Identification and characterization of periplasmic proteins implicated in the adaptation of Helicobacter pylori to the human gastric niche

Helicobacter pylori è un batterio Gram-negativo in grado di colonizzare la mucosa gastrica umana e persistere per l'intero arco della vita dell'ospite. E' associato a patologie gastrointestinali, quali gastrite cronica, ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. Si tratta di uno dei patogeni più diffusi, presente in circa metà della popolazione mondiale, e il solo che si è adattato a vivere nell'ambiente ostile dello stomaco umano. Molteplici sono i fattori di virulenza che permettono al batterio la colonizzazione della nicchia gastrica e contribuiscono, anche attraverso l' induzione di una risposta infiammatoria, a profonde modificazioni dell' omeostasi gastrica. Queste ultime si associano, ad esempio, all'iperproduzione di fattori proinfiammatori, ad alterazioni sia della regolazione della secrezione acida gastrica sia del ciclo cellulare e della morte cellulare programmata (apoptosi) delle cellule epiteliali gastriche, a disordini nel metabolismo del ferro e a carenze di elementi essenziali. Studi sulla diversità genetica di H. pylori osservata in ceppi isolati da varie regioni del mondo, dimostrano che tale batterio ha avuto una coevoluzione col genere umano attraverso la storia, ed è verosimile che H. pylori sia stato un costituente del microbiota gastrico per almeno 50.000 anni. Scopo della tesi è stato quello di identificare e caratterizzare proteine importanti per la colonizzazione e l'adattamento di H. pylori alla nicchia gastrica. In particolare gli sforzi si sono concentrati su due proteine periplasmatiche, la prima coinvolta nella difesa antiossidante (l'enzima catalasi-like, HP0485), e la seconda nel trasporto di nutrienti presenti nell'ambiente dello stomaco all'interno della cellula (la componente solubile di un ABC transporter, HP0298). La strategia utilizzata prevede un'analisi bioinformatica preliminare, l'ottenimento del gene per amplificazione, mediante PCR, dal genoma dell'organismo, la costruzione di un vettore per il clonaggio, l'espressione eterologa in E. coli e la successiva purificazione. La proteina così ottenuta viene caratterizzata mediante diverse tecniche, quali spettroscopia UV, dicroismo circolare, gel filtrazione analitica, spettrometria di massa. Il capitolo 1 contiene un'introduzione generale sul batterio, il capitolo 2 e il capitolo 3 descrivono gli studi relativi alle due proteine e sono entrambi suddivisi in un abstract iniziale, un'introduzione, la presentazione dei risultati, la discussione di questi ultimi, i materiali e i metodi utilizzati. La catalasi-like (HP0485) è una proteina periplasmatica con struttura monomerica, appartenente ad una famiglia di enzimi a funzione per la maggior parte sconosciuta, ma evolutivamente correlati alla ben nota catalasi, attore fondamentale nella difesa di H. pylori, grazie alla sua azione specifica di rimozione dell'acqua ossigenata. HP0485, pur conservando il fold catalasico e il legame al cofattore eme, non può compiere la reazione di dismutazione dell'acqua ossigenata; possiede invece un'attività perossidasica ad ampio spettro, essendo in grado di accoppiare la riduzione del perossido di idrogeno all'ossidazione di diversi substrati. Come la catalasi, lavora ad alte concentrazioni di aqua ossigenata e non arriva a saturazione a concentrazioni molto elevate di questo substrato (200 mM); la velocità di reazione catalizzata rimane lineare anche a questi valori, aspetto che la differenzia dalle perossidasi che vengono in genere inattivate da concentrazioni di perossido di idrogeno superiori a 10-50 mM. Queste caratteristiche di versatilità e robustezza suggeriscono che la catalasi-like abbia un ruolo di scavenger dell'acqua ossigenata e probabilmente anche un'altra funzione connessa al suo secondo substrato, ossia l'ossidazione di composti nello spazio periplasmatico cellulare. Oltre alla caratterizzazione dell'attività è descritta anche la presenza di un ponte disolfuro, conservato nelle catalasi-like periplasmatiche, con un ruolo nell'assemblaggio dell'eme per ottenere un enzima attivo e funzionale. La proteina periplasmatica HP0298, componente di un sistema di trasporto ABC, è classificata come trasportatore di dipeptidi e appartiene a una famiglia di proteine in grado di legare diversi substrati, tra cui di- e oligopeptidi, nichel, eme, glutatione. Benchè tutte associate a trasportatori di membrana batterici, queste proteine presentano un dominio di legame al substrato che risulta essere conservato nei domini extracellulari di recettori specifici di mammifero e uomo. Un esempio sono i recettori ionotropici e metabotropici del sistema nervoso. Per caratterizzare questa proteina è stato messo a punto un protocollo di ligand-fishing accoppiato alla spettrometria di massa. La proteina purificata, avente un tag di istidine, è stata incubata con un estratto cellulare di H. pylori per poter interagire con il suo substrato specifico all'interno dell'ambiente naturale in cui avviene il legame. Il complesso proteina-ligando è stato poi purificato per cromatografia di affinità e analizzato mediante HPLC-MS. L'identificazione dei picchi differenziali tra campioni con la proteina e 5 campioni di controllo ha portato alla caratterizzazione di pentapeptidi particolarmente ricchi in aminoacidi idrofobici e con almeno un residuo carico negativamente. Considerando che H. pylori necessita di alcuni aminoacidi essenziali, per la maggior parte idrofobici, e che lo stomaco umano è particolarmente ricco di peptidi prodotti dalla digestione delle proteine introdotte con il cibo, il ruolo fisiologico di HP0298 potrebbe essere l'internalizzazione di peptidi, con caratteristiche specifiche di lunghezza e composizione, che sono naturalmente presenti nella nicchia gastrica.

