Desenvolvimento e validação de sistema multiplex X-STR para identificação humana por DNA

Novas metodologias de análise molecular voltadas para estudos populacionais, clínicos, evolutivos, da biodiversidade e identificação forense foram desenvolvidas com base em marcadores microssátelites ou STR Short Tandem Repeats. Os marcadores STR, que estão amplamente espalhados nos genomas e se caracterizam por apresentar alto grau de polimorfismo, podem ser analisados a partir da amplificação por PCR (Reação em Cadeia da polimerase). A análise foi facilitada a partir do desenvolvimento de sistemas de amplificação simultânea de múltiplos STR (multiplex STR) e com a detecção automatizada dos produtos de amplificação marcados por fluorescência. Recentemente, o uso de marcadores STR do cromossomo X (X-STR) tornou-se significativo na prática forense. Devido ao seu modo de transmissão, os X-STR são úteis em situações particulares de investigação de relações de parentesco, apresentando vantagens sobre o uso de STR autossômicos. Este estudo teve como principal objetivo o desenvolvimento e validação de sistema multiplex, denominado LDD (X-STR) Decaplex, capaz de amplificar dez loci X-STR (DXS7133, DXS7424, DXS8378, DXS6807, DXS7132, DXS10074, DXS7423, DXS8377, GATA172D05 e DXS10101) para aplicação em genética populacional, identificação e análises forenses. Utilizando o LDD (X-STR) Decaplex 170 indivíduos autodenominados afrodescendentes, não aparentados geneticamente, foram genotipados. As freqüências alélicas e genotípicas não apresentaram desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg e estão em concordância com aquelas observadas em outros estudos. Os haplótipos observados foram únicos em indivíduos de amostra masculina. A análise de desequilíbrio de ligação não revelou associação entre os marcadores X-STR. A diversidade genética foi elevada, variando entre 0,6218 para o locus DXS7133 a 0,9327 para o locus DXS8377. Os parâmetros de Probabilidade de Vinculação (PV), Índice de Vinculação (IV), Poder de Exclusão (PE), Poder de Discriminação e Razão de Verossimilhança foram também elevados, demonstraram que os dez X-STRs são altamente polimórficos e discriminativos na população estudada. A concentração mínima de DNA para a amplificação dos loci do LDD (X-STR) Decaplex é de 0,5 ng e verificamos que amplificação por PCR pode ser afetada quando são adicionados mais de 5 ng de DNA nas reações. Os percentuais de bandas stutter foram elevados para os loci DXS7132 e DXS8377. No teste de reprodutibilidade observamos consistência entre as tipagem de diferentes amostras biológicas, incluindo as de restos mortais. No teste de mistura a proporção limite em que observamos a coexistência de duas espécies biológicas foi de 2,5:1ng (feminino-masculino). Os resultados evidenciaram que os loci do LDD (X-STR) Decaplex são altamente informativos, consistindo, em conjunto, uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco.

Estrutura populacional e filogeografia de Panulirus argus (Latreille, 1804)

Panulirus argus (Latreille, 1804) é uma das principais espécies de lagosta no Atlântico, sendo um dos maiores recursos pesqueiros do Atlântico Ocidental, onde apresenta um alto valor comercial. A forte explotação da espécie resulta em uma grande pressão sobre suas populações. Recentemente, foi descoberto que sob o binômio P. argus estão contidas duas espécies crípticas que ocorrem em alopatria, uma na região do Caribe e outra na costa brasileira. Esta tese tem como objetivo estudar como se estruturam geneticamente as populações dessas duas espécies, com o propósito de fornecer mais informações para a determinação de estoques e um correto manejo das espécies, e analisar os processos históricos evolutivos que moldaram suas histórias demográficas. Para tal, foram estudados dois marcadores mitocondriais (região controle e o gene da Citocromo Oxidase I) e loci de microssatélites de indivíduos de 7 regiões do Caribe (Florida, Bahamas, Turks e Caicos, Porto Rico, Cuba, Colômbia e Venezuela) e 11 estados do Brasil (Pará, Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo). Dentro de cada espécie foram observadas duas linhagens mitocondriais diferentes, que co-ocorriam, de maneira homogênea, ao longo de suas distribuições. Hipotetiso que essas linhagens foram formadas a partir de um evento de vicariância com contato secundário ou como consequência de um efeito gargalo seguido de expansão. As duas linhagens são evidentes nas sequências da região controle mitocondrial, mas no gene da COI foram evidentes apenas em P. cf. argus do Caribe. As linhagens do Brasil se separaram há aproximadamente 233 - 288 mil anos e cada uma sofreu expansão em tempos diferentes, a primeira se expandiu há 100 mil anos e a segunda linhagem há 50 mil anos. As linhagens do Caribe se separaram cerca de 1 milhão de anos atrás e possuem o mesmo tempo de expansão, 50 mil anos. Os microssatélites não revelaram subdivisão populacional para nenhuma das duas espécies, porém os marcadores, juntos, sugeriram um fluxo gênico diferenciado entre localidades expostas a diferentes correntes marítimas. Considerando que essas lagostas são intensamente explotadas, é importante ser cuidadoso no momento de definir estoques pesqueiros. Para a espécie do Brasil, dois estoques pesqueiros foram sugeridos, o primeiro do Pará à Bahia e o segundo do sul da Bahia a São Paulo. Para a espécie do Caribe, foi mantida e reforçada a hipótese de quatro estoques sugerida pela FAO (Norte, Sul, Centro-Norte e Centro-Sul).

