Estudo da interação de antipsicóticos atípicos e albumina sérica com base em modelos matemáticos e espectrofluorimétricos

Os antipsicóticos são drogas utilizadas no tratamento de muitos transtornos psiquiátricos, sendo classificados em dois grupos: típicos e atípicos. Os típicos formam o grupo de drogas que bloqueiam especialmente os receptores de dopamina e, por isto, causam efeitos colaterais característicos, que se manifestam através de sintomas extrapiramidais e podem terminar em discinesia tardia. Os atípicos apresentam eficácia antipsicótica similar à dos antipsicóticos típicos, mas produzem menos efeitos colaterais extrapiramidais e não causam discinesia tardia. Os antipsicóticos se ligam às proteínas plasmáticas, principalmente a albumina, a qual representa cerca de 60% do total das proteínas no soro humano. Neste trabalho estudamos os processos de interação de duas drogas antipsicóticas atípicas, risperidona e sulpirida, com as albuminas séricas humana (HSA) e bovina (BSA), através da técnica de supressão da fluorescência intrínseca do triptofano. A partir dos espectros de fluorescência, a análise dos dados foi feita obtendo-se os gráficos e as constantes de Stern-Volmer. A análise da supressão da fluorescência foi feita a partir da média aritmética dos dados oriundos dos experimentos realizados em cada condição adotada. Como a molécula da sulpirida é fluorescente desenvolvemos uma modelagem matemática do processo de interação, que nos permitiu então obter os dados referentes à supressão da fluorescência da proteína. Os resultados mostraram que a risperidona e a sulpirida suprimem a fluorescência de ambas albuminas por um processo de quenching estático, formando complexos droga-albumina. A risperidona tem uma afinidade com a HSA cerca de 6,5 vezes maior do que a sulpirida, a 37 oC. As constantes de associação calculadas para a interação risperidona-HSA, através da Teoria de Stern-Volmer, foram 1,43 ( 0,05) x 105 M-1, a 37 C, e 2,56 ( 0,09) x 105 M-1, a 25 C1; e para a sulpirida, 2,20 ( 0,08) x 104 M-1, a 37 C, e 5,46 ( 0,20) x 104 M-1, a 25 C. Como a taxa de quenching da BSA foi maior do que a da HSA, sugerimos que o sítio primário para a risperidona nas albuminas esteja localizado mais próximo ao domínio do triptofano 134 da BSA do que do domínio do triptofano 212 da HSA. O mesmo sugerimos com relação ao sítio para a sulpirida a 37 C.

Consumo materno de dois compostos bioativos da semente da linhaça sobre parâmetros bioquímicos e hormonais das mães e proles durante a lactação

Avaliamos o efeito do consumo materno de SDG (Diglicosídeo Secoisolariciresinol) e de óleo de Linhaça+SDG sobre parâmetros bioquímicos e hormonais das ratas e das proles machos e fêmeas na lactação. As ratas lactantes foram separadas em: controle (C), ração controle cuja proteína foi caseína; (SDG): ração C com 400mg de SDG/Kg de ração; OLSDG: ração C com 400mg de SDG/Kg de ração e 7% de óleo de linhaça. No 14 e 20 dias de lactação as ratas foram ordenhadas e no 21 dia foram sacrificadas por punção cardíaca. Leite e soro foram coletados para avaliação bioquímica e hormonal. Hormônios foram quantificados por radioimunoensaio. As proles machos e fêmeas foram sacrificadas aos 14 e 21 dias de idade. Os animais foram eviscerados para análise da composição corporal. Monitoramos a ingestão alimentar e a massa corporal (MC) durante o período experimental. As ratas SDG apresentaram maior gordura corporal (GC; +39%), enquanto as OLSDG menor conteúdo mineral (-20%) e trigliceridemia (TG) (-39%). As ratas SDG e OLSDG apresentaram hiperprolactinemia (+389% e 153%, respectivamente) sem alteração na concentração de estradiol. No 14 dia de lactação, o leite das ratas OLSDG apresentou menores teores de lactose(-17%) e de proteínas (-20%) e o das ratas SDG apenas menor teor de proteína (-21%). A partir do 13 dia de lactação tanto os machos quanto as fêmeas OLSDG apresentaram menor MC (-14%, -16%, respectivamente). No 14 dia de lactação os machos SDG e OLSDG apresentaram menor gordura corporal (-24%, -55%, respectivamente ) e a prole SDG maior massa de gordura visceral (+39%). Os machos SDG apresentaram maiores concentrações de TG (+105%) e hipoprolactinemia (-41%). Os machos OLSDG também apresentaram hipoprolactinemia (-41%). As fêmeas SDG e OLSDG apresentaram maior estradiol aos 14 dias (+86% e +176%) que se normalizou aos 21 dias, maior colesterolemia (+16%) e as SDG apresentaram maior trigliceridemia (+74%). Aos 21 dias os machos e as fêmeas SDG e OLSDG apresentaram menor trigliceridemia (-48%, -54%,42% e -59%, respectivamente). Os dois componentes principais da semente de linhaça produzem alterações bioquímicas e hormonais tanto nas mães, quanto nas proles, independente do sexo. Entretanto, as alterações observadas diferem entre mães e prole e de acordo com o gênero. Entre as alterações mais importantes ressaltamos a hiperprolactinemia materna que pode ser um dos motivos para a hipoprolactinemia da prole e a hipertrigliceridemia causada pela ingestão de SDG pelas mães.

