Ocorrência e caracterização de Estafilococos coagulase negativos isolados de recémnascidos com bacteremias em unidade de terapia intensiva neonatal no HUPE-UERJ

Staphylococcus coagulase-negativo (SCN) estão frequentemente envolvidos em infecções nosocomiais associadas com o uso de cateteres e outros procedimentos médicos invasivos. A habilidade de aderir às superfícies abióticas e de produzir biofilme tem sido reconhecida entre os principais fatores de virulência dos SCN, especialmente de S. epidermidis, a principal espécie responsável por infecções relacionadas à assistência a saúde - IRASs. Dentre as demais espécies de SCN capazes de produzir biofilme, S. haemolyticus tem sido relacionado com quadros de infecções em recém-nascidos (RNs). O presente estudo teve como objetivo principal investigar aspectos microbiológicos e epidemiológicos dos processos infecciosos invasivos relacionados com SCN em neonatos internados em unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN) de um hospital universitário do município do Rio de Janeiro (2008-2010). A técnica de PCR multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies de 40 amostras de SCN isoladas de hemoculturas de RNs fazendo uso de cateteres intravenosos e submetidos à terapia antimicrobiana empírica com vancomicina e/ou gentamicina. A fenotipagem foi realizada por três métodos distintos: Simplificado em microplaca, Vitek 2 e API-Staph. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação de CIM (Oxacilina) e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) além da PCR para os genes icaAB, atlE e aap. O perfil genômico dos micro-organismos foi determinado pela técnica de PFGE. Os resultados demonstraram o isolamento de S. haemolyticus (77%), S. epidermidis (15%), S. captis (5%) e S. warneri (3%). A análise comparativa dos resultados obtidos pelo m-PCR com métodos fenotípicos demonstrou uma concordância de 97,5% com o esquema simplificado e de ~40% Vitek 2 e o API Staph. A maioria (82,5%) das amostras apresentou perfis variados de multiresistência aos 16 antimicrobianos testados e resistência a oxacilina, apesar de 25% destas não apresentarem o gene mecA. Apesar da maioria das amostras de SCN ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença dos genes mecA, icaAB, aap, atlE, enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme de SCN. Diferente do observado para as demais espécies, algumas amostras de S. haemolyticus foram incapazes de aderir ao vidro e ao poliestireno e/ou apresentaram os genes aap (38,7%), atlE (42%) além de icaAB (71%). Na UTIN foi detectada a presença de seis diferentes tipos clonais da espécie prevalente, indicando a disseminação de S. haemolyticusnesta unidade hospitalar e a endemicidade em nossa comunidade.

Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus epidermidis isolados de fômites de origem hospitalar: perfis de resistência aos agentes antimicrobianos e produção de biofilme

Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito.

Relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras de origem comunitária e hospitalar pertencentes a diferentes espécies de Staphylococcus coagulase negativo