Verso un luppolo italiano: analisi metabolomica e caratterizzazione fitochimica di ecotipi di Humulus lupulus L. del Nord Italia

La presente tesi di dottorato ha riguardato l'indagine fitochimica della biodiversità spontanea di Humulus lupulus L. in Emilia Romagna e la valutazione degli effetti del clima dell'Italia settentrionale sul metabolismo secondario di cultivar di luppolo. In particolare, lo studio ha previsto l'individuazione di ecotipi di luppolo provenienti da zone planiziali e collinari di'Emilia Romagna e Lombardia, la loro messa a dimora in un campo collezione appositamente allestito, e il monitoraggio della resa di campo e della produzione di metaboliti secondari di natura polare (acilfluoroglucinoli, flavonidi isoprenilati) e apolare (terpeni e sequiterpeni). Gli obiettivi primari sono stati la valutazione di entità da portare direttamente in coltivazione o da introdurre in percorsi di breeding del luppolo in Italia, oltre all'ottimizzazione di metodi innovativi per lo screening dell'intero germoplasma italiano. Per definire le caratteristiche fitochimiche dei coni di luppolo sono stati messi a punto metodi cromatografici HPLC-UV, HPLC-MS/MS e GC-MS e metodi spettroscopici 1H-NMR. Nel corso del triennio i metodi sono stati applicati a 10 cultivar e oltre 30 ecotipi , alcuni dei quali hanno fornito dati anche a conclusione dell'intero periodo di acclimatazione. Per tutti si è anche verificata la resilienza alle diverse condizioni climatiche incontrate Le analisi chimiche hanno permesso di individuare una sostanziale differenza tra gli ecotipi e le cultivar, con i primi che si caratterizzano per una produzione modesta di α-acidi e β-acidi e un profilo aromatico ricco di isomeri del selinene. Questo risultato può essere interessante per l’industria della birra nazionale e in particolare per il settore dei microbirrifici artigianali, in quanto i luppoli più pregiati sono proprio quelli con un basso contenuto di acidi amari e ricchi di oli essenziali che possano impartire alle birre prodotte note aromatiche particolari e legate al territorio. L’indagine agronomica monitorata su tre anni di produzione ha anche fatto emergere la resistenza degli ecotipi italiani al clima caldo e siccitoso e ha evidenziato invece come le cultivar estere abbiano limiti fisiologici a queste condizioni. Confrontando il profilo fitochimico delle cultivar coltivate in Italia con i prodotti acquistati nei paesi d’origine è emerso che il metabolismo secondario per alcune cultivar è particolarmente differente, come nel caso della cultivar Marynka, che rispetto agli standard commerciali ha prodotto in Italia coni ricchi di oli essenziali con alte quantità di trans-β-farnesene, cambiandone le caratteristiche da varietà amaricante ad aromatica. I risultati ottenuti dimostrano la fattibilità della coltivazione di Humulus lupulus L. sul territorio nazionale con ottime prospettive di produttività per gli ecotipi italiani. Inoltre da questi primi risultati è ora possibile intraprendere un programma di breeding per la creazione di nuove varietà, più resistenti al caldo e con le caratteristiche desiderate in base all’utilizzo del prodotto, sia per quanto riguarda l’industria della birra, sia la cosmetico-farmaceutica per la produzione di estratti.