Detecção de anticorpos séricos produzidos contra as proteínas do bacteriófago 17 do Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) é uma bactéria associada à Periodontite Agressiva (PA). Ela invade tecidos moles, com ocorrência de lisogenia e bacteriófagos presentes em até 69% das subespécies. Estudos in vitro sugerem que a indução do bacteriófago (Aa17) ocorre numa co-cultura de Aa lisogênico com fibroblastos humanos. Se esta interação ocorre in vivo, com liberação do vírus, uma reação imunológica contra o Aa17 aconteceria. O objetivo deste estudo é constatar se anticorpos (AC) contra proteínas do Aa17 existem e estão associados à doença periodontal. Um objetivo adicional foi testar a resposta de AC contra os sorotipos do Aa. 52 indivíduos participaram: 31 com PA, 5 com Periodontite Crônica (PC) e 16 com Periodonto Saudável (PS). Soro foi coletado após a classificação clínica. As proteínas do Aa17 foram obtidas de preparações purificadas. As subespécies do Aa utilizadas para amostras de proteínas através de sonicação foram: 43717(American Tissue Culture Collection - ATCC) sorotipo A, 43718 (ATCC) sorotipo B, 33384 (ATCC) sorotipo C, IDH781 sorotipo D, NJ9500 sorotipo E and CU1000 sorotipo F. As proteínas foram separadas em géis de poliacrilamida e transferidas para membranas de nitrocelulose. As reações de Western-blotting ocorreram com o AC primário sendo o soro de cada indivíduo. Todas as membranas foram lidas pelo sistema Odyssey que captura sinais no AC secundário (antihumano). A resposta de AC contra ao menos uma proteína do Aa17, assim como pelo menos um sorotipo do Aa foi observado em todos, com exceção de dois indivíduos (com PS), participantes. Um indivíduo do grupo PC e três do PA tiveram resposta de AC contra alguns, mas não todos os sorotipos do Aa. A resposta de AC contra todos os sorotipos foi o achado mais comum nos grupos PA (28/31), PS (14/16) e PC (4/5). A resposta de AC contra o complexo de proteínas do Aa17 foi observado em 7 indivíduos com PA, 2 com PC e 6 com PS. A presença de AC contra qualquer proteína do Aa17 tem significância estatística (p= 0,044), assim como a resposta de AC contra o sorotipo C (p= 0,044). Reações intensas foram vistas quando o soro reagiu contra proteínas do sorotipo C; em alguns casos um sinal tão forte que cobriu a maioria da faixa. Essa resposta intensa esteve presente em 17, 3 e 1 dos indivíduos com PA, PC e PS e tem significância estatística entre os grupos PA e PS (p= 0,001). A resposta de AC contra uma proteína do Aa17 ou seu complexo foi observado em todos os grupos. Esse achado sugere que a indução in vitro do Aa17 poderia também ocorrer in vivo, embora não sendo necessariamente associada à periodontite. A resposta de AC contra vários sorotipos do Aa foi um achado comum e não associado com a doença. Entretanto, a presença e a intensidade da resposta de AC contra o sorotipo C está associada à PA.