Nas últimas décadas, os Staphylococcus coagulase-negativo, têm sido considerados como patógenos verdadeiros, sendo um dos principais grupos bacterianos responsáveis pelas infecções relacionadas a assistência a saúde (IRAS). O presente estudo teve como objetivo geral: avaliação da relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras Staphylococcus coagulase-negativo de origem comunitária e hospitalar. Neste sentido, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específico: identificar ao nível de espécie os Staphylococcus coagulase-negativo; analisar por técnica fenotípica (Ágar vermelho do Congo) a produção de slime; avaliar quantitativamente, a produção de biofilme; correlacionar a produção de polissacarídeos extracelulares (slime) com a produção de biofilme; avaliar a relação da resistência a oxacilina como indicador da presença do gene mecA; avaliar a relação entre a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima para oxacilina; pesquisar a presença dos genes mecA, icaAD e atlE, pela técnica de PCR. Foi estudado um total de 150 amostras, sendo 50 isoladas de fômites, 50 isoladas de sangue e 50 isoladas de comunidade. Independente da origem, foram identificadas 14 espécies de Staphylococcus coagulase-negativo, sendo mais frequentes S. epidermidis 42,6%, S. haemolyticus 13,3% e S. cohnii cohnii 10,7%. A análise geral da expressão fenotípica de slime mostrou que 64% das amostras avaliadas eram produtoras de slime. Das 150 amostras testadas neste estudo, 95,3% foram produtoras de biofilme. Ao considerarmos a análise da quantificação do biofilme em relação às origens das amostras estudadas não encontramos diferenças significativas e a maioria das amostras foi considerada moderadamente produtora de biofilme. O gene mecA foi detectado em 6 amostras comunitárias, 34 amostras de fômites e 34 amostras de sangue. Não houve diferença significativa entre as amostras de fômites e sangue. Porém, houve diferença significativa entre as amostras de origem comunitária e as de origem hospitalar - fômites e sangue (p < 0,0001). Ao compararmos as três origens de isolamento quanto a presença do gene atlE observamos que houve diferença significativa (p = 0,0012) entre elas. Sendo, as amostras isoladas de sangue, as que apresentaram maior número de amostras que possuíam o gene atlE (n = 18). Das 150 amostras testadas observamos a presença do gene icaAD em 46% amostras comunitárias, 56% amostras de fômites e 60% amostras de sangue, não encontramos diferença significativa (p = 0,5750). Observamos uma correlação entre a resistência a oxacilina e a produção de slime, pois as amostras de origem hospitalar (fômites e sangue) apresentaram altos níveis de resistência a oxacilina e em sua grande maioria foram produtoras de slime. A espécie S. epidermidis foi a mais isolada e deve-se ressaltar que, quando comparada com as outras espécies, apresentou altos níveis de resistência a oxacilina, sendo a maioria produtora de slime e biofilme.

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA): tipificação do cassete cromossômico SCCmec e resistência a antimicrobianos em pacientes com fibrose cística assistidos em dois centros no Rio de Janeiro

A infecção pulmonar de etiologia bacteriana é um dos principais problemas que levam a morbi-mortalidade na fibrose cística (FC). Staphylococcus aureus se destaca como um dos micro-organismos mais frequentes e com um agravante para a terapêutica quando se apresentam resistentes à oxacilina (MRSA). Amostras MRSA podem ser classificadas tanto genotipicamente quanto fenotipicamente em MRSA adquiridas na comunidade (CA-MRSA) ou adquiridas no hospital (HA-MRSA). Fenotipicamente, essa classificação é muito controversa, podendo se basear em critérios epidemiológicos ou ainda pelo perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos. Por outro lado, a classificação genotípica consiste na determinação dos cassetes cromossômicos (SCCmec), local de inserção do gene mecA (que confere resistência a meticilina). Atualmente são reconhecidos 11 tipos de SCCmec, sendo os de tipo I ao III e VIII relacionados ao genótipo HA-MRSA e IV ao XI ao genótipo CA-MRSA. Classicamente CA-MRSA é capaz de produzir a toxina Panton-Valentine leukocidin (PVL), codificada pelos genes luk-S e luk-F que está associada à pneumonia necrotizante e infecções de tecidos moles em pacientes com FC com quadros de exacerbação pulmonar. No Brasil, raros são os trabalhos envolvendo caracterização de SCCmec em amostras de pacientes com FC. Diante disso, este estudo teve como objetivo principal a caracterização dos tipos de SCCmec e ainda a determinação do perfil de susceptibilidade a antimicrobianos em uma população de MRSA recuperada de pacientes com FC assistidos em dois centros de tratamento no Rio de Janeiro, Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) e Instituto Fernandes Figueira (IFF). Foram estudadas 108 amostras de MRSA isoladas do período de 2008 a 2010, sendo 94 oriundas de 28 pacientes adultos atendidos no IFF e 14 de 2 pacientes adultos atendidos no HUPE. Foram encontradas altas taxas de resistência para os antimicrobianos oxacilina, cefoxitina e eritromicina. Todas as amostras foram sensíveis à vancomicina e a linezolida quando determinada as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM). Através da técnica de PCR foi possível a tipificação dos SCCmec em 82,4% das amostras, sendo 64% destas compatíveis ao genótipo CA-MRSA. Não houve diferença estatística nas taxas de susceptibilidade aos antimicrobianos entre as amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Foram encontrados os SCCmec dos tipos I, III, IV e V, sendo os tipos I e IV os mais frequentes. O gene que codifica a toxina PVL foi encontrado em 34,2% das amostras e foi observado em amostras CA-MRSA e HA-MRSA. Nosso estudo se destaca por apresentar um alto percentual de amostras CA-MRSA e ainda por ser o primeiro do país a detectar a presença do gene que codifica a toxina PVL em pacientes com FC. Além disso, de forma inédita na literatura, encontramos o gene luk-S, em amostras classificadas como HA-MRSA em pacientes com FC. Os poucos estudos nacionais, bem como as diferenças encontradas entre trabalhos, refletem a necessidade de conhecimento mais aprimorado do MRSA envolvido nas infecções pulmonares dos pacientes com FC.

