Determinants of biological activity of nanomaterials in innate immunity cells: the role of aspect ratio, environmental contaminants and protein corona

As defined by the European Union, “ ’Nanomaterial’ (NM) means a natural, incidental or manufactured material containing particles, in an unbound state or as an aggregate or agglomerate, where, for 50 % or more of the particles in the number size distribution, one or more external dimensions is in the size range 1 nm-100 nm ” (2011/696/UE). Given their peculiar physico-chemical features, nanostructured materials are largely used in many industrial fields (e.g. cosmetics, electronics, agriculture, biomedical) and their applications have astonishingly increased in the last fifteen years. Nanostructured materials are endowed with very large specific surface area that, besides making them very useful in many industrial processes, renders them very reactive towards the biological systems and, hence, potentially endowed with significant hazard for human health. For these reasons, in recent years, many studies have been focused on the identification of toxic properties of nanostructured materials, investigating, in particular, the mechanisms behind their toxic effects as well as their determinants of toxicity. This thesis investigates two types of nanostructured TiO2 materials, TiO2 nanoparticles (NP), which are yearly produced in tonnage quantities, and TiO2 nanofibres (NF), a relatively novel nanomaterial. Moreover, several preparations of MultiWalled Carbon Nanotubes (MWCNT), another nanomaterial widely present in many products, are also investigated.- Although many in vitro and in vivo studies have characterized the toxic properties of these materials, the identification of their determinants of toxicity is still incomplete. The aim of this thesis is to identify the structural determinants of toxicity, using several in vitro models. Specific fields of investigation have been a) the role of shape and the aspect ratio in the determination of biological effects of TiO2 nanofibres of different length; b) the synergistic effect of LPS and TiO2 NP on the expression of inflammatory markers and the role played therein by TLR-4; c) the role of functionalization and agglomeration in the biological effects of MWCNT. As far as biological effects elicited by TiO2 NF are concerned, the first part of the thesis demonstrates that long TiO2 nanofibres caused frustrated phagocytosis, cytotoxicity, hemolysis, oxidative stress and epithelial barrier perturbation. All these effects were mitigated by fibre shortening through ball-milling. However, short TiO2 NF exhibited enhanced ability to activate acute pro-inflammatory effects in macrophages, an effect dependent on phagocytosis. Therefore, aspect ratio reduction mitigated toxic effects, while enhanced macrophage activation, likely rendering the NF more prone to phagocytosis. These results suggest that, under in vivo conditions, short NF will be associated with acute inflammatory reaction, but will undergo a relatively rapid clearance, while long NF, although associated with a relatively smaller acute activation of innate immunity cells, are not expected to be removed efficiently and, therefore, may be associated to chronic inflammatory responses. As far as the relationship between the effects of TiO2 NP and LPS, investigated in the second part of the thesis, are concerned, TiO2 NP markedly enhanced macrophage activation by LPS through a TLR-4-dependent intracellular pathway. The adsorption of LPS onto the surface of TiO2 NP led to the formation of a specific bio-corona, suggesting that, when bound to TiO2 NP, LPS exerts a much more powerful pro-inflammatory effect. These data suggest that the inflammatory changes observed upon exposure to TiO2 NP may be due, at least in part, to their capability to bind LPS and, possibly, other TLR agonists, thus enhancing their biological activities. Finally, the last part of the thesis demonstrates that surface functionalization of MWCNT with amino or carboxylic groups mitigates the toxic effects of MWCNT in terms of macrophage activation and capability to perturb epithelial barriers. Interestingly, surface chemistry (in particular surface charge) influenced the protein adsorption onto the MWCNT surface, allowing to the formation of different protein coronae and the tendency to form agglomerates of different size. In particular functionalization a) changed the amount and the type of proteins adsorbed to MWCNT and b) enhanced the tendency of MWCNT to form large agglomerates. These data suggest that the different biological behavior of functionalized and pristine MWCNT may be due, at least in part, to the different tendency to form large agglomerates, which is significantly influenced by their different capability to interact with proteins contained in biological fluids. All together, these data demonstrate that the interaction between physico-chemical properties of nanostructured materials and the environment (cells + biological fluids) in which these materials are present is of pivotal importance for the understanding of the biological effects of NM. In particular, bio-persistence and the capability to elicit an effective inflammatory response are attributable to the interaction between NM and macrophages. However, the interaction NM-cells is heavily influenced by the formation at the nano-bio interface of specific bio-coronae that confer a novel biological identity to the nanostructured materials, setting the basis for their specific biological activities.

