Papel de metaloproteases de Estreptococos do grupo B na interação,viabilidade celular e indução de apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais humanas

Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal.

Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.

Perfil de secreção de citocinas e de ativação de células endoteliais após interação com cepas selvagens e mutantes de Aspergillus fumigatus

Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

Estudo proteômico da interação do Aspergillus fumigatus com células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)

O Aspergillus fumigatus é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete, principalmente, pacientes de Unidades Hematológicas, como aqueles com neutropenia profunda e prolongada. Após a filamentação este fungo angioinvasivo é capaz de ativar e causar danos em células endoteliais de veia umbilical humana (HUVEC) que passam a expressar um fenótipo pró-trombótico. A ativação destas células, dependente de contato célulacélula, é mediada por TNF-α e caracterizada pela expressão de moléculas próinflamatórias, como citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão. Recentemente, nosso grupo comparou a ativação endotelial de HUVECs desafiadas com cepas selvagens e uma cepa mutante para o gene UGM1. Nestes experimentos a cepa mutante Δugm1, que apresenta um fenótipo de maior produção de galactosaminogalactana (GAG) na parede celular, mostrou um fenótipo hiperadesivo e uma capacidade maior de ativar células endoteliais. Entretanto, os receptores e as vias de sinalização envolvidos nesta ativação permanecem desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar as proteínas envolvidas nestes processos através do estudo das proteínas diferencialmente expressas nas HUVECs após a interação com A. fumigatus, usando a técnica proteômica 2D-DIGE. Brevemente, as HUVECs foram infectadas com tubos germinativos da cepa selvagem (AF293) e da cepa Δugm1 de A. fumigatus. Em seguida, as proteínas foram marcadas com diferentes fluorocromos e separadas por eletroforese bidimensional. A análise quantitativa foi realizada utilizando o software DeCyder. Foram identificadas por MS/MS cinco proteínas diferencialmente expressas, incluindo a galectina-1 e a anexina A2, ambas mais expressas após a interação, sendo a primeira ~25% mais expressa após a interação com a mutante Δugm1. Este trabalho propõe que a galectina-1 poderia ser o receptor endotelial para polímeros de galactose presentes na parede celular do A. fumigatus, e que a Anexina A2 poderia estar envolvida na sinalização intracelular em resposta a este patógeno. No entanto, experimentos complementares, em curso, são necessários para comprovar esta hipótese.

Estudo da expressão e participação de osteopontina durante a interação taquizoíto de Toxoplasma gondii célula hospedeira.

Toxoplasma gondii é um parasito do filo Apicomplexa que infecta uma grande variedade de hospedeiros, incluindo os humanos. O parasito invade a célula hospedeira por penetração ativa, com a participação das proteínas de suas organelas secretoras durante esse processo. Até o momento, somente um número limitado de proteínas secretoras tem sido descoberto, além disso, as moléculas efetoras envolvidas na invasão e sobrevivência do parasito não estão completamente compreendidas. A osteopontina (OPN) é uma glicofosfoproteína adesiva secretada, multifuncional, que contém o domínio arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) de ligação à integrina, que está envolvida em uma variedade de eventos fisiológicos e patológicos, incluindo sinalização e sobrevivência celular. Pela primeira vez, nós demonstramos pelas técnicas de imunofluorescência e imunocitoquímica ultraestrutural que há uma intensa marcação para uma proteína OPN-like nos grânulos densos de taquizoítos de T. gondii extracelulares. O western blotting e o RT-PRC confirmaram a expressão de OPN-like nos taquizoítos. Nossos resultados também mostram que após a invasão dos macrófagos, a proteína OPN-like está localizada na membrana do vacúolo parasitóforo. Esses dados sugerem que os grânulos densos secretam uma proteína OPN-like, e nós podemos especular que essa proteína participa durante o processo de interação do parasito com as células hospedeiras. .

