Associação entre polimorfismos dos genes IL1B, IL1RN e TNFA e a periodontite agressiva e a periodontite crônica severa

A periodontite é um processo inflamatório crônico de origem bacteriana mediado por citocinas, em especial, interleucina-1 (IL1) e fator de necrose tumoral (TNFα). Polimorfismos genéticos de IL1 e TNFA têm sido associados com a variação de expressão dessas proteínas, o que poderia justificar as diferenças interindividuais de manifestação da doença. O objetivo do presente estudo foi investigar possíveis associações entre os genes IL1B, IL1RN e TNFA e a suscetibilidade à periodontite agressiva e à periodontite crônica severa. Foram selecionados 145 pacientes do Estado do Rio de Janeiro, 43 com periodontite agressiva (PAgr) (33,1 4,8 anos), 52 com periodontite crônica severa (PCr) (50,6 5,8 anos) e 50 controles (40,1 7,8 anos). Os DNAs genômicos dos integrantes dos grupos PAgr, PCr e controle foram obtidos através da coleta de células epiteliais bucais raspadas da parte interna da bochecha com cotonete. Os SNPs IL1B -511C>T, IL1B +3954C>T e TNFA -1031T>C foram analisados pela técnica de PCR-RFLP, utilizando as enzimas de restrição Ava I Taq I e Bpi I, respectivamente. O polimorfismo de número variável de repetições in tandem (VNTR) no intron 2 do gene IL1RN foi feita pela análise direta dos amplicons. Todos os polimorfismos foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8%. As frequências alélica e genotípica do polimorfismo IL1B +3954C>T no grupo PCr foram significativamente diferentes das observadas no grupo controle (p=0,003 e p=0,041, respectivamente). A freqüência do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 no grupo PAgr foi significativamente maior do que no grupo controle (p=0,035). Não houve associação entre os polimorfismos IL1B -511C>T e TNFA -1031T>C e as periodontites agressiva e crônica. A presença dos alelos 2 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T no grupo PCr foi significativamente maior quando comparada ao grupo controle (p=0,045). Entretanto, não se observou associação entre as combinações genotípicas IL1B -511C>T / IL1B +3954C>T e IL1RN VNTR / IL1B -511C>T e a predisposição à doença periodontal. De acordo com os nossos resultados podemos sugerir que, para a população estudada, o polimorfismo IL1B +3954C>T interfere no desenvolvimento da periodontite crônica, enquanto a presença do alelo A2 do polimorfismo IL1RN VNTR intron2 pode ser considerado como indicador de risco para a periodontite agressiva. O presente estudo também nos permite sugerir que a ausência de homozigose dos alelos 1 nos genótipos combinados de IL1RN VNTR intron2 e IL1B +3954C>T pode representar maior suscetibilidade à periodontite crônica severa.

Perfil imunológico e microbiológico de pacientes com periodontites crônica e agressiva

O objetivo deste estudo foi determinar os níveis de interleucina-1β (IL-1 β), IL-2, IL-4, IL-8, interferon-γ (IFN-γ) e a atividade de elastase no fluido gengival (FG) de pacientes com periodontite crônica generalizada (PCG) e periodontite agressiva generalizada (PAgG), e correlacionar com indivíduos de um grupo controle com gengivite apenas. Um objetivo secundário foi analisar o perfil microbiológico subgengival destes indivíduos. Dados clínicos transversais foram obtidos de 20 pacientes com PCG, 17 pacientes com PAgG e 10 indivíduos com gengivite. Amostras de FG foram coletadas com tiras de papel e os níveis de: IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8 e IFN-γ foram medidos, utilizando um imunoensaio do tipo multiplex (Luminex). Atividade da elastase foi avaliada por um ensaio enzimático. Amostras de placa subgengival foram analisadas através do checkerboard DNA-DNA hybridization. As diferenças de significância entre os grupos para dados imunológicos e microbiológicos foram realizadas utilizando o teste Kruskal-Wallis, ajustando para múltiplas comparações. As médias dos parâmetros clínicos e os volumes de FG foram maiores nos pacientes com PCG e PAgG comparados ao grupo gengivite. Níveis mais elevados de IL-1β e atividade de elastase foram encontrados em sítios profundos quando comparado a sítios rasos em ambos os grupos com periodontite (p <0,05). Os dados microbiológicos apresentaram níveis significativamente mais elevados das espécies do complexo vermelho em pacientes com PCG e PAgG, quando comparados aos indivíduos com gengivite (p <0,05). Não houve diferença estatisticamente significante nos níveis de biomarcadores no FG e nos níveis de espécies bacterianas subgengivais entre pacientes com PCG e pacientes com PAgG. Sendo assim, concluímos que os dados do presente estudo não mostraram diferença estatisticamente significante nos parâmetros imunológicos e microbiológicos medidos entre indivíduos com PCG e PAgG.

