Acinetobacter spp.: resistência a antimicrobianos, genotipagem e dinâmica da colonização em CTI de um Hospital Universitário um ano de estudo

As espécies do gênero Acinetobacter são freqüentes no ambiente, mas nas últimas décadas vêm se destacando como patógenos hospitalares, especialmente Acinetobacter baumannii e as genoespécies 3 e 13TU, que formam o Complexo A. baumannii e cuja diferenciação só é possível pela utilização de metodologias moleculares. São associadas a diferentes apresentações clínicas, principalmente em pacientes internados em unidades de tratamento intensivo. Freqüentemente apresentam resistência a uma ampla variedade de antimicrobianos, incluindo os carbapenêmicos. Nestes casos as opções de tratamento podem, algumas vezes, limitar-se à polimixina. Esse trabalho objetivou avaliar a susceptibilidade a antimicrobianos, a diversidade genética e a dinâmica de colonização de Acinetobacter spp. isolados de pacientes internados no Centro de Tratamento Intensivo do Hospital Universitário Pedro Ernesto em um ano de estudo. Durante o ano de 2009 foram estudadas 76 amostras de Acinetobacter spp. isoladas de 34 pacientes, sendo a maioria obtida do trato respiratório (42,1 %), seguido de sangue (19,7%). Do total, 96,1% (73) foram identificadas como A. baumannii através da detecção do gene intrínseco blaOXA-51-like. Todas as amostras de A. baumannii foram produtoras da carbapenemase OXA-23 e apresentaram perfil de multirresistência, enquanto as três espécies não-baumannii foram sensíveis a todos os antimicrobianos testados. Não houve produto de amplificação para os genes blaOXA-24-like, blaOXA-58-like e blaOXA-143 pela técnica de PCR multiplex. As amostras apresentaram taxa de resistência maior que 70% para oito dos onze antimicrobianos testados: piperacilina-tazobactam, ceftazidima, cefotaxima, cefepime, amicacina, ciprofloxacina, imipenem e meropenem. A droga com melhor atividade in vitro foi a polimixina B. Quatro amostras foram resistentes com CIM determinada pelo E-test variando de 6 g/mL a 32 g/mL. Observou-se uma grande diversidade genética dentre as amostras, com dez grupos clonais identificados pelo PFGE. O grupo clonal B foi prevalente e persistente na unidade, representado por 32 (42,1%) amostras. Esse foi o mesmo clone descrito como o mais freqüente no Rio de Janeiro em estudo prévio. O clone associado a um surto ocorrido na mesma instituição entre 2007 e 2008 esteve presente em apenas sete (9,2%) amostras, tendo sido substituído pelo genótipo B. A análise prospectiva dos pacientes que permaneceram internados por pelo menos um mês mostrou casos de substituição clonal após terapia antimicrobiana, indicando a existência de reservatório ambiental dos genótipos circulantes. A colonização do trato respiratório por A. baumannii foi bastante comum, mas também foram observados casos de substituição de uma espécie não-baumannii por A. baumannii, além de infecção de corrente sanguínea por um genótipo diferente daquele responsável pela colonização. A presença de cepas resistentes à polimixina é preocupante, pois representa uma ameaça à terapia com a droga. A existência de um clone multirresistente disseminado no Rio de Janeiro, possivelmente pela transferência de pacientes e por profissionais que trabalham em mais de um hospital, aponta a necessidade de se adotar medidas de controle de infecção mais eficazes a fim de reduzir as taxas de morbidade e mortalidade. Além disso, a identificação de focos ambientais de dispersão das cepas epidêmicas parece essencial para garantir a eficácia das demais medidas de contenção de surtos

Identificação, perfil fenotípico e disseminação clonal de cepas de Acinetobacter spp. em hospitais do estado do Rio de Janeiro