Avaliação de modelos preditivos de sorção em membranas de pervaporação para a remoção de sulfurados da nafta

A remoção de compostos sulfurados da gasolina é um assunto de grande interesse na indústria de refino de petróleo em função das restrições ambientais cada vez mais rígidas em relação ao teor máximo de enxofre de produtos acabados. A solução mais comum para remoção de contaminantes são as unidades de hidrotratamento que operam a alta pressão e possuem alto custo de instalação e de operação além de levarem à perda de octanagem do produto acabado. O uso de membranas é uma alternativa promissora para a redução do teor de enxofre de correntes de gasolina e possui diversas vantagens em relação ao hidrotratamento convencional. O conhecimento aprofundado dos parâmetros que influenciam as etapas de sorção e difusão é crítico para o desenvolvimento da aplicação. Este trabalho avalioua seletividade e sorção do sistema formado por n-heptano e tiofeno em polímeros através de modelos termodinâmicos rigorosos, baseados em contribuição de grupos. O modelo UNIFAC-FV, variante do tradicional modelo UNIFAC para sistemas poliméricos, foi o modelo escolhido para cálculo de atividade dos sistemas estudados. Avaliou-se ainda a disponibilidade de parâmetros para desenvolvimento da modelagem e desenvolveu-se uma abordagem com alternativas para casos de indisponibilidade de parâmetros UNIFAC. Nos casos com ausência de parâmetros, o cálculo do termo residual da atividade das espécies é feito na forma proposta por Flory-Hugginsutilizando-se parâmetros de solubilidade obtidos também por contribuição de grupos. Entre os métodos de contribuição de grupos existentes para cálculo de parâmetros de solubilidade, o método de Hoy mostrou menores desvios para os sistemas estudados. A abordagem utilizada neste trabalho permite, ao final, uma análise de alterações da configuração da cadeia principal de polímeros de forma a influenciar sua seletividade e sorção para dessulfurização de naftas

Correlação entre o perfil fenotípico, genotípico e a virulência de isolados geofílicos, antropofílicos e zoofílicos de Sporothrix schenckii

Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados.

Avaliação da sorção de Cu (II) e Hg (II) pela Sargassum sp modificado com epicloridrina

É crescente o aumento da preocupação do homem com a contaminação de ambientes aquáticos uma vez que da subsistência dos mesmos depende o bem estar de todos. Ao mesmo tempo em que cresce a preocupação tem aumentado a quantidade de pesquisas em busca de tecnologias alternativas ao tratamento e remediação de efluentes aquosos contaminados pelas mais diversas substâncias incluindo os metais pesados. Nas últimas décadas, tem crescido o número de trabalhos avaliando a capacidade de sorção e a viabilidade da utilização de biossorventes de baixo custo na captação de íons metálicos e um desses materiais são as biomassas de algas pardas. Dentre os vários gêneros existentes no planeta o território brasileiro é rico na macroalga do gênero Sargassum. Muito embora a composição dessas biomassas varie o principal constituinte das mesmas é o ácido algínico e seus sais alcalinos na forma de um copolímero linear, homopolimérico, com unidades do ácido manurônico, (M), (1-4)-β-D- ligado e seu epímero em C-5 nos resíduos α-L-gulurônicos, (G), respectivamente, covalentemente ligados entre si em sequencias diferenciadas ou em blocos. Os monômeros podem aparecer em blocos homopoliméricos consecutivos, resíduos G (unidades G), resíduos consecutivos M (unidades M), pequenas unidades alternadas M e G (blocos MG), ou em blocos aleatoriamente organizados. A proposta dessa dissertação é realizar a modificação do copolímero existente na biomassa com epicloridrina, avaliar e comparar a captação de íons Cu (II) e Hg (II) pela biomassa da alga Sargassum sp., com a biomassa não modificada e resultados publicados na literatura

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Hiperagregabilidade plaquetária e depressão: é o óxido nítrico o mensageiro comum?