Interazione di nanoparticelle metalliche con menbrane biologiche: risultati di studi in vitro su cute, mucosa del cavo orale e meningi ed implicazioni per la salute

L’utilizzo di nanomateriali, ovvero una nuova classe di sostanze composte da particelle ultrafini con dimensioni comprese fra 1 e 100 nm (American Society for Testing Materials - ASTM), è in costante aumento a livello globale. La particolarità di tali sostanze è rappresentata da un alto rapporto tra la superficie e il volume delle particelle, che determina caratteristiche chimico-fisiche completamente differenti rispetto alle omologhe macrosostanze di riferimento. Tali caratteristiche sono tali da imporre una loro classificazione come nuovi agenti chimici (Royal Society & Royal Academy of Engineering report 2004). Gli impieghi attuali dei nanomateriali risultano in continua evoluzione, spaziando in diversi ambiti, dall’industria farmaceutica e cosmetica, all’industria tessile, elettronica, aerospaziale ed informatica. Diversi sono anche gli impieghi in campo biomedico; tra questi la diagnostica e la farmacoterapia. È quindi prevedibile che in futuro una quota sempre maggiore di lavoratori e consumatori risulteranno esposti a tali sostanze. Allo stato attuale non vi è una completa conoscenza degli effetti tossicologici ed ambientali di queste sostanze, pertanto, al fine di un loro utilizzo in totale sicurezza, risulta necessario capirne meglio l’impatto sulla salute, le vie di penetrazione nel corpo umano e il rischio per i lavoratori conseguente al loro utilizzo o lavorazione. La cute rappresenta la prima barriera nei confronti delle sostanze tossiche che possono entrare in contatto con l’organismo umano. Successivamente agli anni ‘60, quando si riteneva che la cute rappresentasse una barriera totalmente impermeabile, è stato dimostrato come essa presenti differenti gradi di permeabilità nei confronti di alcuni xenobiotici, dipendente dalle caratteristiche delle sostanze in esame, dal sito anatomico di penetrazione, dal grado di integrità della barriera stessa e dall’eventuale presenza di patologie della cute. La mucosa del cavo orale funge da primo filtro nei confronti delle sostanze che entrano in contatto con il tratto digestivo e può venir coinvolta in contaminazioni di superficie determinate da esposizioni occupazionali e/o ambientali. È noto che, rispetto alla cute, presenti una permeabilità all’acqua quattro volte maggiore, e, per tale motivo, è stata studiata come via di somministrazione di farmaci, ma, ad oggi, pochi sono gli studi che ne hanno valutato le caratteristiche di permeazione nei confronti delle nanoparticelle (NPs). Una terza importante barriera biologica è quella che ricopre il sistema nervoso centrale, essa è rappresentata da tre foglietti di tessuto connettivo, che assieme costituiscono le meningi. Questi tre foglietti rivestono completamente l’encefalo permettendone un isolamento, tradizionalmente ritenuto completo, nei confronti degli xenobiotici. L’unica via di assorbimento diretto, in questo contesto, è rappresentata dalla via intranasale. Essa permette un passaggio diretto di sostanze dall’epitelio olfattivo all’encefalo, eludendo la selettiva barriera emato-encefalica. Negli ultimi anni la letteratura scientifica si è arricchita di studi che hanno indagato le caratteristiche di assorbimento di farmaci attraverso questa via, ma pochissimi sono gli studi che hanno indagato la possibile penetrazione di nanoparticelle attraverso questa via, e nessuno, in particolar modo, ha indagato le caratteristiche di permeazione delle meningi. L’attività di ricerca svolta nell’ambito del presente dottorato ha avuto per finalità l’indagine delle caratteristiche di permeabilità e di assorbimento della cute, della mucosa del cavo orale e delle meningi nei confronti di alcune nanoparticelle, scelte fra quelle più rappresentative in relazione alla diffusione d’utilizzo a livello globale. I risultati degli esperimenti condotti hanno dimostrato, in vitro, che l’esposizione cutanea a Pt, Rh, Co3O4 e Ni NPs determinano permeazione in tracce dei medesimi metalli attraverso la cute, mentre per le TiO2 NPs tale permeazione non è stata dimostrata. È stato riscontrato, inoltre, che la mucosa del cavo orale e le meningi sono permeabili nei confronti dell’Ag in forma nanoparticellare.

Spectroscopic analysis of terrestrial analogues for the interpretation of surface composition of rocky bodies in the solar system. Effects of mineral mixing and particle size. Applications to moon, mars and implications for mercury.