Análise de uma heme oxigenase funcional em Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, transmitida através de insetos vetores triatomíneos durante a alimentação no hospedeiro vertebrado. Os triatomíneos ingerem numa única alimentação cerca de 10 mM de heme ligado à hemoglobina. O heme é uma importante molécula no metabolismo dos organismos. Um mecanismo intracelular importante no controle de sua homeostase é a degradação enzimática pela Heme Oxigenase (HO) formando biliverdina (Bv), monóxido de carbono e ferro. Como esta enzima não está presente no genoma de T. cruzi, esse trabalho tem por objetivo identificar uma atividade funcional de HO neste parasito, uma vez que dados do nosso laboratório mostram a presença de biliverdina nas incubações dessas células com heme. No presente trabalho testamos o efeito do SnPPIX (inibidor da HO-1), CoPPIX (indutor da HO-1) e Bv sobre a proliferação da forma epimastigota do parasito. A adição de SnPPIX diminuiu a proliferação do parasito na tanto na ausência quanto na presença de heme. Quando a Bv foi adicionada à cultura esse efeito foi revertido; a Bv aumenta a proliferação celular na presença de heme. Por outro lado, a adição de CoPPIX não interferiu na proliferação. Posteriormente, mostramos através da técnica de immunoblotting, utilizando anticorpo monoclonal contra a HO-1, um aumento da expressão de uma proteína em resposta ao heme. Diferentemente das HO-1 já descritas que possuem massa molecular de 32 kDa, a única banda reconhecida pelo anticorpo apresenta 45 kDa. Analisamos também a expressão da HO-1 na presença de CoPPIX, SnPPIX e biliverdina, e somente o CoPPIX foi capaz de modular os níveis de expressão da HO-1. A análise estrutural através da técnica de imunocitoquímica mostrou uma maior expressão da enzima na presença de heme, e que a HO-1 de T. cruzi pode ter mais de uma localização, apresentando marcação citoplasmática e glicossomal. A fim de investigar a sequência da HO-1 de T. cruzi, o DNA genômico foi extraído para amplificação por PCR do gene da HO-1 utilizando oligonucleotídeos desenhados no genoma de T. cruzi. Os dois pares de oligonucleotídeos utilizados nao foram capazes de amplificar uma sequência equivalente a uma HO. Em seguida, utilizamos a técnica de imunoprecipitação, seguida de immunoblotting, com anticorpo anti-HO-1, com objetivo de concentrar a proteína alvo, e observamos um aumento significativo do imunocomplexo nas células tratadas com heme 300 mM, cerca de 2 vezes em relação ao controle. Dando seguimento à tentativa de identificação da HO-1 de T. cruzi, utilizamos a técnica de espectrometria de massa a partir de eletroforese unidimensional, que mostrou uma grande alteração do perfil protéico na presença de heme, mas futuros experimentos são necessários, como eletroforese 2D, para a identificação da proteína alvo

Efeito da suplementação dietética com L-glutamina na sepse abdominal induzida em rato