Diversidade genética em um grupo de anuros em miniatura endêmico da Mata Atlântica brasileira (Euparkerella Griffiths 1959).

A Mata Atlântica (MA) está entre as regiões com maior biodiversidade e mais ameaçadas do planeta. Esforços em diversas áreas do conhecimento têm sido feitos para que se tenha uma estimativa mais refinada da diversidade existente e sua organização ao longo do bioma. O crescente número de estudos que buscam reconstituir a história da diversificação da MA apontam para um cenário espacial e temporal complexo, havendo ainda uma lacuna no conhecimento dos processos em pequena escala. Vertebrados em miniatura têm se mostrado uma boa ferramenta para estudos de processos evolutivos em pequena escala. Assim, o gênero Euparkerella, endêmico de uma pequena região da MA dos Estados do Rio de Janeiro (RJ) e Espírito Santo (ES), foi escolhido como modelo para este estudo. No primeiro capítulo buscou-se descrever a diversidade existente dentro do gênero a partir de uma filogenia molecular. Para isso, utilizaram-se métodos bayesianos para gerar genealogias de genes e de espécies a partir de um fragmento de gene mitocondrial e quatro fragmentos de genes nucleares. Os resultados obtidos apontaram para uma grande diversidade críptica no gênero. Foram identificadas seis unidades evolutivas significativamente divergentes para o RJ: duas em Euparkerella cochranae, três em Euparkerella brasiliensis, e Euparkerella sp.. A espécie mais basal recuperada foi Euparkerella robusta, do ES, e estimou-se o início da diversificação do gênero para o final do Mioceno. O segundo capítulo descreve onze marcadores de microssatélites desenvolvidos para Euparkerella brasiliensis através do método de pirosequenciamento de nova geração 454. No terceiro capítulo estudou-se apenas uma unidade evolutiva, Euparkerella brasiliensis da área dos Três Picos/ RJ. A partir de marcadores de evolução rápida (microssatélites) e lenta (sequências de DNA) buscou-se compreender a estrutura e a dinâmica populacional desta unidade evolutiva em uma área bastante pequena (aprox. 20 km) sob influência de um gradiente ambiental altitudinal (40 m 1000 m). Foram identificadas, a partir dos microssatélites, duas subpopulações geneticamente distintas nas bordas do gradiente. O fluxo gênico se deu predominantemente das bordas para a zona de contato, onde foi observado o maior efetivo populacional. Tais resultados indicam que pequenas variações ambientais podem atuar no isolamento populacional em Euparkerella e corroboram o padrão de formas microendêmicas identificadas na filogenia. Futuros estudos devem ser feitos no sentido de buscar caracterizar morfologicamente as unidades evolutivas aqui identificadas; preencher as lacunas amostrais, especialmente no ES; e descrever os processos que atuam em pequena escala nas zonas de contato entre as unidades evolutivas e fatores limitantes a distribuição das mesmas.

Territorialidade e ecologia reprodutiva de Formicivora littoralis (Thamnophilidae) na Restinga da Massambaba, RJ