Espécies do gênero Acinetobacter são patógenos oportunistas que têm sido associados a várias infecções relacionadas à assistência em saúde acometendo principalmente, pacientes hospitalizados em centros de tratamento intensivo. A. baumannii , Acinetobacter genoespécie 3 e Acinetobacter genoespécie 13TU constituem o complexo A. baumannii e são consideradas as espécies de maior importância clínica. O objetivo deste trabalho foi identificar em nível de espécie, avaliar o perfil de resistência e analisar a diversidade genética de 102 amostras de Acinetobacter spp. isoladas de hemoculturas de pacientes internados em quatro hospitais do estado do Rio de Janeiro. Após a utilização de duas técnicas moleculares, 87 (85,3%) amostras foram identificadas como A. baumannii, sete (6,9%) como A. genoespécie 3, duas (1,9%) A. genoespécie 13TU e seis (5,9%) não foram identificadas em nível de espécie. A maioria das amostras de A. baumannii apresentou caráter multirresistente mostrando percentuais de resistência acima de 70% para ceftazidima, cefotaxima e ciprofloxacina. A resistência aos carbapenêmicos variou de 59% a 91%. Foi encontrada uma grande variedade de antibiotipos entre as amostras de A. baumannii, sendo prevalente dois multirresistentes. Um deles, caracterizado pela sensibilidade apenas aos aminoglicosídeos, ocorreu em 20,7% das amostras e o outro observado em 14,9% das amostras , foi caracterizado pela resistência a todos os antimicrobianos testados. Através da PCR, foi observado que 77% das amostras de A. baumannii apresentaram produto de amplificação compatível com gene blaOXA-23-like e destas, 64 mostraram-se resistentes tanto a imipenem quanto a meropenem. Em contrapartida, todas as amostras de A. baumannii OXA-23 negativas mostraram-se sensíveis aos carbapenens. Em relação às amostras de A. genoespécie 3 e 13TU, foram observados baixos percentuais de resistência frente aos antimicrobianos testados e apenas uma amostra de Acinetobacter genoespécie 3 apresentou produto de amplificação compatível com gene blaOXA-23-like, sendo esta sensível aos carbapenens. Não foram detectados os genes blaOXA-40-like e blaOXA-58-like nas 102 amostras de Acinetobacter spp.. A análise do polimorfismo genético das amostras de A. baumannii por PFGE mostrou a presença de 35 clones distribuídos entre os hospitais. Um clone (designado A), presente em 32 amostras (36,9%), foi encontrado nos quatro hospitais, sendo prevalente em três. Em 93,8% das amostras do clone A foi detectado o gene blaOXA-23-like. A disseminação de um clone de A. baumannii multirresistente produtor de OXA-23 entre os hospitais estudados evidencia a importância de medidas de controle de infecções mais eficazes, visando minimizar a morbidade e a mortalidade causadas por este importante patógeno. Além disso, como outras espécies também podem estar associadas a infecções, destacamos a importância da identificação correta das amostras em nível de espécie, visando o conhecimento da patogenicidade, do perfil de resistência e dados epidemiológicos des outras espécies, principalmente as pertencentes ao complexo A. baumannii

Características clínicas e frequência de diarreia por norovírus em crianças hospitalizadas, vacinadas e não vacinadas contra rotavírus Rio de Janeiro, Brasil, 2004-2009

Os norovírus (NV) são uma importante causa de hospitalização infantil. Crianças internadas por gastroenterite por NV (GENV) são consideradas portadoras de diarreia grave. O objetivo desse estudo, realizado na cidade do Rio de Janeiro, Brasil, é descrever as características clínicas e a frequência da diarreia por NV em crianças hospitalizadas, comparando as taxas de detecção de NV em crianças vacinadas e não vacinadas contra rotavírus (Rotarix). Foram coletadas 659 amostras de fezes de igual número de crianças e encaminhadas para análise pela reação em cadeia pela polimerase, precedida de transcrição reversa no período de janeiro de 2004 a dezembro de 2009. O percentual de amostras positivas para os NV foi de 27,3% nesse período. Das 180 amostras positivas para NV, 55% tiveram origem na comunidade (aqCo) e 45% foram de aquisição nosocomial (aqNo). O percentual de GENV nos dois anos anteriores (2004 e 2005) à introdução da vacina Rotarix foi de 28,3%, sendo 11,3% o percentual de amostras aqCo. Nos dois anos posteriores (2008 e 2009), a GENV significou 24,4%, e as amostras aqCo foram 14,9% (p<0,05). Em 647 crianças, 494 não receberam a vacina Rotarix, enquanto 151 crianças receberam, pelo menos, uma dose. O percentual de GENV foi de 23,8% e 39,7%, respectivamente (p<0,05). Apesar do comportamento sazonal dos casos de GENV aqCo, esse fato não teve significância estatística. Das 180 crianças, 61,6% tinham peso ≤ p10 do NCHS, 82,2% tinham idade ≤ 5anos. As crianças com idade ≤ 2 anos foram mais acometidas nos casos de aqCo do que àquelas de aqNo (p<0,05). Foram observados em 82 crianças: vômitos (73,2%), febre (54,9%), tosse (20,7%), coriza (2,2%), sangue nas fezes (8,5%), erupção cutânea (4,9%) e broncoespasmo (7,3%). Houve significância estatística com relação à frequência maior de febre, coriza, tosse e broncoespasmo nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). De 69 crianças, 73,9% apresentaram desidratação e, dessas, 76,5% necessitaram de hidratação venosa. Esses dados tiveram significância estatística, representada por maiores percentuais nas crianças com GENV de aqCo do que naquelas de aqNo (p<0,05). Esse estudo demonstra que os NV foram um importante agente etiológico nos casos de gastroenterites em crianças hospitalizadas e responsável por altas taxas de infecções nosocomiais. Estatisticamente, não foi comprovada uma tendência de aumento dos casos de GENV no período do estudo, como também do aumento da frequência de GENV nos anos posteriores em relação aos anos anteriores à introdução da vacina Rotarix no Brasil em 2006. No entanto, houve significância estatística quando foi avaliado o percentual de GENV em crianças hospitalizadas vacinadas e não vacinadas contra RV. Um aumento dos casos de GENV em crianças poderá vir a acontecer nos próximos anos, quando é esperado que um número maior de crianças será vacinado contra RV. Tosse, coriza e broncoespasmo são sintomas que devem ser mais detalhadamente investigados. Estratégias de prevenção contra a disseminação dos NV são condutas importantes em unidades de internação. Uma vacina eficaz contra norovírus pode ser um benefício significativo para reduzir o percentual de crianças hospitalizadas por diarreia.

