Isolation, characterization and discovery of new alleles of sHsp genes in durum wheat (Triticum durum Desf.)

Gli organismi vegetali mostrano una notevole capacità di adattamento alle condizioni di stress e lo studio delle componenti molecolari alla base dell'adattamento in colture cerealicole di interesse alimentare, come il frumento, è di particolare interesse per lo studio di varietà che consentano una buona produzione con basso input anche in condizioni ambientali non ottimali. L'esposizione delle colture cerealicole a stress termico durante determinate fasi del ciclo vitale influisce negativamente sulla resa e sulla qualità, a questo fine è necessario chiarire le basi genetiche e molecolari della termotolleranza per identificare geni e alleli vantaggiosi da impiegare in programmi di incrocio volti al miglioramento genetico. Numerosi studi dimostrano il coinvolgimento delle sHSP a localizzazione cloroplastica (in frumento sHSP26) nel meccanismo di acquisizione della termotolleranza e la loro interazione con diverse componenti del fotosistema II (PSII) che determinerebbe un’azione protettiva in condizioni di stress termico e altri tipi di stress. Lo scopo del progetto è quello di caratterizzare in frumento duro nuove varianti alleliche correlate alla tolleranza a stress termico mediate l'utilizzo del TILLING (Target Induced Local Lesion In Genome), un approccio di genetica inversa che prevede la mutagenesi e l'identificazione delle mutazioni indotte in siti di interesse. Durante la tesi sono state isolate e caratterizzate 3 sequenze geniche complete per smallHsp26 denominate TdHsp26-A1; TdHsp26-A2; TdHsp26-B1 e un putativo pseudogene denominato TdHsp26-A3. I geni isolati sono stati usati come target in analisi di TILLING in due popolazioni di frumento duro mutagenizzate con EMS (EtilMetanoSulfonato). Nel nostro studio sono stati impiegati due differenti approcci di TILLING: un approccio di TILLING classico mediante screening con High Resolution Melting (HRM) e un approccio innovativo che sfrutta un database di TILLING recentemente sviluppato. La popolazione di mutanti cv. Kronos è stata analizzata per la presenza di mutazioni in tutti e tre i geni individuati mediante ricerca online nel database di TILLING, il quale sfrutta la tecnica dell’exome capture sulla popolazione di TILLING seguito da sequenziamento ad alta processività. Attraverso questa tecnica sono state individuate, nella popolazione mutagenizzata di frumento duro cv. Kronos, 36 linee recanti mutazioni missenso. Contemporaneamente lo screening con HRM, effettuato su 960 genotipi della libreria di TILLING di frumento duro cv. Cham1 ha consentito di individuare mutazioni in una regione di 211bp di interesse funzionale del gene TdHsp26-B1, tra le quali 3 linee mutanti recanti mutazioni missenso in omozigosi. Alcune mutazioni missenso individuate sui due geni TdHsp26-A1 e TdHsp26-B1 sono state confermate in vivo nelle piante delle rispettive linee mutanti generando marcatori codominanti KASP (Kompetitive Allele Specific PCR) con cui è stato possibile verificare anche il grado di zigosità di tali mutazioni. Al fine di ridurre il numero di mutazioni non desiderate nelle linee risultate più interessanti, è stato eseguito il re-incrocio dei mutanti con i relativi parentali wild type ed inoltre sono stati generati alcuni doppi mutanti che consentiranno di comprendere meglio i meccanismi molecolari presieduti da questa classe genica. Gli individui F1 degli incroci sono stati poi genotipizzati con i medesimi marcatori KASP specifici per la mutazione di interesse per verificare la buona riuscita dell’incrocio. Questo approccio ha permesso di individuare ed implementare risorse genetiche utili ad intraprendere studi funzionali relativi al ruolo di smallHSP plastidiche implicate nella acquisizione di termotolleranza in frumento duro e di generare marcatori potenzialmente utili in futuri programmi di breeding.

Investigation of healthy and infected newborn saliva: the role of proteins and lipids as potential inflammatory diagnostic tools

We have carried out a discovery proteomics investigation aimed at identifying disease biomarkers present in saliva, and, more specifically, early biomarkers of inflammation. The proteomic characterization of saliva is possible due to the straightforward and non-invasive sample collection that allows repetitive analyses for pharmacokinetic studies. These advantages are particularly relevant in the case of newborn patients. The study was carried out with samples collected during the first 48 hours of life of the newborns according to an approved Ethic Committee procedure. In particular, the salivary samples were collected from healthy and infected (n=1) newborns. Proteins were extracted through cycles of sonication, precipitated in ice cold acetone, resuspended and resolved by 2D-electrophoresis. MALDI TOF/TOF mass spectrometry analysis was performed for each spot obtaining the proteins’ identifications. Then we compared healthy newborn salivary proteome and an infected newborn salivary proteome in order to investigate proteins differently expressed in inflammatory condition. In particular the protein alpha-1-antitrypsin (A1AT), correlated with inflammation, was detected differently expressed in the infected newborn saliva. Therefore, in the second part of the project we aimed to develop a robust LC-MS based method that identifies and quantifies this inflammatory protein within saliva that might represent the first relevant step to diagnose a condition of inflammation with a no-invasive assay. The same LC-MS method is also useful to investigate the presence of the F allelic variant of the A1AT in biological samples, which is correlated with the onset of pulmonary diseases. In the last part of the work we analysed newborn saliva samples in order to investigate how phospholipids and mediators of inflammation (eicosanoids) are subject to variations under inflammatory conditions and a trend was observed in lysophosphatidylcholines composition according to the inflammatory conditions.