Após o estímulo deflagrador de um trauma ou infecção, a liberação de citocinas na circulação sanguínea desempenha um importante papel efetor e também modulador da resposta imune sistêmica. Essas citocinas podem ser pró-inflamatórias, que estimulam a liberação de diversos tipos celulares e de outras citocinas, como fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6, IL-8, IL-12 e interferon-gama (INF-1543;); ou citocinas com efeitos antiinflamatórios, que inibem o processo inflamatório, em parte pela redução da produção de diversas citocinas que regulam positivamente a resposta, minimizando o comprometimento orgânico resultante, como IL-4, IL-10, IL-13. A L-glutamina é o aminoácido mais abundante no organismo, com importante papel no metabolismo protéico. Sua ação trófica sobre a mucosa do intestino delgado é bastante conhecida, o que o torna componente essencial para a manutenção estrutural e funcional do intestino. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação dietética com L-glutamina na modulação da resposta inflamatória em animais submetidos a sepse abdominal induzida por ligadura e perfuração cecal. Foram utilizados 24 ratos Wistar machos adultos, com peso inicial entre 200 e 230 g, distribuídos em três grupos, cada um com oito animais, da seguinte forma: grupo I (controle) submetidos a operação simulada (laparotomia e manipulação de alças intestinais); grupo II submetidos a laparotomia, com indução de sepse abdominal; e grupo III receberam suplementação dietética com L-glutamina por sete dias e, após, foram submetidos a indução de sepse abdominal. Foram coletadas amostras sanguíneas de todos os animais antes (tempo 0) e duas e quatro horas (tempos 1 e 2) após a indução da sepse abdominal. Foram verificados o número de leucócitos, a dosagem da concentração plasmática de citocinas pró- e antiinflamatórias (INF-γ, IL-6 e IL-10) e análise microbiológica de líquido peritoneal. A glicemia apresentou aumento significativo em todos os grupos, comparando-os ao início e ao final do experimento (p<0,05). No que concerne à IL-10, observou-se aumento significativo nos animais do grupo III entre os tempos 0 e 2, e entre os tempos 1 e 2 (p=0,0331 e p=0,0155, respectivamente). Não se observou qualquer outra diferença ao serem analisadas as demais citocinas (IFN-1543; e IL-6), em todos os grupos e em todos os momentos analisados. Nossos achados sugerem que a suplementação dietética com L-glutamina em animais submetidos à indução de sepse abdominal com modelo CLP parece potencializar a resposta antiinflamatória, aumentando a concentração plasmática de IL-10, enquanto as concentrações de INF-γ e IL-6 não apresentaram variação significativa.

Relação entre fatores genéticos envolvidos em vias metabólicas mitocondriais e a doença de Parkinson

A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1.

Estudo do polimorfismo Ser49Gly do gene do receptor beta adrenérgico 1 (β-adr 1) na população do estado do Rio de Janeiro, Brasil estratificada por cor da pele e ancestralidade genômica

As doenças cardiovasculares possuem a maior taxa de óbitos no mundo, e notavelmente nos últimos anos as pesquisas genéticas sobre as mesmas estão baseadas em estudos de associação, no qual o gene suspeito que esteja em maior frequência entre os pacientes passa a ser considerado um possível fator causal. Os polimorfismos genéticos que ocorrem no receptor beta-adrenérgico podem resultar em mudanças significativas na função do receptor, podendo acarretar fisiopatologias. Neste trabalho, o objetivo foi estimar a diversidade e a frequência do polimorfismo Ser49Gly do gene do receptor beta-adrenérgico 1 a partir de uma amostra de 188 indivíduos da população do Estado do Rio de Janeiro. As frequências também foram analisadas a partir da estratificação da amostra por critério fenotípico em função do padrão de cor da pele em (negros e não negros) ou ancestralidade genética em (afrodescendente e não afrodescendente), definida através da informação dos marcadores de ancestralidade Indels e SNP de cromossomo Y, para avaliar se os padrões de ancestralidade ou cor da pele são fundamentais para a diferenciação e distanciamento genético. Fragmentos de interesse foram amplificados por PCR (reação de cadeia de polimerase) com primers específicos para o marcador Ser49Gly e as reações de genotipagem foram realizadas com enzimas de restrição Eco0109I. Os valores da heterozigosidade variaram entre 0,25-0,50 e 0,20-0,41 nos grupos estratificados por ancestralidade e cor da pele, respectivamente. No que diz respeito à análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg, não houve um desvio significativo na distribuição do marcador nas amostras gerais do Estado do Rio de Janeiro, ou mesmo nas amostras estratificadas. A distribuição dos alelos na amostra dos 188 indivíduos da população geral do Rio de Janeiro (AC_RJ) mostrou uma frequência de 80,30% e 19,70% para o alelo selvagem e mutado Ser49Gly, respectivamente. A comparação das análises sobre a distribuição das frequências alélicas para este marcador mostrou a ocorrência de diferenças significativas na distribuição das frequências alélicas entre negros e não negros e afrodescendentes e não afrodescendentes. A diferença significativa observada entre os negros e afrodescendentes, foi em menor grau de distanciamento. A informação obtida em relação à ancestralidade foi crucial para a obtenção dos dados sobre o aumento da variável mutada do polimorfismo Ser49Gly nas populações negras e afrodescendentes do Estado Rio de Janeiro. Tal evidência, em combinação com estudos clínicos podem contribuir para uma análise pormenorizada do padrão de susceptibilidade à doença em questão, em falhas do mecanismo deste receptor.