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Determinação do perfil fenotípico e genotípico de amostras de Staphylococus aureus resistentes à meticilina (MRSA) e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um dos principais microrganismos envolvidos nas Infecções relacionadas à Assistência à Saúde (IrAS). Porém, um clone de MRSA, o CA-MRSA, emergiu na comunidade e atualmente vem sendo agente de IrAS. O objetivo desta dissertação é avaliar fenotípica e genotipicamente 111 amostras de Staphylococcus aureus resistentes à meticilina e sensíveis a antibióticos não ß-lactâmicos de pacientes atendidos em cinco hospitais no município do Rio de Janeiro. Utilizando os critérios padronizados pelo CLSI 2012, foram determinadas as susceptibilidades a 11 antimicrobianos pelo método de disco difusão em ágar e concentração inibitória mínima para vancomicina e oxacilina pelo método da microdiluição em caldo. A multirresistência (resistência a 3 ou mais antimicrobianos não ß-lactâmicos) foi observada em 31,5% das amostras, sendo que 53,2% apresentaram resistência ao antimicrobiano clindamicina, uma das opções para o tratamento empírico das infecções de pele/tecidos moles. 86,4% apresentaram concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina ≥ 1,0 g/mL ou seja, elevado percentual de amostras associadas ao fenômeno MIC creep, o qual está associado ao insucesso na terapia antimicrobiana anti-MRSA. Não foi observado até o momento nenhuma amostra com CIM ≥ 4cg/mL para vancomicina, entretanto, já há resistência à linezolida em quatro hospitais do estudo. A tipificação do SCCmec nos permitiu classificar 4,5% das amostras em HA-MRSA e 86,5% em CA-MRSA, nas quais a resistência heterogênea típica à oxacilina foi observada em 57,2%. A toxina de Panton-Valentine (PVL) foi identificada pela metodologia de PCR em 28% das amostras com genótipo CA-MRSA. Os fatores de riscos clássicos, da literatura, relacionados à infecção por HA-MRSA foram também observados nos pacientes com infecção por CA-MRSA portadoras de SCCmec IV e V. No intuito de verificar a existência de similaridades genéticas ou a presença de clone predominante entre as amostras dos cinco hospitais, foi realizada a técnica de eletroforese em gel sob campo pulsado (PFGE) e observou-se diversidade genética assim como a presença de amostras com padrões similares aos clones OSPC (18,5%) e USA400. Não foram encontradas amostras com padrões de eletroforese similares aos clones USA300, USA800 e CEB. É essencial a vigilância da resistência aos antimicrobianos não ß-lactâmicos no CA-MRSA, em especial à vancomicina. A mudança na epidemiologia deste microrganismo vem impactando os padrões característicos dos genótipos limitando os critérios de diferenciação entre eles. Neste contexto, as técnicas moleculares atuam como excelentes ferramentas de caracterização. O conhecimento do patógeno auxilia na elaboração e implementação de medidas preventivas, contribuindo para o controle da doença tanto no ambiente hospitalar quanto na comunidade.