A distribuição espacial dos indivíduos é decorrente da presença e ausência de microhábitats adequados, sendo aqueles que se estabelecem nas melhores manchas favorecidos pela seleção natural. A aquisição de um território permite a manutenção do indivíduo e o sucesso reprodutivo. A reprodução é considerada de alto custo energético, pois há deslocamento dos recursos para a manutenção de uma prole em vez de serem incorporados no crescimento individual. Investir em uma prole não significa alcançar o sucesso reprodutivo. O sucesso reprodutivo pode ser afetado, por exemplo, por eventos de predação, disponibilidade de alimento e cuidado parental. Este último pode ser realizado por ambos os membros do par reprodutor ou por apenas um deles. A deserção do cuidado parental por um dos sexos pode ser uma resposta à cópulas extra-par. Formicivora littoralis tem distribuição muito restrita. É a única espécie de ave considerada endêmica de restinga e se encontra ameaçada de extinção, embora seja localmente abundante. O presente estudo teve como objetivos: 1) estimar os tamanhos de territórios e compara-los entre estação reprodutiva e não reprodutiva; 2) testar a influência do tamanho dos indivíduos e quantidade de vizinhos no tamanho do território; 3) descrever ninhos, ovos, filhotes e determinar o sucesso reprodutivo; 4) quantificar o cuidado parental; 5) desenvolver marcadores moleculares de microssatélites para determinar paternidade. Para os indivíduos capturados e marcados individualmente, foram obtidas amostras de sangue e medidas morfométricas (tarso, asa, cauda, comprimento total), além do peso. Os tamanhos dos territórios foram estimados pelo método do mínimo polígono convexo (unindo pontos onde machos foram registrados vocalizando). A densidade foi estimada com base no tamanho dos territórios. Aspectos da reprodução foram acessados por meio de busca mensal por ninhos e acompanhamento destes por dois dias consecutivos. Foram obtidas as taxas de predação e a quantificação do cuidado parental. Para a paternidade foram utilizados sete marcadores de microssatélites, desenvolvidos para este fim. Formicivora littoralis possui território pequeno (0,008 a 0,32ha), que varia de acordo com a estação (menor na estação reprodutiva). O tamanho do território não foi relacionado com o tamanho do indivíduo, mas apresentou resultado significativo quando comparado com a quantidade de territórios vizinhos, mostrando ser menor quanto maior o número de vizinhos. A espécie apresentou elevada densidade (0,53 a 1,15 indivíduos/km2). Com relação à reprodução, ninhos tem o formato de cesto aberto onde foram postos no máximo dois ovos. Os filhotes nasceram sem penas. A razão sexual no ninho foi igual em ambos os sexos. A taxa de predação foi elevada na fase de incubação quando comparada à fase no ninho após a eclosão. O cuidado parental (durante a incubação e com os filhotes) foi realizado pelos dois sexos, sem diferenças na proporção do investimento realizado. Dos nove ninhos analisados, todos contiveram pelo menos um ninhego proveniente de fertilização extra-par. Um total de 81,2% dos ninhegos (13 em 16) não foram prole biológica do macho do par reprodutor que realizava o cuidado parental e que se encontrava pareado socialmente com a fêmea. Essa taxa foi a mais elevada entre os estudos já realizados nos neotrópicos

Ecologia molecular de ostras (Crassostrea spp.) do Atlântico Tropical

Crassostrea (Sacco, 1897) é o gênero mais importante do mundo de ostras de cultivo e consiste de 34 espécies distribuídas pelas regiões tropicais e temperadas do globo. C. gasar e C. rhizophorae são as duas espécies nativas que estão distribuídas ao longo de toda a costa do Brasil até o Caribe. C. gasar também ocorre na costa da Africa. Ainda que sua distribuição seja extensa e com disponibilidade abundante, o cultivo de ostras nativas no Brasil ainda é incipiente e a delimitação correta dos estoques mantém-se incerta. O sucesso do desenvolvimento da malacocultura, que é recomendada internacionalmente como forma sustentável de aquicultura, depende da resolução desses problemas. Assim, com o objetivo de determinar geneticamente seus estoques no Atlântico como também estimar sua história demográfica, dois diferentes marcadores moleculares foram empregados: sequências de DNA da região controle mitocondrial e loci de microssatélites espécie-especifícos, desenvolvidos no presente estudo. Foram sequenciados fragmentos da região controle de um total de 930 indivíduos de C. gasar e C. rhizophorae coletados em 32 localidades que incluíram o Caribe, a Guiana Francesa, a costa brasileira e a África. Também foram realizadas genotipagens de 1178 indivíduos, e ambas as espécies, com 9 e 11 loci de microssatélites para C. gasar e C. rhizophorae, respectivamente. Os dados genéticos foram analisados através de diferentes abordagens (índices de estruturação (FST) e de (Jost D), análise molecular de variância (AMOVA), análise espacial molecular de variância (SAMOVA), Bayesian Skyline Plots (BSP), análise fatorial de correspondência (AFC) e análise de atribuição Bayesiana (STRUCTURE)). Os resultados indicaram um padrão geral de estruturação, onde dois diferentes estoques foram detectados para ambas as espécies: grupos do norte e do sul, onde o Rio de Janeiro seria a região limitante entre os dois estoques. Os maiores valores dos índices de estruturação foram encontrados para C. gasar, indicando que esta espécie estaria mais estruturada do que C. rhizophorae. As análises demográficas indicaram uma provável expansão das populações durante o ultimo período glacial e uma possível origem americana das populações africanas. Todos os resultados sugeriram a existência de uma barreira geográfica próxima ao Rio de Janeiro, que poderia ser a cadeia de Vitória-Trindade e o fenômeno de ressurgência que ocorre em Cabo Frio (RJ). Esses resultados serão de grande utilidade para estabelecer critérios para seleção de sementes para cultivo ao longo da costa do Brasil que permitirá o manejo adequado dos estoques ostreícolas, prevenindo seu desaparecimento como já ocorrido em outros recifes no mundo.