Avaliação da influência da interação polímero-solvente sobre a porosidade de copolímeros de acrilonitrila e divinilbenzeno obtidos por polimerização em suspensão

Neste trabalho, copolímeros à base de acrilonitrila e divinilbenzeno foram sintetizados, utilizando a técnica de polimerização em suspensão, na presença de três agentes porogênicos diferentes (álcool isoamílico, metil-etil-cetona e tolueno). Esses copolímeros foram caracterizados por meio da determinação da densidade aparente, do volume e diâmetro de poros, por microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura e foram avaliados quanto à capacidade de inchamento em heptano e tolueno. O principal intuito dessa pesquisa foi correlacionar a formação da estrutura porosa desses materiais com os principais parâmetros de síntese (grau de diluição dos monômeros, poder solvatante do diluente e teor do agente de reticulação). Desses parâmetros, o que mais influenciou na formação da estrutura porosa desses materiais foi o poder solvatante do diluente. A teoria dos parâmetros de solubilidade de Hansen e Hildebrand foi utilizada com o intuito de fazer uma previsão das características porosas dos copolímeros à base de acrilonitrila e divinilbenzeno sintetizados na presença de três diluentes diferentes. Dentre esses diluentes, o álcool isoamílico foi o pior solvente para os copolímeros de AN-DVB, em todos os teores de agente de reticulação e em todas as diluições utilizadas. O tolueno foi o melhor solvente para os copolímeros que contêm altos teores de agente de reticulação. Estas observações estão de acordo com as previsões dos parâmetros de solubilidade de Hansen e Hildebrand. A metil-etil-cetona foi o melhor solvente para os copolímeros que contêm teores intermediários de agente de reticulação. Esta observação só está condizente com o parâmetro de solubilidade de Hansen.

Análise dinâmica de plataformas de aço para produção de petróleo com base na consideração do efeito da interação solo-estrutura

Atualmente, as tendências competitivas do mercado mundial, têm forçado os engenheiros estruturais a desenvolver soluções de projeto que acarretem em menor peso e custo de execução. Uma consequência direta desta nova tendência de projeto é o aumento considerável de problemas relacionados a vibrações de piso indesejadas. Por esta razão, os sistemas estruturais de pisos podem tornar-se vulneráveis a vibrações excessivas, como por exemplo, aquelas induzidas por equipamentos mecânicos (máquinas rotativas). Deste modo, este trabalho objetiva investigar o comportamento dinâmico de uma plataforma de aço para produção de petróleo, localizada na bacia de Santos (campo de Merluza), São Paulo, Brasil. Para tal, investiga-se a influência das ações dinâmicas oriundas dos equipamentos mecânicos localizados sobre os decks metálicos da plataforma. A resposta dinâmica do modelo estrutural foi determinada através de um extenso estudo numérico, a partir da análise de suas frequências naturais, deslocamentos, velocidades e acelerações de pico. Nesta investigação, as cargas dinâmicas provenientes dos equipamentos mecânicos (máquinas rotativas) foram aplicadas sobre o piso metálico do sistema estrutural. Com base obtenção da resposta dinâmica da estrutura (deslocamentos, velocidades e acelerações), foi possível avaliar a performance do modelo estrutural em termos de critérios de conforto humano e das tolerâncias máximas referentes aos equipamentos mecânicos, de acordo com normas e recomendações de projeto.

(Re)descobrindo o prazer da leitura: uma interação entre teoria de prática em sala de aula

A criança, nos primeiros anos de vida, entra em contato com a leitura pela via lúdica, no seio familiar. Ao ingressar na escola, nas séries iniciais, continua exposta a textos que têm como característica principal o lúdico e o prazeroso. Com o avançar das séries, a postura em relação à leitura vai mudando e passa a mote para a apresentação e desenvolvimento dos conteúdos curriculares. O gosto pela leitura que aproximou o discente do texto é aos poucos deixado de lado. O aluno vai perdendo o interesse pela leitura e já é lugar comum na escola, quiçá na sociedade atual, dizer que o aprendiz não gosta de ler, não sabe ler com competência, por isso, não consegue acompanhar as exigências escolares. Na prática docente, observa-se que os alunos leem, visto as numerosas publicações destinadas aos jovens, não leem o que a escola quer. Tal constatação leva a questionamentos acerca do problema e a pensar em um caminho para resgatar no discente a curiosidade, o gosto e o prazer pela leitura de um bom texto, fato corroborado pelos PCNs. Com o intuito de trabalhar essa nuança da leitura, que está relegada a segundo plano pela escola, decidiu-se pelo desenvolvimento de uma oficina de leitura com alunos do 8 ano do Ensino Fundamental de uma escola pública da cidade do Rio de Janeiro, organizada por gêneros textuais trabalhados um por vez, e levar os alunos a ler textos originais e completos, fugindo à fragmentação do livro didático. A seleção do material de leitura foi feita pela pesquisadora e, quando necessário, foi solicitada a colaboração dos jovens, além da utilização dos recursos disponíveis na escola. Adotou-se as posições teóricas de Mikhail Bakhtin (2006) acerca de língua, fala e enunciação; dialogismo e polifonia para corroborar as afirmações. No que se refere a texto, discurso e gêneros textuais, se tomou como base o trabalho de Coutinho (2004) e Marcuschi (2008). Para analisar as questões que envolvem leitura, principalmente, a escolar, foram consultados os PCNs e o trabalho de Silva (1998). Dentre outros. As atividades da oficina levaram à reflexão sobre as práticas de leitura na escola, pois, mesmo os PCNs propondo uma abordagem sociointeracionista, na realidade, não funciona. O livro didático ainda é a base do trabalho do professor. Outra forma de apresentação do texto em outros ambientes promoveu um trabalho produtivo no qual a maioria se envolveu e saiu da condição de leitores passivos a ativos e participativos. Houve diversas dificuldades, porém, ficou a certeza que se fez a diferença e se resgatou muito do leitor adormecido em cada aluno participante. As afirmações valem para esse pequeno grupo da investigação, não se podendo generalizar