Ocorrência e caracterização de Estafilococos coagulase negativos isolados de recémnascidos com bacteremias em unidade de terapia intensiva neonatal no HUPE-UERJ

Staphylococcus coagulase-negativo (SCN) estão frequentemente envolvidos em infecções nosocomiais associadas com o uso de cateteres e outros procedimentos médicos invasivos. A habilidade de aderir às superfícies abióticas e de produzir biofilme tem sido reconhecida entre os principais fatores de virulência dos SCN, especialmente de S. epidermidis, a principal espécie responsável por infecções relacionadas à assistência a saúde - IRASs. Dentre as demais espécies de SCN capazes de produzir biofilme, S. haemolyticus tem sido relacionado com quadros de infecções em recém-nascidos (RNs). O presente estudo teve como objetivo principal investigar aspectos microbiológicos e epidemiológicos dos processos infecciosos invasivos relacionados com SCN em neonatos internados em unidade de terapia intensiva neonatal (UTIN) de um hospital universitário do município do Rio de Janeiro (2008-2010). A técnica de PCR multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies de 40 amostras de SCN isoladas de hemoculturas de RNs fazendo uso de cateteres intravenosos e submetidos à terapia antimicrobiana empírica com vancomicina e/ou gentamicina. A fenotipagem foi realizada por três métodos distintos: Simplificado em microplaca, Vitek 2 e API-Staph. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação de CIM (Oxacilina) e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) além da PCR para os genes icaAB, atlE e aap. O perfil genômico dos micro-organismos foi determinado pela técnica de PFGE. Os resultados demonstraram o isolamento de S. haemolyticus (77%), S. epidermidis (15%), S. captis (5%) e S. warneri (3%). A análise comparativa dos resultados obtidos pelo m-PCR com métodos fenotípicos demonstrou uma concordância de 97,5% com o esquema simplificado e de ~40% Vitek 2 e o API Staph. A maioria (82,5%) das amostras apresentou perfis variados de multiresistência aos 16 antimicrobianos testados e resistência a oxacilina, apesar de 25% destas não apresentarem o gene mecA. Apesar da maioria das amostras de SCN ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença dos genes mecA, icaAB, aap, atlE, enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme de SCN. Diferente do observado para as demais espécies, algumas amostras de S. haemolyticus foram incapazes de aderir ao vidro e ao poliestireno e/ou apresentaram os genes aap (38,7%), atlE (42%) além de icaAB (71%). Na UTIN foi detectada a presença de seis diferentes tipos clonais da espécie prevalente, indicando a disseminação de S. haemolyticusnesta unidade hospitalar e a endemicidade em nossa comunidade.

Estudo fenotípico e molecular de resistência aos antimicrobianos em amostras clínicas e ambientais de enterobactérias