A depressão é uma doença grave que vem se tornando mais prevalente na população mundial e no Brasil. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), é a quarta doença mais incapacitante e estima-se que em 2020 ocupe o segundo lugar, ficando atrás apenas das doenças cardiovasculares (DCV), que são a principal causa de morte no mundo. O Transtorno depressivo maior (TDM) se caracteriza por humor deprimido, tristeza intensa ou desânimo ou perda de interesse ou de prazer por quase todas as atividades por, pelo menos, duas semanas. Além disso, tem um elevado índice de mortalidade cardiovascular, e esta associação parece ser multifatorial e altamente complexa, e ainda não está completamente elucidada. Recentes estudos sugerem que a ocorrência de aterotrombose e eventos cardiovasculares no TDM está associada a uma diminuição na biodisponibilidade do óxido nítrico (NO), um potente vasodilatador, anti-agregante plaquetário e neurotransmissor. O NO é um gás formado a partir da L-arginina, pela ação da família de enzimas NO sintases (NOS), e vai ocasionar um aumento de guanosina monofosfato cíclica (GMPc), que é posteriormente degradada pelas fosfodiesterases (PDE). A L-arginina participa em outras vias além da produção de NO, como a arginase. O estresse oxidativo também tem uma participação no desenvolvimento dos transtornos psiquiátricos e nas DCV, e pode reduzir a meia-vida do NO. O objetivo deste estudo é investigar a via NO-GMPc, o ciclo da uréia, marcadores de estresse oxidativo e de inflamação em plaquetas e a sua associação com a função plaquetária no TDM. Participaram da pesquisa nove pacientes com diagnóstico de depressão leve a moderada do Serviço de Psicologia Aplicada (SPA/UERJ) e onze indivíduos saudáveis pareados por idade como controles. Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário Pedro Ernesto (1436-CEP/HUPE). A agregação plaquetária, a expressão e atividade da arginase II, a expressão da PDE 5, marcadores de estresse oxidativo (níveis de TBARS, carbonilação de proteínas, expressão da NADPH oxidase e da glutationa peroxidase (GPx) e atividade desta e da catalase (CAT), ambas enzimas anti-oxidantes) nas plaquetas e no soro, e o fibrinogênio sistêmico foram investigados. No presente estudo observou-se um aumento da agregação plaquetária induzida por ADP em pacientes com TDM comparados aos controles. Uma ativação da arginase II em plaquetas sem qualquer alteração na sua expressão foi demonstrada em pacientes com TDM. Além disso, um aumento na carbonilação de proteínas e na expressão de GPx, de NADPH e de PDE5 foi observado em plaquetas de pacientes com TDM. A produção de TBARS, a atividade de GPx e CAT nas plaquetas e no soro não foram afetados pelo TDM. Não houve diferença nos níveis de fibrinogênio entre pacientes com TDM e controles. A ativação da arginase, somada ao estresse oxidativo, reduziria a biodisponibilidade de NO levando à disfunção plaquetária nos pacientes com TDM. O presente estudo acrescenta dados importantes para a compreensão dos mecanismos celulares envolvidos na relação TDM e DCV. Além disso, abre caminho para a utilização de novas ferramentas farmacológicas, como os antioxidantes, para o tratamento do TDM.

Avaliação do estrese oxidativo e da via L-arginina-óxido nítrico em plaquetas na gestação normal e na pré-eclâmpsia