Efeitos macrovasculares, microvasculares e interação leucócito-endotélio, na endotoxemia experimental após o uso de Dobutamina com e sem ressuscitação volêmica

Na sepse, o mecanismo desencadeador de morte é a disfunção múltipla de órgãos e sistemas. Com isso a microcirculação é considerada o motor na patogênese da sepse. A perfusão microcirculatória representa um dos principais objetivos para melhorar as taxas de sobrevida. Uma vez reconhecida a síndrome séptica, o protocolo clínico estabelece o uso de fluidoterapia com salina, de forma vigorosa na primeira hora e seguida de suporte inotrópico com Dobutamina. A partir daí foi levantada a hipótese das drogas β-agonistas serem relevantes na recuperação da microcirculação, antes mesmo de seu conhecido papel na recuperação do choque cardiogênico. Assim, estudar o papel da Dobutamina, um β-agonista, na resposta adrenérgica em situação de sepse se faz necessário e urgente e o entendimento de sua ação, associada à reposição volêmica, foi objeto deste estudo. Foram usados no presente estudo, 78 hamsters, induzida a endotoxemia com LPS (2mg/kg/de massa de peso corporal) e divididos em 9 grupos: controle (n=10), endotóxico(n=10), endotóxico tratados com Dobutamina na dose de 5 e 15 μg /kg/min (n=10), Isoproterenol(n=10), ressuscitação volêmica (n=10) e ressuscitação volêmica associada à Dobutamina 5 (n=10) e 15 μg/kg/min (n=4) e Isoproterenol (n=4). Foram comparados os resultados de recuperação da densidade capilar funcional ao longo do tempo entre os grupos, e obteve-se resultado estatisticamente significativo no grupo em que se usa Dobutamina de 5μg/kg/min associada à ressuscitação volêmica p< 0,05. Em conclusão este estudo mostra que o papel da ressuscitação volêmica é crucial na resposta da microcirculação para melhorar a densidade capilar funcional, que a velocidade da hemácia capilar tem relação direta com a melhora na perfusão tecidual e que a associação de recuperação volêmica com solução salina e Dobutamina na dose de 5 μg /kg /min melhora significativamente sua resposta e melhora a perfusão.

A multimodalidade no livro didático de inglês como língua estrangeira: padrões de representação narrativa e de interação