Buscamos detectar evidências da presença de genes envolvidos na produção de Enzimas Modificadoras de Aminoglicosídeos (EMAs), Beta-lactamases de espectro estendido (ESBLs) e Mecanismos Plasmidiais de Resistência a Quinolonas (PMQRs) em cepas de K. pneumoniae, K. ozaenae e E. coli isoladas de amostras de água de rios afluentes da Baía de Guanabara e de materiais clínicos de origem hospitalar, além de avaliar o "status sanitário" dos corpos aquáticos abordados no tocante à contaminação fecal recente e indicações de contaminação hospitalar e por outros ambientes de alta seletividade. As cepas de materiais clínicos foram selecionadas entre Maio e Julho de 2010, a partir da semeadura em meio de cultura contendo 8g/mL de gentamicina. As amostras de água foram coletadas em Abril e em Julho de 2009. Realizamos testes de colimetria, empregando para tal, a metodologia convencional e outra, na qual adicionamos 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina aos caldos Lactosado e Escherichia coli (caldo EC), a fim de detectar e quantificar coliformes resistentes. Para o isolamento das cepas empregamos meios de cultura contendo 32g/mL de cefalotina e 8g/mL de gentamicina. As cepas foram identificadas e submetidas a testes de susceptibilidade aos antimicrobianos (TSA), testes presuntivos para presença de ESBLs, extração de DNA plasmidial e ensaios de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para a detecção dos genes. A utilização de agentes antimicrobianos nos testes de colimetria nos permitiu detectar a presença e quantificar coliformes totais e fecais resistentes nas amostras de água analisadas nos diferentes pontos. O TSA das cepas isoladas de amostras de água exibiu perfis de multirresistência, compatíveis com o de bactérias de origem hospitalar, semelhante ao encontrado nas cepas isoladas de materiais clínicos. Todas as cepas isoladas de amostras de água e 90% das cepas de materiais clínicos apresentaram pelo menos uma banda plasmidial. Os ensaios de PCR evidenciaram a presença de produtos de amplificação para EMAs, ESBLs e PMQRs, sendo que 7,4% das cepas de amostras de água e 20% das cepas de materiais clínicos apresentaram produtos de amplificação para as três classes de antimicrobianos. A realização de testes de colimetria empregando antimicrobianos, como gentamicina e cefalotina, pode ser uma ferramenta adicional importante ao teste convencional, quando o interesse for, o monitoramento e a prevenção de contaminação ambiental, especialmente associada a microrganismos carreando genes de resistência. O uso criterioso de antimicrobianos em atividades de cunho hospitalar e veterinário e medidas no sentido de prevenção de lançamento de esgoto e/ou tratamento dos efluentes, são fundamentais para o controle da disseminação de elementos genéticos de resistência transferíveis entre os microrganismos. A detecção e identificação de microrganismos apresentando elementos de resistência em ambiente extra-hospitalar como em água e solo, em particular, o emprego de testes de colimetria empregando antimicrobianos, se faz necessária, como forma de prevenção e controle de disseminação destes microrganismos com potencial de causar infecções em humanos e outros animais que eventualmente entram em contato com estes ambientes.

Fatores de risco para infecções hospitalares em crianças críticas

O objetivo desta tese foi avaliar a influências da exposição a diversos fatores de risco e ocorrência de infecção hospitalar (IH) e examinar fatores de risco relacionados às pneumonias associadas ao uso de ventilador mecânico (PAV) em crianças críticas. Usamos os métodos de estudo prospectivo envolvendo uma coorte de 268 crianças menores de três anos, realizado em unidade de pacientes graves, de janeiro de 1997 e setembro de 2000. Aplicou-se técnica de regressão de Poisson para estimar razões de risco e estratégia de abordagem hierárquica para identificar fatores de risco associados à IH. Apenas para 179 crianças críticas que usaram ventilador mecânico, aplicou-se a regressão de Cox para estimar razões de risco e identificar fatores de risco associados à PAV. Os resultados apresentaram 74 infecções hospitalares diagnosticadas no total, com taxa de incidência de 48,1 IH por 1000 pacientes-dia. Foi determinante para ocorrência de infecção hospitalar, idade superior a dois anos (Razão de Risco) [RR]: 2,66; intervalo de confiança [IC]: 95%: 1,46-4,58), uso de sonda vesical (RR: 2,92; IC 95%: 1,47-5,80), uso de nutrição parenteral (RR: 1,90; IC 95%: 1,15-3,13), realização de broncoscopia (RR: 1,84; IC 95%: 1,03-3,27), tempo de exposição ao cateter vascular central (RR: 2,36; IC 95%: 1,18-4,71) e ao ventilador mecânico (RR: 1,72; IC 95%: 0,94-3,15). Observou-se PAV em 29 crianças (16,3%), com taxa de incidência de 29,3 casos por 1000 dias de ventilação mecânica (IC 95%: 20,34-42,11), dos quais 50% dos eventos ocorreram até o quinto dia de ventilação. A taxa de risco diária aumentou até um máximo de 2,3%, observada no 7 dia de ventilação, e reduziu a partir daí. Foram fatores de risco para PAV na análise multivariada hierarquizada, idade acima de 1 ano (RR: 3,49; IC 95%; 1,64-7,45), cirurgia do aparelho digestivo (RR: 5,05; IC 95%; 2,17-11,78) e nutrição parenteral (RR: 2,68; IC 95%: 1,24-5,8). /exposição a antibióticos antes da internação conferiu proteção (RR: 0,29; IC 95%: 0,13-0,66). Concluímos que os resultados encontrados neste estudo indicam que a influência do tempo de exposição é determinante para a ocorrência de infecções hospitalares e está associado aos processos de cuidados do paciente crítico. Políticas institucionais direcionadas ao controles e prevenção das IH devem fazer de estratégias fundamentais para a qualidade da assistência e segurança do paciente internado. Vigilância de Saúde Pública e componentes longitudinais de estudo de fatores de risco para infecções hospitalares e para pneumonias associadas ao ventilador podem ajudar avaliar prognósticos e planejar e testar medidas preventivas, concentrando-se esforços na primeira semana de ventilação.

