑制作用;SRLZ和SROZ对HIV-1的抑制活性与AZT相近;AZT-氟喹诺酮偶联物也能抑制金黄色葡萄球菌,其MIC值与其相应的阳性药物相近.结论 SRLZ和SROZ有很好的抗HIV-1活性和抗菌活性.

HIV-1 C亚型密码子优化gp120基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的 构建含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并在293细胞中表达gp120蛋白.方法 PCR扩增,获得HIV-1 C亚型gp120片段,定向克隆入腺病毒转移载体pTrack-CMV,线性化后转化至含有腺病毒骨架载体pAd-easy-1的大肠埃希菌BJ5183,获得重组子prAd-gp120,PacⅠ酶切纯化后转染293细胞,包装成复制缺陷型重组腺病毒vAd-gp120.结果 经PCR、酶切及DNA测序,插入片段大小、方向正确,获得了具有感染力的vAd-gp120重组腺病毒;通过Western 印迹检测,重组腺病毒在293细胞中表达出分子量为120 kD的蛋白.结论 成功构建了含有HIV-1 C亚型gp120基因重组腺病毒载体,并获得该基因的表达.

蒲葵籽提取物体外抗HIV-1活性及机制的初步研究

下载PDF阅读器目的 研究蒲葵籽提取物的体外抗HIV-1活性,对有活性粗提物进行初步机制研究.方法 采用细胞毒性、合胞体抑制、HIV-1感染细胞保护实验和HIV-1 p24抗原测定等实验对蒲葵籽提取物体外抗HIV-1活性进行筛选和确认;采用重组HIV-1逆转录酶和蛋白酶活性抑制实验,融合阻断实验初步探讨活性粗提物的作用机制.结果 蒲葵籽的醋酸乙酯(P3)提取物具有较强的体外抗HIV-1活性,P3抑制HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的EC50为5.64 pg/mL,对C8166细胞的毒性较小,CC50大于200 μg/mL,治疗指数(T1)大于35.46;P3抑制HIV-1急性感染中p24抗原表达的EC50为23.04 μg/mL,抑制正常C8166细胞与慢性感染细胞Hg/HIV-1-B融合的EC50为8.00 μg/mL;P3在质量浓度为200μg/mL时,对HIV-1逆转录酶的抑制率为28.86%;P3抑制重组HIV-1蛋白酶活性的EC50为1.77μg/mL.结论 蒲葵籽的醋酸乙酯提取物(P3)具有较强的体外抗HIV-1活性,其作用机制可能主要为阻断病毒进入和抑制HIV-1蛋白酶活性.

Anti-HIV-1 Activities of Hemslecins A and B

目的:研究从药用植物金佛山雪胆分离的雪胆素A和雪胆素B两个三萜类化合物的体外抗HIV活性.方法:应用合胞体抑制实验、p24抗原产生的抑制实验、慢性感染细胞和正常细胞间的细胞融合抑制实验等技术检测化合物的体外抗HIV-l活性;利用HIV-l逆转录酶、蛋白酶抑制实验,NCp7锌离子逐出实验探讨化合物的作用机制.结果:雪胆素A和雪胆素B在体外有较好的抑制HIV-l活性,其活性主要表现为:(1)抑制HIV-l诱导合胞体形成,EC50值分别为3.09 μg·mL-1和2.53μg·mL-1;(2)抑制HIV- 急性感染的C8106细胞p24抗原产生,EC50值分别为3.97μg·mL-1和18.90μg·mL-1;(3)抑制HIV-1 慢性感染H9与正常C8166细胞间融合,EC50分别为1.76μg·mL-1和11.95μg·mL-1.雪胆素A和雪胆素B对HIV-l逆转录酶、蛋白酶、NCp7锌离子逐出均没有抑制作用.雪胆素A对HIV-1整合酶有微弱的结合活性,而雪胆素B对HIV-1整合酶没有结合活性.在共培养实验中,雪胆素A和雪胆素B预处理C8166细胞组比未经预处理细胞组能够更有效的抑制HIV-l活性.结论:化合物雪胆素A和雪胆素B体外有较好的抗HIV-1活性,可能主要作用于HIV-1病毒进入细胞阶段.