A Pré-eclâmpsia (PE) é uma síndrome hipertensiva específica da gravidez, atualmente compreendida como uma doença sistêmica que cursa com inflamação, distúrbios da coagulação, desordens metabólicas, disfunção endotelial e desequilíbrio entre agentes vasoconstrictores e vasodilatadores. Contudo, a fisiopatologia da PE ainda não foi completamente elucidada. Este estudo investigou, em 51 gestantes, o estresse oxidativo, a via L-arginina-óxido nítrico e agregação plaquetária, na gestação normal (n=27) e na PE (n=24). Amostras de soro e plaquetas de gestantes normotensas e com PE, foram utilizadas para a medida de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), a carbonilação de proteínas, a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), assim como a produção de óxido nítrico (NO) pela formação de nitrito. Nas plaquetas foram avaliados, também, o transporte de L-arginina, a atividade da óxido nítrico sintase (NOS) e a agregação plaquetária. Em amostras de plasma foram realizadas medidas da proteína C reativa ultra-sensível (PCRus) e do aminoácido L-arginina. Estes resultados demonstram que não há diferença nas medidas da proteína C reativa e da L-arginina entre gestantes normotensas e com PE. A formação de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e GPx se encontram reduzidas no soro de gestantes com PE, enquanto a medida de TBARS e a carbonilação de proteínas não foi diferente das gestantes normotensas. Em plaquetas, o transporte de L-arginina pelo sistema y+L está diminuído na PE, ao passo que, a atividade da NOS, a formação de nitrito e a agregação plaquetária não modificaram em relação a gestação normal. A carbonilação de proteínas está aumentada em plaquetas na PE e a atividade da CAT está reduzida. Concluiu-se, que a menor formação de nitrito no soro sugere uma menor produção de NO em pacientes com PE. Este dado correlaciona com uma redução da defesa antioxidante observada pela menor atividade das enzimas SOD, CAT, GPx que deve contribuir para uma maior inativação do NO. Apesar dos níveis plasmáticos normais de L-arginina na PE, o sistema de transporte via y+L está reduzido em plaquetas, o que pode estar associado em parte ao estresse oxidativo que contribui para alterações físicas e estruturais da membrana, podendo afetar o influxo do aminoácido. Apesar do transporte de L-arginina reduzido e do aumento do estresse oxidativo em plaquetas na PE, não houve alteração da atividade da NOS, da produção de NO e da agregação plaquetária, indicando que mecanismos compensatórios possam estar contribuindo para a manutenção da produção de NO e de sua função modulatória sobre a agregação

Estudo estrutural e funcional das proteínas ligadoras de ácidos graxos (FABP- Fatty Acid Binding Proteins) de Fasciola hepatica

As proteínas ligadoras de ácidos graxos (Fatty Acid Binding Proteins, FABPs) de parasitos têm um papel importante no processo de infecção por estes organismos. Por este motivo, estas proteínas são antígenos candidatos para vacina contra a infecção por Schistosoma mansoni e Fasciola hepatica. No presente trabalho foram caracterizadas FABPs de F. hepatica e comparadas com a proteína Sm14 de S. mansoni, a FABP de parasito melhor caracterizada, mediante análise de sequências e estruturas modeladas. Também foram clonadas, expressas e purificadas as FABPs tipo 1 e tipo 3 de F. hepatica. Os resultados do presente estudo indicam que a FABP tipo 3 de F. hepatica é relacionada estrutural, imunológica e funcionalmente com a Sm14, um candidato vacinal amplamente estudado. Devido à importância da Sm14 como alvo para o desenvolvimento de vacina para a esquistossomose, as características apresentadas pela FhFABP3 de F. hepatica apontam esta proteína como um candidato importante também para o desenvolvimento de uma vacina contra a fasciolose

Distribuição e conservação dos genes que codificam as proteínas VgrG e Hcp em espécies de Aeromonas

