Innovative analytical strategies for the development of sensor devices and mass spectrometry methods

Il lavoro presentato in questa tesi di Dottorato è incentrato sullo sviluppo di strategie analitiche innovative basate sulla sensoristica e su tecniche di spettrometria di massa in ambito biologico e della sicurezza alimentare. Il primo capitolo tratta lo studio di aspetti metodologici ed applicativi di procedure sensoristiche per l’identificazione e la determinazione di biomarkers associati alla malattia celiaca. In tale ambito, sono stati sviluppati due immunosensori, uno a trasduzione piezoelettrica e uno a trasduzione amperometrica, per la rivelazione di anticorpi anti-transglutaminasi tissutale associati a questa malattia. L’innovazione di questi dispositivi riguarda l’immobilizzazione dell’enzima tTG nella conformazione aperta (Open-tTG), che è stato dimostrato essere quella principalmente coinvolta nella patogenesi. Sulla base dei risultati ottenuti, entrambi i sistemi sviluppati si sono dimostrati una valida alternativa ai test di screening attualmente in uso per la diagnosi della celiachia. Rimanendo sempre nel contesto della malattia celiaca, ulteriore ricerca oggetto di questa tesi di Dottorato, ha riguardato lo sviluppo di metodi affidabili per il controllo di prodotti “gluten-free”. Il secondo capitolo tratta lo sviluppo di un metodo di spettrometria di massa e di un immunosensore competitivo per la rivelazione di prolammine in alimenti “gluten-free”. E’ stato sviluppato un metodo LC-ESI-MS/MS basato su un’analisi target con modalità di acquisizione del segnale selected reaction monitoring per l’identificazione di glutine in diversi cereali potenzialmente tossici per i celiaci. Inoltre ci si è focalizzati su un immunosensore competitivo per la rivelazione di gliadina, come metodo di screening rapido di farine. Entrambi i sistemi sono stati ottimizzati impiegando miscele di farina di riso addizionata di gliadina, avenine, ordeine e secaline nel caso del sistema LC-MS/MS e con sola gliadina nel caso del sensore. Infine i sistemi analitici sono stati validati analizzando sia materie prime (farine) che alimenti (biscotti, pasta, pane, etc.). L’approccio sviluppato in spettrometria di massa apre la strada alla possibilità di sviluppare un test di screening multiplo per la valutazione della sicurezza di prodotti dichiarati “gluten-free”, mentre ulteriori studi dovranno essere svolti per ricercare condizioni di estrazione compatibili con l’immunosaggio competitivo, per ora applicabile solo all’analisi di farine estratte con etanolo. Terzo capitolo di questa tesi riguarda lo sviluppo di nuovi metodi per la rivelazione di HPV, Chlamydia e Gonorrhoeae in fluidi biologici. Si è scelto un substrato costituito da strips di carta in quanto possono costituire una valida piattaforma di rivelazione, offrendo vantaggi grazie al basso costo, alla possibilità di generare dispositivi portatili e di poter visualizzare il risultato visivamente senza la necessità di strumentazioni. La metodologia sviluppata è molto semplice, non prevede l’uso di strumentazione complessa e si basa sull’uso della isothermal rolling-circle amplification per l’amplificazione del target. Inoltre, di fondamentale importanza, è l’utilizzo di nanoparticelle colorate che, essendo state funzionalizzate con una sequenza di DNA complementare al target amplificato derivante dalla RCA, ne permettono la rivelazione a occhio nudo mediante l’uso di filtri di carta. Queste strips sono state testate su campioni reali permettendo una discriminazione tra campioni positivi e negativi in tempi rapidi (10-15 minuti), aprendo una nuova via verso nuovi test altamente competitivi con quelli attualmente sul mercato.

Multisensorial obstacles detection and classification for ADAS and autonomous driving

A reliable perception of the real world is a key-feature for an autonomous vehicle and the Advanced Driver Assistance Systems (ADAS). Obstacles detection (OD) is one of the main components for the correct reconstruction of the dynamic world. Historical approaches based on stereo vision and other 3D perception technologies (e.g. LIDAR) have been adapted to the ADAS first and autonomous ground vehicles, after, providing excellent results. The obstacles detection is a very broad field and this domain counts a lot of works in the last years. In academic research, it has been clearly established the essential role of these systems to realize active safety systems for accident prevention, reflecting also the innovative systems introduced by industry. These systems need to accurately assess situational criticalities and simultaneously assess awareness of these criticalities by the driver; it requires that the obstacles detection algorithms must be reliable and accurate, providing: a real-time output, a stable and robust representation of the environment and an estimation independent from lighting and weather conditions. Initial systems relied on only one exteroceptive sensor (e.g. radar or laser for ACC and camera for LDW) in addition to proprioceptive sensors such as wheel speed and yaw rate sensors. But, current systems, such as ACC operating at the entire speed range or autonomous braking for collision avoidance, require the use of multiple sensors since individually they can not meet these requirements. It has led the community to move towards the use of a combination of them in order to exploit the benefits of each one. Pedestrians and vehicles detection are ones of the major thrusts in situational criticalities assessment, still remaining an active area of research. ADASs are the most prominent use case of pedestrians and vehicles detection. Vehicles should be equipped with sensing capabilities able to detect and act on objects in dangerous situations, where the driver would not be able to avoid a collision. A full ADAS or autonomous vehicle, with regard to pedestrians and vehicles, would not only include detection but also tracking, orientation, intent analysis, and collision prediction. The system detects obstacles using a probabilistic occupancy grid built from a multi-resolution disparity map. Obstacles classification is based on an AdaBoost SoftCascade trained on Aggregate Channel Features. A final stage of tracking and fusion guarantees stability and robustness to the result.