O presente trabalho visa a contribuir com o avanço das pesquisas na área de multimodalidade, mais especificamente na área aplicada ao contexto de ensino de língua estrangeira. Analisa-se uma amostra de textos multimodais em um livro didático produzido e utilizado no Brasil como ferramenta para o ensino de inglês como língua estrangeira para alunos adultos iniciantes em um curso livre. Tendo em vista a preocupação, apontada no próprio material didático, em atender às necessidades e expectativas desses alunos, objetiva-se, através desta investigação: verificar como se dá a interação entre o verbal e o visual no livro didático selecionado; verificar como essa interação contribui para atingir os objetivos pedagógicos propostos pelo material; e, por fim, contribuir, de alguma maneira, para o letramento multimodal de alunos em língua estrangeira. Tais objetivos determinam a natureza híbrida desta pesquisa que, além da sua dimensão analítico-descritiva, apresenta também uma dimensão pedagógica, que visa a apresentar propostas de trabalho multimodal com algumas das atividades selecionadas para análise. A seleção dos textos multimodais para a composição do corpus desta pesquisa foi baseada na observação da recorrência de imagens com determinados personagens ao longo do livro. Tal recorrência provocou questionamentos que só poderiam ser respondidos a partir da análise desses personagens representados em situações de (inter)ação, o que deu lugar à seleção das representações narrativas que os incluíssem. Os personagens em questão são desenhos criados para os fins pedagógicos do material e são representados em situações sociais muito limitadas: a maior parte dessas representações parece formar uma sequência narrativa cuja interação acontece em uma festa; entre as outras representações, que não representam a referida festa como contexto, incluem-se interações no escritório, no restaurante, no parque e ao telefone. Uma análise da representação visual desses atores sociais revelou que, apesar da inclusão de uma negra entre os personagens, e a consequente suposta visão multicultural transmitida com essa inclusão, os participantes representam um grupo homogêneo, pertencentes ao mesmo segmento social, que só interagem entre eles mesmos em situações sociais limitadas, não sendo, portanto, representativos da diversidade étnica, social e cultural do Brasil, ou dos países em que o inglês é falado. Após a análise da representação dos atores sociais, analisam-se, com vistas a atingir os objetivos deste trabalho, os padrões de representação e de interação nos textos multimodais selecionados, segundo categorias do quadro da multimodalidade de van Leeuwen (1996). Verifica-se, a partir de tais análises, que o verbal e o visual nem sempre apresentam uma relação direta, e que, quando apresentam, tal relação não é explorada pelo material, tornando o visual um elemento meramente decorativo que, na maioria das vezes, em nada contribui para o desenvolvimento das unidades. Por essa razão, e por se tratar de uma pesquisa centrada no contexto pedagógico, propõem-se, ao final das análises, atividades de exploração de alguns dos textos multimodais analisados, visando à formação multimodal do aluno em língua estrangeira

Características biogeoquímicas da interação atmosfera criosfera na Antártica ocidental

O manto polar antártico retêm informação paleoclimatologica por entres suas camadas de neve e gelo. O gelo antártico tem revelado a base de dados paleoclimática de maior resolução para os últimos 800 mil anos. Os padrões de transporte atmosférico refletem a composição e a fonte do particulado encontrado na neve e no gelo do continente Antártico. Estando relacionado a processos climáticos, as características desse transporte alteram em quantidade e qualidade as espécies químicas que se depositam sobre o manto de gelo. Dessa forma, o estudo dos depósitos de particulado ao longo das camadas de neve/gelo na Antártica pode sugerir mudanças nos padrões de transporte atmosférico. Atualmente a comunidade científica discute as diferenças de padrões climáticos entre o leste e o oeste antártico. Enquanto de forma geral observa-se instabilidade no setor oeste, o clima da antártica oriental demonstra relativa estabilidade climática. Neste estudo, analisamos dois testemunhos de gelo recente de duas regiões com características climáticas diferentes do continente Antártico. No Platô Detroit situado na Península Antártica (6410′S/0600′O), analisamos a variabilidade de Black Carbon (BC) ao longo de 20 metros de neve. O BC encontrado na Península Antártica apresentou baixas concentrações comparáveis as encontradas no gelo do Artico período pré-industrial. Nossos resultados sugerem que sua variabiliade corresponde à sazonalidade dos períodos de queimada nos continentes do Hemisfério Sul. No interior do continente Antártico, analisamos o particulado em geral por um processo de microanálise ao longo de um testemunho de 40 metros extraído em Mont Johns (79o55′S/09423′O). Encontramos uma tendência negativa na deposição de poeira mineral (AlSi) entre 1967 e 2007. Nossos resultados sugerem que esta tendência seja resultado de um crescente isolamento atmosférico da região central do continente antártico pelo aumento da intensidade dos ventos ao redor da Antártica. Este aumento na intensidade dos ventos reflete por sua vez o resfriamento da alta atmosfera no centro antártico causado pela depleção da camada de ozônio na região. Adicionalmente, amostras de diferentes microambientes de Patriot Hills (8018′S/08121′O) foram coletadas de maneira asséptica para análise microbiológica. As amostras foram cultivadas em meio R2 e paralelamente o DNA total extraído foi sequenciado pela técnica de pirosequenciamento. Os resultados preliminares desta analise mostram grande riqueza de espécies dos mais variados grupos. Os resultados deste trabalho caracterizam três diferentes parâmetros relacionados a deposição atmosférica em duas áreas pouco exploradas e de grande interesse científico do continente antártico.

