Biomarcatori per il monitoraggio biologico di soggetti esposti ad agenti cancerogeni per il polmone

Riassunto I biomarcatori o “marcatori biologici” svolgono un ruolo fondamentale nel monitoraggio biologico. In questo lavoro ci siamo soffermati sullo studio di biomarcatori di effetto e di esposizione a xenobiotici ambientali. Nel primo caso abbiamo valutato i micro RNA (miRNA) da utilizzare per la diagnosi precoce del tumore al polmone in matrici di facile accesso, quale il CAE e il plasma, utilizzando il miRNA-21, oncogeno, e il miRNA-486, oncosoppressore. I risultati evidenziano una loro capacità di distinguere correttamente i soggetti con tumore polmonare dai soggetti sani, ipotizzando un loro utilizzo a scopo diagnostico. Nella seconda parte del lavoro di tesi sono stati studiati i biomarcatori di esposizione a benzene per valutare gli effetti dell’esposizione a concentrazioni ambientali su bambini residenti in città e a diverso livello di urbanizzazione. Lo studio ha evidenziato una correlazione dose-effetto fra le concentrazioni di benzene e dei suoi metaboliti urinari e un danno ossidativo a livello degli acidi nucleici. Tuttavia, le concentrazioni di benzene urinario non sono influenzate dal grado di industrializzazione, a differenza dell’S-PMA e degli indicatori di stress ossidativo (8-oxodGuo e 8-oxoGuo) che sembrano risentire sia della residenza che del momento del campionamento. Infine abbiamo ricercato possibili biomarcatori di esposizione a vinilcicloesene (VCH), sottoprodotto industriale nella polimerizzazione del 1,3-butadiene, poiché non sono ancora stati proposti BEI di riferimento nonostante i bassi valori di TLV-TWA (0.1 ppm) proposti dall’ACGIH. Nella prima fase del lavoro abbiamo studiato i meccanismi di tossicità del VCH tramite modelli in vitro, testando varie linee cellulari. I risultati evidenziano come la dose reale di VCH sia di molto inferiore a quella nominale per effetto dell’evaporazione. Inoltre, nelle linee cellulari più sensibili si sono evidenziati effetti citostatici, con alterazioni del ciclo cellulare, a differenza dell’esposizione agli epossidi del VCH, il VCD e l’1,2-VCHME, che determinano lisi cellulare con IC50 di 3 ordini di grandezza inferiori a quelli del VCH. La quantificazione dei metaboliti di I fase e di II fase del VCH nelle linee cellulari epatiche ha evidenziato concentrazioni di circa 1000 volte inferiori a quelle del VCH confermando come la sua tossicità sia principalmente dovuta alla produzione degli intermedi epossidici. La trasformazione nei metaboliti di II fase conferma inoltre l’effetto detossificante del metabolismo. La trasferibilità dei risultati ottenuti in vitro su sistemi in vivo fornirà le basi per poter identificare possibili metaboliti da proporre per il monitoraggio biologico di lavoratori esposti a VCH. PAROLE CHIAVE: biomarcatori di effetto e di esposizione, tumore al polmone, miRNA, benzene, vinilcicloesene.

Reformulation of a thermostable broadly protective recombinant vaccine against human papilloma virus

The causal relationship between Human Papilloma Virus (HPV) infection and cervical cancer has motivated the development, and further improvement, of prophylactic vaccines against this virus. 70% of cervical cancers, 80% of which in low-resources countries, are associated to HPV16 and HPV18 infection, with 13 additional HPV types, classified as high-risk, responsible for the remaining 30% of tumors. Current vaccines, Cervarix® (GlaxoSmithKline) and Gardasil®(Merk), are based on virus-like particles (VLP) obtained by self-assembly of the major capsid protein L1. Despite their undisputable immunogenicity and safety, the fact that protection afforded by these vaccines is largely limited to the cognate serotypes included in the vaccine (HPV 16 and 18, plus five additional viral types incorporated into a newly licensed nonavalent vaccine) along with high production costs and reduced thermal stability, are pushing the development of 2nd generation HPV vaccines based on minor capsid protein L2. The increase in protection broadness afforded by the use of L2 cross-neutralizing epitopes, plus a marked reduction of production costs due to bacterial expression of the antigens and a considerable increase in thermal stability could strongly enhance vaccine distribution and usage in low-resource countries. Previous studies from our group identified three tandem repeats of the L2 aa. 20-38 peptide as a strongly immunogenic epitope if exposed on the scaffold protein thioredoxin (Trx). The aim of this thesis work is the improvement of the Trx-L2 vaccine formulation with regard to cross-protection and thermostability, in order to identify an antigen suitable for a phase I clinical trial. By testing Trx from different microorganisms, we selected P. furiosus thioredoxin (PfTrx) as the optimal scaffold because of its sustained peptide epitope constraining capacity and striking thermal stability (24 hours at 100°C). Alternative production systems, such as secretory Trx-L2 expression in the yeast P. pastoris, have also been set-up and evaluated as possible means to further increase production yields, with a concomitant reduction of production costs. Limitations in immune-responsiveness caused by MHC class II polymorphisms –as observed, for example, in different mouse strains- have been overcome by introducing promiscuous T-helper (Th) epitopes, e.g., PADRE (Pan DR Epitope), at both ends of PfTrx. This allowed us to obtain fairly strong immune responses even in mice (C57BL/6) normally unresponsive to the basic Trx-L2 vaccine. Cross-protection was not increased, however. I thus designed, produced and tested a novel multi-epitope formulation consisting of 8 and 11 L2(20-38) epitopes derived from different HPV types, tandemly joined into a single thioredoxin molecule (“concatemers”). To try to further increase immunogenicity, I also fused our 8X and 11X PfTrx-L2 concatemers to the N-terminus of an engineered complement-binding protein (C4bp), capable to spontaneously assemble into ordered hepatmeric structures, previously validated as a molecular adjuvant. Fusion to C4bp indeed improved antigen presentation, with a fairly significant increase in both immunogenicity and cross-protection. Another important issue I addressed, is the reduction of vaccine doses/treatment, which can be achieved by increasing immunogenicity, while also allowing for a delayed release of the antigen. I obtained preliminary, yet quite encouraging results in this direction with the use of a novel, solid-phase vaccine formulation, consisting of the basic PfTrx-L2 vaccine and its C4bp fusion derivative adsorbed to mesoporus silica-rods (MSR).