Aeromonas spp. são bastonetes Gram negativos amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos, com relatos de isolamento em água de abastecimento público e alimentos. Este micro-organismo possui potencial de causar doenças intestinais e extraintestinais cuja patogenicidade está associada a sua virulência multifatorial. Diversos determinantes de virulência de Aeromonas já foram identificados, incluindo sistemas de secreção de proteínas. O sistema de secreção tipo VI (SST6) é o mais recente sistema de secreção de proteínas identificado em bactérias cuja presença em estirpes no gênero Aeromonas pode implicar atividades de citotoxicidade para o hospedeiro, pois esse sistema é capaz de injetar moléculas efetoras dentro da célula, interferindo diretamente nos processos celulares. A fim de determinar a presença e analisar a distribuição dos genes hcp e vgrG codificadores das proteínas efetoras do SST6 em Aeromonas spp. o presente estudo examinou 119 cepas isoladas de diversas origens pela técnica da PCR após o desenho de oligonucleotídeos iniciadores específicos. Objetivamos ainda analisar a variabilidade genética interespecífica dos genes hcp e vgrG a partir de dados de sequenciamento. Os resultados obtidos indicaram a distribuição dos genes vgrG e hcp em 46% das cepas de Aeromonas hydrophila e Aeromonas caviae de diferentes origens. Entre as cepas de A. hydrophila a maior frequência foi observada nas cepas isoladas de humanos, onde todas foram positivas para os iniciadores que amplificaram um produto de 541 pb do gene vgrG e 418 pb do gene hcp. Entre as cepas de A. caviae, a incidência de genes vgrG e hcp foi mais elevada nas cepas isoladas de alface (60%) e peixes (50%). As cepas analisadas de origem ambiental apresentaram índice total de 36% de positividade, apresentando frequência de 60% e 22% em A. hydrophila e A. caviae, respectivamente. Os dados obtidos da análise de cepas de origem alimentar mostraram a presença dos genes vgrG e hcp em 67% (A. hydrophila) e 60% (A. caviae) das cepas isoladas de folhas de alface. Nas cepas isoladas de queijo os genes foram encontrados em 67% e 12,5% das cepas de A. hydrophila e de A. caviae, respectivamente. O alinhamento múltiplo entre as sequências dos segmentos dos genes hcp e vgrG obtidas no sequenciamento indicou grau de identidade nucleotídica de 75 a 100% entre as sequências de hcp e 80 a 100% entre as sequências de vgrG. Em conclusão, nossos resultados indicaram que os iniciadores desenhados foram capazes de detectar suas sequências alvo em cepas de A. caviae e outras espécies de Aeromonas, sugerindo a existência de homologia entre os genes nas diferentes espécies, confirmada após sequenciamento de DNA. Os dados indicaram que esses genes estão distribuídos em várias espécies de Aeromonas e em cepas isoladas de diversas fontes. Ressaltamos a prevalência de cepas de A. hydrophila PCR-positivas em isolados clínicos, sugerindo a participação do SST6 no complexo universo da virulência multifatorial que permeia esse micro-organismo

Papel da fucana sulfatada FucSulf I na interação entre células tumorais e o endotélio in vitro

Para formar metástases, as células tumorais devem se desprender do tumor primário e migrar através do endotélio num processo denominado intravasamento. Uma vez na circulação, elas devem aderir ao endotélio do tecido alvo e extravasar para o novo sítio de colonização, onde irão proliferar. A interação das células tumorais com o endotélio é mediada por selectinas, seguida pela interação com integrinas. As células tumorais apresentam um padrão anormal de glicosilação, expressando ligantes de selectinas, formados por polissacarídeos fucosilados, como sialyl Lewis a/x. Durante o processo metastático, células tumorais secretam diversos fatores de crescimento. Além de modular diferentes tipos celulares que constituem o microambiente tumoral, estes fatores de crescimento também atuam nas células tumorais de forma autócrina, ativando vias de sinalização envolvidas na proliferação e migração celular. Polissacarídeos sulfatados como a heparina, podem atuar como inibidores de P e L-selectinas, além de se ligar a fatores de crescimento, impedindo a ativação de seus receptores. Neste trabalho, avaliamos o papel de fucanas sulfatadas extraídas de diferentes espécies de invertebrados marinhos (L. variegatus, S. franciscanus, S. pallidus, A. lixula e S. droebachiensis) na modulação da interação entre células tumorais com o endotélio in vitro e comparamos seu efeito com o da heparina. Também avaliamos o papel destas moléculas na proliferação de células tumorais. Para isso, utilizamos duas linhagens tumorais de próstata (DU-145 e PC-3) e culturas primárias de células endoteliais de veia umbilical humana (HUVECs). Ao avaliar o efeito das fucanas na adesão das células tumorais às HUVECs, observamos que todas as fucanas testadas inibiram a adesão da linhagem DU-145 à monocamada endotelial, enquanto apenas a fucana extraída da espécie L. variegatus (FucSulf I) e da espécie S. franciscanus inibiram a adesão da linhagem PC-3. A FucSulf I foi uma das fucanas que apresentou maior potencial inibitório nas duas linhagens e foi a única que inibiu a adesão da linhagem DU-145 à matriz subendotelial, não interferindo na adesão da linhagem PC-3. A FucSulf I mostrou-se capaz de diminuir também a migração transendotelial das linhagens tumorais DU-145 e PC-3. A heparina mostrou efeito significativo apenas nos ensaios de transmigração, inibindo este evento de forma similar a FucSuf I. Sabe-se que o VEGF aumenta a permeabilidade endotelial, facilitando a passagem de células tumorais através do vaso. Observamos que as duas linhagens secretam VEGF e que a FucSulf I se liga a este fator. Estes dados sugerem que a interação da FucSuf I com o VEGF pode impedir a ação deste fator nas células endoteliais, diminuindo a migração transendotelial das células tumorais testadas. Também verificamos que a FucSulf I inibiu a proliferação das linhagens celulares na ausência de fatores exógenos ou na presença de soro fetal bovino ou VEGF. Por fim, avaliamos que a FucSulf I interfere na ativação de proteínas específicas de vias de sinalização disparadas por fatores de crescimento. A FucSulf I inibe a ativação da AKT na linhagem PC-3, enquanto nas células DU-145 observamos uma inibição da ativação da ERK. Esses dados indicam que a FucSulf I modula diversas etapas da progressão tumoral e pode ser um potencial candidato para o uso em terapias antitumorais