Estudo da virulência, adesão e características fenotípicas de isolados do complexo Sporothrix

A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica, que envolve o tecido cutâneo e subcutâneo, e que pode afetar seres humanos e animais. Esta micose sempre foi atribuída a um único patógeno, o Sporothrix schenckii, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, nos últimos anos, foi demonstrado que isolados identificados como S. schenckii apresentavam grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies. Esta doença é causada pela implantação traumática do patógeno fúngico, porém, os mecanismos de invasão e disseminação deste microorganismo, bem como as moléculas envolvidas nestes processos, ainda são pouco conhecidos. Com base nessas informações, este trabalho visa identificar moléculas de superfície deste patógeno envolvidas na interação deste fungo com proteínas matriciais, bem como analisar diferenças fenotípicas entre espécies do denominado complexo Sporothrix. Foram utilizados, neste estudo, cinco isolados de Sporothrix spp., sendo três isolados clínicos, um isolado ambiental e um isolado de gato. A virulência de cada isolado foi comparada à capacidade adesiva à proteína matricial fibronectina. Foi observado que os isolados com maior capacidade infectiva eram os que apresentavam maior capacidade adesiva à fibronectina. Verificamos então a expressão de adesinas para fibronectina na superfície de cada isolado, por Western blot, e observamos que os isolados mais virulentos e com maior capacidade adesiva expressavam mais adesinas para fibronectina. Bandas reativas com o anticorpo monoclonal contra adesina gp70 (mAb P6E7) foram reveladas nos extratos de parede celular dos isolados estudados. Análises por microscopia confocal revelaram a co-localização da gp70 com a adesina para fibronectina na superfície dos isolados. Análises filogenéticas demonstraram que os isolados estudados possuíam diferenças genotípicas capazes de agrupá-los em duas espécies, S. schenckii e S. brasiliensis. Esta análise revelou que o isolado avirulento era S. brasiliensis e não S. schenckii, como se pensava. Este dado novo nos levou a verificar se a virulência e as características fenotípicas estariam relacionadas ao genótipo. A avaliação da virulência mostrou que outro isolado de S. brasiliensis era tão virulento quanto os isolados de S. schenckii. Além disso, as características morfológicas, como tamanho, forma e perfil de crescimento, das fases miceliana e leveduriforme, e características microscópicas da parede das leveduras também foram avaliadas. Porém, não foi possível correlacionar, de forma clara, a morfologia celular com a especiação do gênero Sporothrix. A expressão da gp70 na superfície das duas espécies foi verificada e foi observado que o isolado virulento de S. brasiliensis quase não expressa a gp70 na sua superfície em contraste com o isolado avirulento de S. brasiliensis, que além de expressar esta glicoproteína em grande quantidade ainda a libera para o meio extracelular. Este estudo mostra que há uma correlação direta entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre características fenotípicas e genótipo.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Ontogênse do sorriso no contexto da interação mãe-bebê