八棱丝瓜蛋白1的体外抗HIV-1活性

目的:研究八棱丝瓜蛋白1的抗HIV-1活性.方法:通过实验株HIV-1IIIIB诱导合胞体形成抑制实验、HIV-1IIIB和临床分离株HIV-IKM018急性感染细胞以及HIV-1IIIB慢性感染细胞的p24抗原表达抑制实验检测八棱丝瓜蛋白1的抗HIV-1活性.结果:八棱丝瓜蛋白1抑制HIV-1IIIB诱导C8106细胞形成合胞体的EC50为0.025 μmol·L-1,治疗指数为76.八棱丝瓜蛋白1抑制HIV-1IIIB感染C8166和HIV-1KM018感染PBMC的p24抗原表达的EC50分别为0.033和0.207 μmol·L-1.八棱丝瓜蛋白1不抑制HIV-1IIIB在慢性感染H9细胞中的复制.结论:首次发现八棱丝瓜蛋白1是一种具有抗HIV-1活性的核糖体失活蛋白.

平顶猴TRIM5α基因变异影响其抗HIV-1功能

目的:解释平顶猴成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的原因.方法:参考人TRIM5α基因的结构和序列合成引物,以平顶猴DNA 为模板,分别扩增其TRIM5α基因编码序列的所有外显子.利用生物学软件分析获得的编码序列,分析在已经明确与TRIM5α抗病毒功能密切相关的几个位点上是否发生可能影响其功能的突变.结果:在平顶猴基因组上CypA基因融合到TRIM5α基因第八外显子的下游,融合方式与在鹰猴中发现的CypA与TRIM5α的融合方式完全不同.恒河猴TRIM5α基因具有限制HIV-1复制的功能,第332位脯氨酸对其抗病毒功能非常重要,但在平顶猴的TRIM5α上,该氨基酸突变成谷氨酰胺;第335位以后8个氨基酸对恒河猴TRIM5α抗病毒功能也有重要影响,但在平顶猴的TRIM5α上,与其对应的氨基酸片段不仅缺失了两个氨基酸,还有两个氨基酸发生突变,附近区域还有另外两个发生突变.在平顶猴TRIM5α基因的Coiled-Coil结构域插入了13个氨基酸,但没有影响到编码框.结论:在平顶猴的基因组上CypA与TRIM5α的融合以及平顶猴TRIM5α基因抗病毒功能关键位点上的氨基酸突变可能影响其抗病毒功能,是其成为唯一能够被HIV-1感染的旧大陆猴以及在被SIV感染时出现较其他旧大陆猴严重临床症状的重要原因.

HIV-1核衣壳蛋白NCp7抑制剂体外筛选方法的建立

目的 表达HIV-1核衣壳蛋白(nucleocapside protein p7,NCp7),并建立抑制剂筛选方法.方法 从pBRU2/ADP202质粒经PCR得到HIV-1 NCp7编码序列,克隆到pet28a 质粒中构建HIV-1 NCp7表达载体.阳性克隆转染E.coli BL21 DE3,以IPTG诱导,细胞裂解液经Q Sepharose H.P和SP Sepharose H.P纯化后纯度达到90%以上.将具有锌离子逐出活性的H2O2和2,2'-联硫基二吡啶(2,2'-dithiodipyridine,AT-2)与NCp7作用,用锌离子特异的荧光染料检测.用该方法检测KIZ-CM系列化合物.结果 可以检测H2O2和AT-2的锌离子逐出活性,经该方法筛选,KIZ-CM 10,18,19等化合物具有一定的锌离子逐出活性.结论 在国内首次建立了HIV-1 NCp7锌离子逐出方法,该方法可以用于NCp7抑制剂的筛选.

APOBEC3G抗HIV-1作用机制研究进展

APOBEC3G是细胞内新的广谱抗病毒蛋白.它具有胞苷脱氨酶活性,能使病毒负链DNA产生dC→dU高发突变,造成正链DNA G→A突变,使得病毒DNA变成无功能或降解.APO-BEC3G具有广泛的生物学功能,可以限制HIV-1等病毒复制,但HIV-1病毒感染因子Vif能拮抗APOBEC3G抑制病毒活性作用.本文简要综述了APOBEC3G抑制病毒HIV-1作用机制的最新进展.