Among the Solar System’s bodies, Moon, Mercury and Mars are at present, or have been in the recent years, object of space missions aimed, among other topics, also at improving our knowledge about surface composition. Between the techniques to detect planet’s mineralogical composition, both from remote and close range platforms, visible and near-infrared reflectance (VNIR) spectroscopy is a powerful tool, because crystal field absorption bands are related to particular transitional metals in well-defined crystal structures, e.g., Fe2+ in M1 and M2 sites of olivine or pyroxene (Burns, 1993). Thanks to the improvements in the spectrometers onboard the recent missions, a more detailed interpretation of the planetary surfaces can now be delineated. However, quantitative interpretation of planetary surface mineralogy could not always be a simple task. In fact, several factors such as the mineral chemistry, the presence of different minerals that absorb in a narrow spectral range, the regolith with a variable particle size range, the space weathering, the atmosphere composition etc., act in unpredictable ways on the reflectance spectra on a planetary surface (Serventi et al., 2014). One method for the interpretation of reflectance spectra of unknown materials involves the study of a number of spectra acquired in the laboratory under different conditions, such as different mineral abundances or different particle sizes, in order to derive empirical trends. This is the methodology that has been followed in this PhD thesis: the single factors previously listed have been analyzed, creating, in the laboratory, a set of terrestrial analogues with well-defined composition and size. The aim of this work is to provide new tools and criteria to improve the knowledge of the composition of planetary surfaces. In particular, mixtures composed with different content and chemistry of plagioclase and mafic minerals have been spectroscopically analyzed at different particle sizes and with different mineral relative percentages. The reflectance spectra of each mixture have been analyzed both qualitatively (using the software ORIGIN®) and quantitatively applying the Modified Gaussian Model (MGM, Sunshine et al., 1990) algorithm. In particular, the spectral parameter variations of each absorption band have been evaluated versus the volumetric FeO% content in the PL phase and versus the PL modal abundance. This delineated calibration curves of composition vs. spectral parameters and allow implementation of spectral libraries. Furthermore, the trends derived from terrestrial analogues here analyzed and from analogues in the literature have been applied for the interpretation of hyperspectral images of both plagioclase-rich (Moon) and plagioclase-poor (Mars) bodies.

Nanotossicologia dei quantum dot di CdS in linee cellulari umane

Le nanotecnologie sono un settore emergente in rapida crescita, come dimostra l'esplosione del mercato dei prodotti ad esso collegati. I quantum dot di cadmio solfuro (CdS QD) sono ampiamente utilizzati per la produzione di materiali semiconduttori e dispositivi optoelettronici; tuttavia, non sono ancora completamente chiari gli effetti di questi nanomateriali sulla salute umana. Questo lavoro di dottorato si pone l'obbiettivo di definire il potenziale citotossico e genotossico dei CdS QD in linee cellulari umane e definirne il meccanismo implicato. A questo scopo, essendo il fegato uno dei principali organi di accumulo del cadmio e dei nanomateriali a base di cadmio, è stata utilizzata la linea cellulare HepG2 derivante da un epatocarcinoma umano. È stato evidenziato, in seguito all'assorbimento, da parte delle cellule, dei CdS QD, un effetto citotossico, con conseguente modulazione dell'espressione genica di una serie di geni coinvolti sia nei processi di rescue (autofagia, risposta allo stress) sia in quelli di morte cellulare programmata. È stato, inoltre, dimostrata l'assenza di un rilevante effetto genotossico dipendente da questi nanomateriali. Infine, è stato osservato che cellule esposte ai CdS QD presentano mitocondri con un potenziale di membrana alterato, con conseguente alterazione della funzionalità di tale organello, pur conservando l'integrità del DNA mitocondriale.

Drug combination: pharmaceutical technologies applied to the manufacturing of combined dosage forms for oral administration

Lo scopo di questa ricerca di dottorato è stato lo studio di una forma di dosaggio flessibile e personalizzabile, indirizzata alle necessità individuali di ogni paziente, per il trattamento dell’iperplasia prostatica benigna. La terapia proposta prevede l’utilizzo di due farmaci, un alfa bloccante (farmaco A) e un inibitore delle 5- fosfodiesterasi (farmaco B) e, somministrati in una singola forma di dosaggio contenenti differenti dosi e combinazioni dei due farmaci. Lo sviluppo di un sistema di rilascio per la somministrazione orale di farmaco A e farmaco B è stato realizzato grazie alla tecnologia Dome Matrix. La tecnologia si basa sull’assemblaggio di moduli utilizzati come elementi di controllo del rilascio. L’assemblaggio dei moduli può essere ottenuto attraverso diverse configurazioni. Sono stati quindi realizzati sistemi assemblati in grado di galleggiare sul contenuto gastrico; la prolungata permanenza della forma farmaceutica nello stomaco favorisce la solubilizzazione dei due principi attivi che quindi potrebbero raggiungere il sito di assorbimento nel primo tratto intestinale già in dispersione molecolare, condizione ideale per essere assorbiti. La prima parte della ricerca è stata focalizzata sulla realizzazione di un sistema assemblato a rilascio modificato di farmaco A. Moduli contenenti diversi dosaggi di farmaco sono stati assemblati in varie configurazioni e dosi differenti per ottenere una forma di dosaggio flessibile, adattabile alle esigenze terapeutiche del paziente. La seconda parte del lavoro di tesi ha riguardato la realizzazione di un sistema assemblato, contenente entrambi i farmaci in associazione. L’ultima parte della ricerca è stata svolta presso la “University of Texas at Austin” sotto la supervisione del Professor Nicholas Peppas. Il lavoro svolto è stato focalizzato sullo studio delle caratteristiche di rigonfiamento dei singoli moduli di farmaco e dei loro sistemi assemblati; il comportamento di tali sistemi è stato investigato anche grazie all’utilizzo della tecnica di tomografia computerizzata a raggi X.