Esta tese teve como objetivos: (I) propor uma articulação teórica para o estudo do sorriso contemplando a dimensão histórica, sociocultural e evolutiva da espécie humana e seu aparato biológico; (II) realizar dois estudos empíricos, um longitudinal, da terceira semana ao sexto mês de vida de dois bebês e outro transversal, com bebês de um, dois e cinco meses de nascidos, com o propósito de: (II.1) investigar se há algum padrão de sorrisos em termos de freqüência, duração e características morfológicas, e se ocorrem transformações nesse padrão nos seis primeiros meses de vida; (II.2) analisar padrões de sorriso apresentados na presença de comportamentos afetivos da mãe, nesse período; e (II.3) verificar se os bebês respondem de modo contingente, com sorrisos, aos comportamentos afetivos da mãe, e se há padrões diferenciados por tipo de sorriso. Participaram do estudo longitudinal duas díades mãe-bebê, filmadas em suas residências, semanalmente. Do estudo transversal, para cada grupo de diferentes idades, participaram vinte díades mãe-bebê, também filmadas em suas residências. As categorias de observação, comuns aos dois estudos, foram codificadas em duas partes, sendo a referente aos sorrisos do bebê com comportamentos mutuamente exclusivos e exaustivos. Os índices de Kappa de Cohen e de concordância indicaram boa fidedignidade entre os observadores. Entre outras evidências, verificou-se tendência de trajetória de curva ascendente para os sorrisos dos bebês no período estudado, F(1,22) = 6,77, p<0,05, para um dos bebês do estudo longitudinal, e, F(1,23) = 7,85, p<0,05, para o outro. Os dois bebês revelaram uma tendência particular a exibir com mais freqüência um ou dois tipos de sorrisos. Os sorrisos da mãe, como demais comportamentos afetivos, mostraram-se potenciais eliciadores de sorrisos de tipos variados nos bebês. Correlações significativas foram encontradas, na pesquisa longitudinal, entre os tipos mais freqüentes de sorrisos dos bebês e os sorrisos de suas mães (r=0,77, p<0,0017, para um dos bebês, e r=0,62, p<0,0017, para o outro). Também no estudo transversal foi verificada correlação entre o sorriso simples e o sorriso da mãe (r=0,70, p<0,0007). Sorrisos de diferentes tipos foram exibidos pelos bebês, tanto no estudo longitudinal, quanto no transversal, como respostas contingentes aos comportamentos maternos observados. Esses e outros resultados indicam uma associação significativa entre os sorrisos dos bebês e comportamentos afetivos das mães. A relevância da temática desse trabalho contrasta com a carência de estudos brasileiros sobre o tema. Entende-se que essa lacuna precisa ser superada, e esta tese representou um movimento nessa direção.

Estudo da interação de antipsicóticos atípicos e albumina sérica com base em modelos matemáticos e espectrofluorimétricos

Os antipsicóticos são drogas utilizadas no tratamento de muitos transtornos psiquiátricos, sendo classificados em dois grupos: típicos e atípicos. Os típicos formam o grupo de drogas que bloqueiam especialmente os receptores de dopamina e, por isto, causam efeitos colaterais característicos, que se manifestam através de sintomas extrapiramidais e podem terminar em discinesia tardia. Os atípicos apresentam eficácia antipsicótica similar à dos antipsicóticos típicos, mas produzem menos efeitos colaterais extrapiramidais e não causam discinesia tardia. Os antipsicóticos se ligam às proteínas plasmáticas, principalmente a albumina, a qual representa cerca de 60% do total das proteínas no soro humano. Neste trabalho estudamos os processos de interação de duas drogas antipsicóticas atípicas, risperidona e sulpirida, com as albuminas séricas humana (HSA) e bovina (BSA), através da técnica de supressão da fluorescência intrínseca do triptofano. A partir dos espectros de fluorescência, a análise dos dados foi feita obtendo-se os gráficos e as constantes de Stern-Volmer. A análise da supressão da fluorescência foi feita a partir da média aritmética dos dados oriundos dos experimentos realizados em cada condição adotada. Como a molécula da sulpirida é fluorescente desenvolvemos uma modelagem matemática do processo de interação, que nos permitiu então obter os dados referentes à supressão da fluorescência da proteína. Os resultados mostraram que a risperidona e a sulpirida suprimem a fluorescência de ambas albuminas por um processo de quenching estático, formando complexos droga-albumina. A risperidona tem uma afinidade com a HSA cerca de 6,5 vezes maior do que a sulpirida, a 37 oC. As constantes de associação calculadas para a interação risperidona-HSA, através da Teoria de Stern-Volmer, foram 1,43 ( 0,05) x 105 M-1, a 37 C, e 2,56 ( 0,09) x 105 M-1, a 25 C1; e para a sulpirida, 2,20 ( 0,08) x 104 M-1, a 37 C, e 5,46 ( 0,20) x 104 M-1, a 25 C. Como a taxa de quenching da BSA foi maior do que a da HSA, sugerimos que o sítio primário para a risperidona nas albuminas esteja localizado mais próximo ao domínio do triptofano 134 da BSA do que do domínio do triptofano 212 da HSA. O mesmo sugerimos com relação ao sítio para a sulpirida a 37 C.