Staphylococcus haemolyticus e Staphylococcus epidermidis isolados de fômites de origem hospitalar: perfis de resistência aos agentes antimicrobianos e produção de biofilme

Os Staphylococcus coagulase-negativos (SCN) são encontrados na pele e mucosas de seres humanos e outros animais, já que algumas espécies são parte constituinte da microbiota normal destes mesmos sítios, e podem constituir um reservatório para SCN. A espécie Staphylococcus epidermidis, é reconhecida como grande oportunista e agente de graves infecções nosocomiais e comunitárias, além de associado com infecções em pacientes submetidos a implantes com dispositivos médicos, e a espécie Staphyloccus haemolyticus é a segunda espécie mais isolada de hemoculturas humanas, sendo uma das espécies que apresenta elevada resistência aos antimicrobianos. O presente estudo teve como objetivo principal investigar a presença de SCN em fômites (estetoscópios, termômetros e esfigmomanômetros) no ambiente hospitalar, identificar as espécies S. haemolyticus e S. epidermidis e correlacionar seus perfis de resistência aos antimicrobianos com a capacidade de produção de biofilme. A técnica de multiplex-mPCR foi empregada na determinação das espécies e a fenotipagem foi realizada pelos testes fenotípicos convencionais. Os perfis de resistência aos antimicrobianos foram verificados através do teste de disco-difusão, determinação da CIM (oxacilina e vancomicina), determinação da CBM e presença do gene mecA. A capacidade de produção de biofilme foi investigada pelos testes do Ágar Vermelho do Congo e ensaios de aderência em superfícies abióticas (poliestireno e vidro) na presença e ausência de oxacilina e vancomicina, além da PCR para o gene icaAD. Os resultados demonstraram que pelos testes bioquímicos convencionais, a espécie mais encontrada foi S. epidermidis (43,5%). Após a confirmação pela técnica de PCR, 29 amostras (82%) foram identificadas como S. epidermidis, e 6 amostras (18%) foram identificadas como S. haemolyticus. Todas as amostras foram multirresistentes, oxacilina resistentes e vancomicina sensíveis, sendo que apenas 5 amostras S. epidermidis (17,2%) foram tolerantes a oxacilina. A presença do gene mecA foi detectada em 71,4% das amostras. Apesar da maioria das amostras ter apresentado capacidade de produzir slime e/ou biofilme não foi observada total correlação com a presença do gene icaAD enfatizando a natureza multifatorial da produção de biofilme. As amostras aderiram melhor ao esfigmomanômetro, e também, neste fômites, foi encontrado a maior porcentagem de amostras positivas para a produção de slime. Para aderência ao vidro e aderência ao poliestireno não foi encontrada correlação com os fômites. Foram isoladas amostras S. epidermidis de todos os sítios hospitalares estudados e S. haemolyticus só não foi encontrado em Enfermaria de Clínica Médica. Em relação aos fômites, S. epidermidis foi encontrado em todos os fômites estudados, e S. haemolyticus, apenas foi encontrado em esfigmomanômetro e em outros fômites. Os fômites estão servindo como fontes de transmissão e disseminação de micro-organismos, sendo necessário maiores estudos a respeito.

Eficácia de um protocolo de higiene bucal com utilização de solução de clorexidina a 0,12% na prevenção de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM) e os efeitos sobre a microbiota da mucosa bucal de pacientes internados em unidades de terapia intensiva

A presente investigação teve como objetivo avaliar a prática de cirurgiões dentistas em uma unidade de terapia intensiva (UTI) de um hospital militar, o estabelecimento de um protocolo de higiene oral e os seus efeitos sobre a redução de pneumonias associadas à ventilação mecânica (PAVM). As percepções da equipe da UTI sobre as atividades dos cirurgiões dentistas também foram avaliadas por meio de um questionário. O perfil de colonização microbiana da mucosa oral antes e depois do estabelecimento das medidas de higiene oral também foi avaliado tanto por diluição e plaqueamento em meios de cultura microbiológicos seletivos e enriquecidos e através da amplificação pelo método de PCR e eletroforese em gel desnaturante em gradiente (DGGE), subsequente ao sequenciamento dos amplicons. A carga microbiana foi avaliada após a contagem de placas de agar e através da amplificação por PCR em tempo real (qPCR) do gene rrs nas amostras. O protocolo de higiene oral, realizado pelos cirurgiões dentistas, foi capaz de reduzir a incidência de PAVM (p <0,05). O questionário revelou que a modificação da halitose foi percebida por 93,33% dos participantes. A redução da ocorrência das úlceras orais e dos lábios durante a internação dos pacientes foi observada por 80% da equipe da UTI. Foi observada a redução da produção das secreções nasais e bucais por 70% da equipe dos profissionais da UTI. Para 86,66% dos participantes a assistência aos pacientes tornou-se mais agradável após a instituição dos cuidados bucais. O protocolo, realizado com a utilização de solução 0,12% de clorexidina, não foi capaz de evitar a colonização da mucosa oral por patógenos microbianos usualmente encontrados no ambiente hospitalar tais como os bastonetes Gram-negativos entéricos e não fermentadores, nem foi capaz de eliminá-los quando tais micro-organismos já se encontravam presentes antes dos procedimentos de higiene bucal. Alguns Bastonetes Gram-positivos (Lactobacillus sp e corinebactérias) e Staphylococcus epidermidis permaneceram após a realização dos procedimentos. O protocolo de higiene oral permitiu a redução da carga microbiana na mucosa oral de 50% dos pacientes considerando-se o método de contagem microbiana e para 35% dos pacientes pela avaliação dos números de cópias de genes rrs através de qPCR. Em conclusão, o protocolo de higiene oral desenvolvido pelos cirurgiões dentistas foi capaz de reduzir a incidência de PAV na UTI, embora não tenha sido capaz de prevenir a colonização da mucosa oral por supostos patógenos microbianos. O protocolo de higiene oral com a participação ativa dos cirurgiões dentistas foi bem aceito pelos profissionais da UTI e foi capaz de melhorar a qualidade da assistência aos pacientes críticos.

Relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras de origem comunitária e hospitalar pertencentes a diferentes espécies de Staphylococcus coagulase negativo

Nas últimas décadas, os Staphylococcus coagulase-negativo, têm sido considerados como patógenos verdadeiros, sendo um dos principais grupos bacterianos responsáveis pelas infecções relacionadas a assistência a saúde (IRAS). O presente estudo teve como objetivo geral: avaliação da relação entre a resistência a oxacilina e a produção de biofilme de amostras Staphylococcus coagulase-negativo de origem comunitária e hospitalar. Neste sentido, foram desenvolvidos os seguintes objetivos específico: identificar ao nível de espécie os Staphylococcus coagulase-negativo; analisar por técnica fenotípica (Ágar vermelho do Congo) a produção de slime; avaliar quantitativamente, a produção de biofilme; correlacionar a produção de polissacarídeos extracelulares (slime) com a produção de biofilme; avaliar a relação da resistência a oxacilina como indicador da presença do gene mecA; avaliar a relação entre a concentração inibitória mínima e a concentração bactericida mínima para oxacilina; pesquisar a presença dos genes mecA, icaAD e atlE, pela técnica de PCR. Foi estudado um total de 150 amostras, sendo 50 isoladas de fômites, 50 isoladas de sangue e 50 isoladas de comunidade. Independente da origem, foram identificadas 14 espécies de Staphylococcus coagulase-negativo, sendo mais frequentes S. epidermidis 42,6%, S. haemolyticus 13,3% e S. cohnii cohnii 10,7%. A análise geral da expressão fenotípica de slime mostrou que 64% das amostras avaliadas eram produtoras de slime. Das 150 amostras testadas neste estudo, 95,3% foram produtoras de biofilme. Ao considerarmos a análise da quantificação do biofilme em relação às origens das amostras estudadas não encontramos diferenças significativas e a maioria das amostras foi considerada moderadamente produtora de biofilme. O gene mecA foi detectado em 6 amostras comunitárias, 34 amostras de fômites e 34 amostras de sangue. Não houve diferença significativa entre as amostras de fômites e sangue. Porém, houve diferença significativa entre as amostras de origem comunitária e as de origem hospitalar - fômites e sangue (p < 0,0001). Ao compararmos as três origens de isolamento quanto a presença do gene atlE observamos que houve diferença significativa (p = 0,0012) entre elas. Sendo, as amostras isoladas de sangue, as que apresentaram maior número de amostras que possuíam o gene atlE (n = 18). Das 150 amostras testadas observamos a presença do gene icaAD em 46% amostras comunitárias, 56% amostras de fômites e 60% amostras de sangue, não encontramos diferença significativa (p = 0,5750). Observamos uma correlação entre a resistência a oxacilina e a produção de slime, pois as amostras de origem hospitalar (fômites e sangue) apresentaram altos níveis de resistência a oxacilina e em sua grande maioria foram produtoras de slime. A espécie S. epidermidis foi a mais isolada e deve-se ressaltar que, quando comparada com as outras espécies, apresentou altos níveis de resistência a oxacilina, sendo a maioria produtora de slime e biofilme.

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Caracterização e diversidade molecular do transposon Tn1546, carreador do gene vanA, responsável pela expressão de resistência à vancomicina, em amostras clínicas de diferentes espécies de Enterococcus

Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são reconhecidos como importantes patógenos causadores de infecções nosocomiais, configurando um grave problema de saúde pública, principalmente pela escassez de opção terapêutica eficaz. O fenótipo de resistência VanA é o mais frequente, sendo definido pela resistência a altos níveis de vancomicina e teicoplanina. VanA é caracterizado por um conjunto gênico (vanRSHAXYZ) localizado no elemento genético móvel denominado transposon Tn1546. A diversidade de Tn1546 resulta de alterações estruturais promovidas por deleções ou integração de sequências de inserção (IS) que, exercem papel chave na evolução do elemento VanA, modificando os aspectos relacionados à sua transferência e expressão do fenótipo. O objetivo deste estudo foi caracterizar e avaliar o polimorfismo de elementos Tn1546 presentes em amostras de diferentes espécies de Enterococcus isoladas em instituições hospitalares do Estado do Rio de Janeiro no período de 2000 a 2012. Foram incluídas neste estudo 70 amostras VRE que foram caracterizadas quanto ao gênero, espécies e genótipo de resistência aos glicopeptídeos por métodos convencionais e PCR multiplex. A susceptibilidade a 17 antimicrobianos foi avaliada pelo método de difusão em ágar, e concentração inibitória mínima (CIM) para vancomicina e teicoplanina foi determinada por microdiluição em caldo. O tranposon foi obtido após lise das células bacterianas e amplificação por PCR longo, utilizando-se oligonucleotídeos específicos para a região repetida e invertida que flanqueia este elemento genético. A diversidade dos elementos Tn1546 foi avaliada por um conjunto de métodos moleculares que incluiu a análise do polimorfismo do tamanho de fragmentos de restrição (restriction fragment lenght polymorphism, RFLP), utilizando-se a endonuclease ClaI, amplificação de segmentos internos por PCR de sobreposição de oligonucleotídeos (overlapping PCR) e detecção de sequências de inserção (ISs). A caracterização em espécies considerada para as demais análises foi obtida pela metodologia de PCR de acordo com a seguinte distribuição: E. avium (N=6), E. faecalis (N=12), E. faecium (N=46), E. gallinarum (N=4) e E. raffinosus (N=2). Todas as amostras apresentaram o genótipo vanA. Nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foi observado que todas as amostras foram multirresistentes, sendo resistente de 6 a 13 dentre os 17 antimicrobianos testados. A presença de elementos semelhantes ao arquétipo de Tn1546 foi observada em 61,5% das amostras; entretanto, 27 amostras apresentaram perfis variantes de Tn1546. Foram identificados nove perfis de RFLP, dentre 66 avaliadas, sendo o perfil I, prevalente e semelhante ao arquétipo de Tn1546. Não foi possível analisar quatro amostras por RFLP. Os produtos de amplificação de Tn1546 alterados, obtidos pela overlapping PCR e pelo rastreamento de IS, levaram à classificação de 15 tipos polimórficos, nomeados de A a O. A maioria dos Tn1546 polimórficos teve suas regiões de ORF1 e/ou ORF2 deletadas; e IS1542 juntamente com IS1216V foram as inserções mais frequentes, que em muitas situações compartilhavam a mesma região de inserção. IS19 foi detectada apenas na região vanS-vanH. Os dados apresentados neste estudo indicam que o polimorfismo de Tn1546 pode ser explorado no rastreamento de rotas de transmissão, acompanhamento da dispersão de elementos VanA e investigação da evolução de amostras VRE.

Caracterização fenotípica e molecular de amostras de Enterococcus isoladas em um hospital universitário da cidade do Rio de Janeiro

Os enterococos estão amplamente distribuídos no ambiente. Nos seres humanos, compõem a microbiota do trato gastrintestinal, da cavidade oral e do trato geniturinário. Nas últimas décadas, esses microrganismos se tornaram importantes agentes etiológicos de infecções hospitalares. Uma característica marcante desses microrganismos é a resistência intrínseca a vários antimicrobianos utilizados habitualmente no tratamento de infecções, além de alguns fatores que tem sido relacionado à virulência de enterococos. Este estudo investigou a presença de enterococos em amostras de infecção e colonização de pacientes hospitalizados, profissionais de saúde, dietas hospitalares e manipuladores de alimentos. Foram analisadas 276 amostras de colonização, de quadros de infecção, dietas orais e manipuladores de alimento. Não foram recuperadas amostras dos profissionais de saúde. Todas as amostras foram submetidas a testes convencionais de caracterização do gênero e espécies. Testes de susceptibilidade aos antimicrobianos foram empregados pelo método de disco difusão, além da CIM para vancomicina e teicoplanina. A produção de biofilme e a expressão da gelatinase também foram avaliadas. Os genes de resistência a gentamicina, estreptomicina e vancomicina e os genes de virulência cylA, esp e fsr foram pesquisados pela técnica de PCR. O polimorfismo genético foi determinado por PFGE. A espécie E. faecalis foi a prevalente nas amostras isoladas de colonização e infecção (42,2% e 81,9%, respectivamente). E. casseliflavus (58,9%) foi a mais freqüente dentre as amostras das dietas hospitalares e E. faecium (46,7%) de manipuladores. Dentre as amostras de colonização as maiores taxas de resistência foram observadas para eritromicina (76,3%) e ciprofloxacina (53,9%). Dentre as amostras de infecção, >70% foram resistentes a eritromicina, ciprofloxacina e tetraciclina. Resistência a níveis elevados de gentamcina (HLR-GE) e estreptomicina (HLR-ST) foi detectada em 24,6% e 20,4% das amostras, respectivamente, e todas foram portadoras dos respectivos genes. A maioria das amostras de colonização (52,6%) e infecção (55,7%) foram multirresistentes. A taxa para resistência a níveis elevados de vancomicina foi de 5,2% e todas eram portadoras do gene vanA. Em relação a formação de biofilme, 70,2% foram produtoras, com uma maior freqüência dentre as de infecção. A expressão de gelatinase foi detectada em 28,9% e 44,3% das amostras de colonização e infecção, respectivamente. Nenhuma das amostras isoladas das dietas hospitalares e de manipuladores expressou gelatinase. Nas amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium (n=109) 16,5%, 51,4% e 48,6% apresentaram produtos de amplificação referentes aos genes cylA, esp e fsr, respectivamente. A análise do polimorfismo genético revelou uma extensa diversidade dentre as amostras pertencentes as espécies E. faecalis e E. faecium, não acarretando um perfil eletroforético prevalente. Entretanto, foi observado um perfil único dentre as amostras de E. gallinarum resistentes a vancomicina (vanA). Este estudo mostrou que amostras de enterococos isoladas de diferentes fontes, não só de quadros infecciosos, podem representar um risco para a população, apontando para uma maior reflexão quanto ao papel desses microrganismos nas infecções humanas, particularmente no ambiente hospitalar.