Mapeamento de proteínas alvo para novos antifúngicos na fração microssomal e citosólica do patógeno humano Aspergillus fumigatus

A incidência de infecções fúngicas invasivas vem aumentando nos últimos anos. Estas infecções, em geral, apresentam altas taxas de mortalidade. A profilaxia com antifúngicos ainda é a estratégia mais comum na contenção da mortalidade e prevenção contra infecções fúngicas invasivas, porém, apresenta baixa eficiência, e relatos de resistência às drogas. Além disso, a terapia antifúngica é limitada a um pequeno grupo de drogas, como os polienos, azóis e equinocandinas. Desta forma, a busca de novos alvos de drogas é fundamental para o desenvolvimento de novos antifúngicos. Estudos in silico indicaram quatro genes como potenciais alvo de drogas em fungos patogênicos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi verificar a expressão das proteínas codificadas por dois destes possíveis genes alvo, a proteína erg6, na fração microssomal, e trr1, na fração citosólica, em hifas de A. fumigatus. Visando alcançar este objetivo, foram primeiramente padronizadas todas as etapas de fracionamento celular visando isolar estas duas subfrações celulares de A. fumigatus. Posteriormente, foi otimizado o protocolo de extração e reidratação de proteínas microssomais bem como reidratação de proteínas citosólicas. Estes extratos foram submetidos a diferentes protocolos de fracionamento proteico em um sistema de eletroforese OFFGEL (OGE). Os resultados de Western immunoblot mostraram que estas duas proteínas, erg6 e trr1, são de fato expressas na fase filamentosa de A. fumigatus. O extrato proteico da fração microssomal submetido ao OGE em doze subfrações apresentou três subunidades da proteína erg6, reconhecidas pelo anticorpo monoclonal, com massas moleculares e pI distintos: uma subunidade de aproximadamente 79 kDa com pI entre 5,91 e 6,49, e outras duas subunidades de aproximadamente 35 kDa e 32 kDa, ambas com pI entre 6,49 e 7,08. A enzima erg6 foi descrita como um homotetrâmero em outros fungos. Porém, nossos resultados sugerem que, em A. fumigatus, a erg6 possui uma estrutura heterotetramérica. Quanto à proteína trr1, tanto no extrato total quanto nas frações resultantes do fracionamento em OGE, uma banda única de aproximadamente 40 kDa, com pI na faixa de 4,79 e 5,33, foi reconhecida pelo anticorpo policlonal. Desta forma, esta proteína parece ter uma estrutura homodimérica, assim como descrito em outros micro-organismos.

