Avaliação do papel do óxido nítrico no comprometimento da função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas em camundongos estimulados com sílica

Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico.

Efeito do tratamento com a proteína quimérica IL-13PE sobre a inflamação pulmonar induzida por partículas de sílica em camundongos

A interleucina 13 (IL-13) tem sido apontada como um dos principais mediadores em processos de ativação de fibroblastos e indução de fibrose pulmonar, sendo, portanto, considerada como um alvo terapêutico importante. A silicose é uma doença pulmonar inflamatória crônica, de caráter ocupacional, caracterizada por uma intensa resposta fibrótica e granulomatosa. Com base nestas observações, tivemos por objetivo investigar o potencial efeito da administração da imunotoxina IL-13-PE38QQR (IL-13PE) sobre o modelo de silicose em camundongos. Camundongos Swiss-Webster foram anestesiados e instilados intranasalmente com partículas de sílica (10 mg), sendo a administração da IL-13PE (200ng/dia) realizada por via intranasal, uma vez ao dia em dias alternados no período entre 21 a 27 dias após a provocação. Analisamos o componente inflamatório, a deposição de colágeno e a área de granuloma avaliados através de técnicas clássicas de histologia, incluindo coloração com H&E e Picrus-sirius, ou ainda a quantificação do conteúdo de colágeno por Sircol. Os componentes de matriz extracelular fibronectina e laminina foram avaliados através de imunohistoquímica. Citocinas e quimiocinas foram quantificadas por sistema de ELISA. As medidas de função pulmonar e resposta de hiperreatividade foram realizadas através do sistema de pletismografia de corpo inteiro invasiva. Verificamos que o tratamento curativo com a IL-13PE inibiu de forma acentuada o comprometimento da função pulmonar nos camundongos silicóticos, incluindo tanto aumento da resistência como da elastância, assim como a resposta de hiperratividade das vias aéreas ao agente broncoconstrictor metacolina. De forma coerente, os animais silicóticos quando submetidos ao tratamento com IL-13PE apresentaram marcada redução do componente inflamatório pulmonar e da resposta fibrótica, atestado pela diminuição na produção de colágeno, laminina e fibronectina e redução importante da área de granuloma. De forma semelhante, as citocinas (TNF-α e TGF-) e quimiocinas (MIP-1α, MIP-2, TARC, IP-10, MDC) detectadas em quantidade aumentada no pulmão de animais silicóticos foram reduzidas pelo tratamento com a IL-13PE. Em conclusão, nossos resultados mostram que a administração curativa da IL-13PE foi capaz de inibir os componentes inflamatórios e fibróticos da fase crônica do quadro silicótico em camundongos, o que se refletiu de forma clara na melhora da função pulmonar. Em conjunto, nossos achados indicam que a utilização da IL13PE parece constituir uma abordagem terapêutica extremamente promissora para aplicação em casos de doenças crônicas de natureza fibrótica como a silicose.

Influência da ck2 no processo de interação Leishmania donovani-macrófagos

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2α em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2α. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos.

Modulação redox da homeostase de células musculares lisas através de estimuladores do sistema NADPH oxidase

As doenças cardiovasculares representam a principal causa de morte nos países ocidentais. Dentre essas doenças, a aterosclerose é que mais se destaca, sendo caracterizada pelo acúmulo de células musculares lisas vasculares (CMLV). O efeito patológico das CMLV em resposta a diferentes estímulos pode acarretar em disfunções nestas células. É notável que a aterosclerose ocorra principalmente em vasos sinuosos onde ocorre um forte turbilhonamento do fluxo sanguíneo, que pode acarretar em hemólise e, consequentemente, acúmulo de heme livre. Além disso, no processo de aterogênese as moléculas de adesão, principalmente integrinas, são de crucial importância durante a resposta de CMLV. Nesse trabalho nosso objetivo inicial foi avaliar o efeito do heme livre nas funções de CMLV, bem como os mecanismos moleculares por trás desses efeitos. Em uma segunda parte, investigamos o envolvimento da integrina α1ß1 no efeito da Angiotensina II (Ang II) em CMLV. Nós observamos que o heme livre é capaz de induzir a proliferação e migração de CMLV via espécies reativas de oxigênio (ERO) provenientes da NADPHoxidase (NADPHox). Adicionalmente vimos que o heme ativa vias de sinalização redox-sensíveis relacionadas à proliferação celular, como MAPKinases e o fator de transcrição NFκB. Também observamos que há uma ligação entre a NADPHox e o sistema heme oxigenase (HO), uma vez que o heme induz a expressão de HO-1 e o pré-tratamento das CMLV com inibidores de HO levam ao aumento tanto o efeito proliferação quanto a indução de ERO promovidas pelo heme. Além disso, vimos que o efeito contra-regulatório promovido pela HO ocorre devido as metabolites do heme: biliverdina, bilirrubina e monóxido de carbono. Por último, quando bloqueamos tanto a NADPHox quanto o sistema HO o heme não teve efeito algum na proliferação de CMLV. Em um segundo estudo, observamos que o efeito da Ang II sobre a migração de CMLV foi inibido quando as células foram pré-tratadas com o ligante da integrina α1ß1, a desintegrina Obtustatina. A seguir observamos que o efeito da Ang II na ativação de FAK e na colocalização actina-ILK é dependente da integrina α1ß1, que possivelmente ativa PKCα, uma vez que vimos que a produção de ERO induzida por Ang II foi inibida pela Obtustatina. Vimos que a indução da expressão de ILK por Ang II em CMLV é dependente da integrina α1ß1 e também observamos que a Obtustatina inibibiu o desacoplamento de ILK da FAK, uma vez que a Obtustatina bloqueou a fosforilação de FAK induzida por Ang II (processo crucial para o desacoplamento da ILK). Nós também observamos que a Ang II induz, via integrina α1ß1, a fosforilação de AKT e a diminuição da expressão de p21, provavelmente via ILK. Corroborando estes dados, nós mostramos que o pré-tratamento com Obtustatina induziu um estacionamento na fase G0 e diminuição da proliferação de CMLV tratadas com Ang II. Portanto, mostramos nesse trabalho que o heme livre induz a ativação de CML via NADPHox, que é elegantemente contra-regulado pelo sistema HO. Além disso, sugerimos que a integrina α1ß1 pode ser um importante alvo molecular para o desenvolvimento de intervenções mais efetivas para a aterosclerose.