Caracterização molecular de bastonetes Gram positivos irregulares e actinomicetos aeróbios obtidos de espécimes clínicos, de ensaios de esterilidade e de áreas limpas

Os bastonetes Gram positivos irregulares (BGPIs) compõem um grupo de espécies bacterianas com ampla diversidade fenotípica e que podem estar presente no meio ambiente, na microbiota humana e de animais. A identificação acurada de BGPIs em nível de gênero e espécie empregando métodos bioquímicos convencionais é bastante limitada, sendo recomendado, portanto, o uso de técnicas moleculares. No presente estudo, foram identificadas amostras de BGPIs oriundas de espécimes clínicos de humanos, de produtos farmacêuticos e de áreas limpas através da análise de sequencias do gene 16S rRNA e de outros genes conservados (housekeeping genes). Os resultados obtidos pelo sequenciamento dos genes 16S rRNA e rpoB demonstraram C. striatum multi-resistente (MDR) como responsável por surto epidêmico em ambiente hospitalar da cidade do Rio de Janeiro. Quinze cepas de C. striatum foram isoladas em cultura pura a partir de secreção traqueal de pacientes adultos submetidos a procedimentos de entubação endotraqueal. A análise por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE) indicou a presença de quatro perfis moleculares, incluindo dois clones relacionados com cepas MDR (PFGE I e II). Os dados demonstram a predominância de PFGE I entre cepas MDR isoladas de unidades de terapia intensiva e enfermarias cirúrgicas. Uma potencial ligação causal entre a morte e a infecção por C. striatum MDR (PFGE tipos I e II) foi observada em cinco casos. Adicionalmente, acreditamos que este seja o primeiro estudo de identificação de espécies de Nocardia relacionadas com infecções humanas pela análise da sequencia multilocus (MLSA) no Brasil. Diferente dos dados observados na literatura (1970 a 2013) e obtidos pelos testes fenotípicos convencionais, a caracterização molecular de quatro lócus (gyrB-16S-secA1-hsp65) permitiu a identificação das espécies N. nova, N. cyriacigeorgica, N. asiatica e N. exalbida/gamkensis relacionadas com quadros de nocardiose em humanos. Cepas de N. nova isoladas de diferentes materiais clínicos de um único paciente apresentaram padrões de susceptibilidade antimicrobianos idênticos e dois perfis PFGE, indicando a possibilidade de quadros de co-infecção por N. nova em humanos. Em outra etapa da investigação, amostras de BGPIs obtidos de ambientes de salas limpas que não puderam ser identificadas por critérios convencionais foram submetidas a análise da sequência do gene 16S rRNA e caracterizadas 95,83% em nível de gênero e 35,42% em espécies. Para gêneros mais encontrados no estudo, foram analisados os genes rpoB e recA de dezessete cepas de Microbacterium e utilizado o MLSA para a identificação de sete cepas identificadas como Streptomyces. Os ensaios permitiram a identificação de três cepas de Microbacterium e de uma única amostra de Streptomyces ao nível de espécie. A análise da sequencia do gene rpoB também se mostrou eficaz na identificação de espécies de cepas de Corynebacterium. Finalmente, para as cepas ambientais pertencentes à classe Actinobacteria os dados morfológicos, bioquímicos e genotípicos permitiram documentar a cepa 3117BRRJ como representante de uma nova espécie do gênero Nocardioides, para o qual o nome Nocardioides brasiliensis sp. nov. e as cepas 3712BRRJ e 3371BRRJ como representante de um novo gênero e espécie para o qual o nome Guaraldella brasiliensis nov. foi proposto.