Análise de Economias de Escala na Produção de Leite

Este trabalho procurou analisar o sistema produtivo da atividade leiteira em Minas Gerais, identificando a capacidade dos produtores em permanecer no negócio, a longo prazo, através da estimação da função custo translogarítmica. O estudo demonstrou que os produtores analisados ainda praticam altos custos por unidade produzida, sugerindo baixa eficiência dos estabelecimentos e falhas na administração do empreendimento. Os resultados econométricos revelam a possibilidade de ganhos de escala, no que se refere à alocação e melhor aproveitamento dos recursos, ou seja, as propriedades apresentam economias de escala. No entanto, retornos crescentes de escala não são compatíveis com a existência de mercados competitivos, sinalizando que os produtores enfrentam restrições geradas pelas imperfeições de mercado. O conhecimento dessas imperfeições é essencial à formulação de políticas econômicas e de organizações privadas que visem ao desenvolvimento econômico deste mercado, que atualmente é o sexto maior do mundo. Além disso, os resultados das elasticidades mostram que o produtor é mais sensível às variações de preços na mão-de-obra do que às variações nos demais fatores, reduzindo em maior proporção o uso do trabalho na produção, à medida que seu preço aumenta. Isto evidencia a principal característica regional da produção leiteira no país, que é o uso intensivo do fator trabalho. Também foi identificado que o os medicamentos, alimentos e energia, denominados no estudo de fator dispêndio, são os mais difíceis é o mais difícil de serem substituídos na produção, devido às particularidades no uso dos componentes deste insumo. Por fim, os valores positivos encontrados para as elasticidades parciais de substituição de Allen confirmam a substitutibilidade entre os fatores.

Análise do efeito do etanol sobre a expressão de proteínas de diferenciação do epitélio escamoso no esôfago de camundongos BALB/c

Câncer de esôfago (CE) é um dos tipos de câncer mais frequentes e agressivos, estando entre os dez tipos de câncer mais incidentes e letais no mundo. Entre as regiões mais incidentes do CE estão os países em desenvolvimento, como o Brasil. Apesar de recentes avanços em terapias anticâncer, menos de 10% dos pacientes acometidos por esta doença possuem uma sobrevida maior que cinco anos após seu diagnóstico e este fato é consequência do diagnóstico tardio, uma vez que os sintomas só aparecem em estádios bem avançados. Devido a este panorama há uma grande busca por métodos e, principalmente, biomarcadores de diagnóstico que possam detectar a doença em estádios iniciais e assim aumentar a sobrevida dos pacientes. A discriminação entre tumor e mucosa normal é possível ser feita endoscopicamente, porém, para detecção precoce de tumores esofágico seria importante discriminar mucosa saudável de lesão precursora, como displasia. Uma diferença típica entre tecido normal e displasia é a perda de diferenciação celular, sugerindo que proteínas de diferenciação possam ser um potencial alvo para serem usadas como biomarcadores de detecção precoce em câncer. Citoqueratinas (CKs) e esofagina (SPRR3) são importantes proteínas envolvidas na diferenciação das células no epitélio escamoso. A proteína (SPRR3) vem sendo estudada como um possível biomarcador de detecção de tumores em estádios iniciais de desenvolvimento. Em CE tem sido descrito perda da expressão de SPRR3 quando comparada com a mucosa saudável. Além disso, já foi mostrado que a análise combinada da expressão das duas variantes de SPRR3 (SPRR3-v1 e SPRR3-v2) é capaz de discriminar a mucosa esofágica de indivíduos saudáveis da mucosa adjacente e do tumor com alta sensibilidade e especificidade. Porém, uma associação significativa foi encontrada entre uma menor expressão de SPRR3-v2 e o consumo de álcool. Este dado gerou a hipótese de que o álcool pode levar a carcinogênese por estimular a proliferação e/ou perda de diferenciação do epitélio escamoso e desta forma contribuir para o surgimento do tumor. Para testar esta hipótese, foi realizado um modelo experimental utilizando camundongos BABL/c que receberam diariamente etanol em diferentes concentrações por diferentes intervalos de tempo. Foram analisados critérios de toxicidade dos animais e critérios para avaliação histopátológica no tecido esofágico. Além disso, foi analisado o perfil de expressão de proteínas envolvidas em diferenciação e proliferação celular que pudessem sugerir alterações no epitélio esofágico induzidas pelo etanol, sendo estas SPRR3, CK5/8 e CK14 e Ki67. Inflamação foi a única alteração histológica encontrada, porém ocorreu de forma aleatória, não podendo, portanto, ser associada ao etanol. Alteração no padrão de expressão das proteínas analisadas foi encontrada em regiões inflamadas. Porém, a maioria das amostras não apresentou alterações histopatológicas, nem tampouco alteração de expressão das proteínas, sugerindo que em epitélio esofágico de camundongos BALB/c o etanol não é capaz de induzir isoladamente alteração na proliferação e perda de diferenciação celular.