Relação entre fatores genéticos envolvidos em vias metabólicas mitocondriais e a doença de Parkinson

A doença de Parkinson (DP) é uma das desordens neurodegenerativas mais comuns associada ao envelhecimento, alcançando 2% aos 70 anos. É uma doença caracterizada pela degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos nigrais nos gânglios basais e pela presença de inclusões protéicas citoplasmáticas denominadas corpúsculos e neuritos de Lewy nos neurônios sobreviventes. A etiologia da DP é pouco conhecida, sendo considerada, na maioria dos casos, idiopática. Conhecimentos alcançados nos últimos 15 anos sobre a base genética da DP demonstram, claramente, que os fatores genéticos desempenham um importante papel na etiologia desta desordem. Neste trabalho, rastreamos mutações nos genes que codificam proteínas participantes de vias metabólicas mitocondriais (Parkin, PINK1 e DJ-1) em 136 pacientes brasileiros com manifestação precoce da DP, através do sequenciamento automático e da técnica de MLPA. Avaliamos a presença de variantes de sequência por meio do sequenciamento dos exons 1 a 12 do gene Parkin e dos exons 1 a 8 do gene PINK1. Em Parkin foram identificadas três mutações patogênicas ou potencialmente patogênicas, ambas em heterozigose: p.T240M, p.437L e p.S145N. Em PINK1 não encontramos variantes de ponto patogênicas. Através da técnica de MLPA investigamos alterações de dosagem nos genes Parkin, PINK1 e DJ-1. Identificamos cinco alterações no gene Parkin em quatro pacientes: uma duplicação heterozigota do exon 4 no paciente PAR2256, uma deleção heterozigota do exon 4 no probando PAR2099, uma deleção homozigota do exon 4 na paciente PAR3380 e um probando heterozigoto composto (PAR2396) com duas alterações, uma duplicação do exon 3 e uma deleção dos exons 5 e 6. No gene PINK1 identificamos uma deleção heterozigota do exon 1, que nunca foi descrita na literatura, em um paciente (PAR2083). Não encontramos alteração quantitativa no gene DJ-1. Neste estudo obtivemos uma frequência total de mutações patogênicas (pontuais e de dosagem) nos genes estudados de 7,3%, sendo 6,6% no gene Parkin e 0,7% no gene PINK1.

Papel de metaloproteases de Estreptococos do grupo B na interação,viabilidade celular e indução de apoptose e necrose em células endoteliais e epiteliais humanas

Estreptococos do grupo B (EGB) é a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como patógeno responsável por infecções invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doenças crônicas). Os EGB produzem inúmeras enzimas extracelulares, várias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e são importantes durante a interação EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doença. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases estão envolvidas em várias vias metabólicas em diferentes tipos celulares. Por esta razão, nós decidimos investigar o possível envolvimento de metaloproteases de EGB durante a interação celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epitélio respiratório (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) não induziu alterações no crescimento bacteriano, mas promoveu alterações na expressão de proteínas de superfície, capacidade adesiva e perfil de sobrevivência intracelular do patógeno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das células HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana estão envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a disseminação bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e células A549 após 24h de incubação, respectivamente. Nós também observamos redução da pró-caspase-3 após infecção das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativação da caspase-3. Além disso, o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax e diminuição dos níveis da proteína anti-apoptótica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apoptótico mitocondrial (via intrínseca). A melhor compreensão das bases moleculares da patogênese do EGB contribui para identificar novas moléculas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terapêuticos ou imunoprofiláticos contra a doença causada por esse patógeno neonatal.

Estudo das alterações cardiovasculares e metabólicas em modelo experimental de programação metabólica: efeito de extrato da casca de uva Vitis vinífera

Estudos epidemiológicos e experimentais têm sugerido que fatores de risco cardiovasculares podem ser parcialmente atribuídos às influências do ambiente em que vive o indivíduo, e que a nutrição materna influencia na programação de alterações metabólicas e cardiovasculares no indivíduo adulto e que caracterizam a síndrome metabólica (SM). Em contrapartida, estudos prévios de nosso laboratório demonstram que o extrato da casca de uva Vitis labrusca (GSE) possui efeito vasodilatador, antihipertensivo e antioxidante. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento oral com GSE (200mg/kg/dia), sobre as alterações cardiovasculares e metabólicas e estresse oxidativo observados na prole adulta (fêmea e machos) com 3 e 6 meses, cujas mães foram submetidas a uma dieta rica em gordura (hiperlipídica) durante a lactação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (7% de gordura); controle + GSE (7% de gordura + GSE), hiperlipídica (24% de gordura); hiperlipídica + GSE (24% de gordura + GSE) durante a lactação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados aos 3 ou 6 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram avaliados o peso corporal, adiposidade (intra-abdominal e gonadal), níveis plasmáticos de colesterol total, triglicerídeos, glicose e insulina, e a resistência à insulina (RI) foi calculada pelo índice de HOMA IR. As expressões do IRS-1, Akt e GLUT-4 foram determinadas em músculo soleus. O dano oxidativo, níveis de nitritos e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de LAM. A PAS e tecido adiposo foram aumentados nas proles adultas de ambos os sexos e idades do grupo hiperlipídico e revertidos pelo tratamento com o GSE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM não foi diferente entre os grupos de ambos os sexos, mas foram reduzidas com o envelhecimento. Nas proles fêmeas e machos do grupo hiperlipídico também foram observados o aumento dos níveis de triglicerídeos, de glicose e RI em ambas as idades e foram reduzidos pelo GSE. No grupo hiperlipídico houve redução nas expressões de IRS-1, Akt e GLUT-4 e o GSE reverteu estas expressões. Os níveis plasmáticos de malondialdeído estavam aumentados e os níveis de nitrito diminuídos no grupo hiperlipídico, de ambos os sexos e idades e foram revertidos pelo GSE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no mesentério foram reduzidas no grupo hiperlipídico e restauradas pelo GSE. Em conclusão, O GSE parece proteger as proles fêmeas e machos, cujas mães foram expostas a uma dieta hiperlipídica durante a lactação, dos fatores de riscos cardiovasculares, proporcionando uma fonte alternativa nutricional para a prevenção da SM.

Alterações estruturais pancreáticas e metabólicas em camundongos C57BL/6 alimentados com dieta de alta densidade energética

Camundongos C57BL/6 machos com oito semanas de idade alimentados com diferentes dietas durante 16 semanas: de alta densidade energética (ADE, 26% das calorias de carboidrato, 60% de gordura e 14% de proteína) ou dieta padrão (CO, 76% das calorias de carboidrato, 10% de gordura e 14% de proteína). Comparado ao grupo CO, o grupo ADE apresentou maior ganho de massa e maior depósito de tecido adiposo, bem como maiores níveis plasmáticos de triglicerídeos, LDL-c, ALT, AST e fosfatase alcalina e com maiores níveis de corticosterona plasmática, glicose de jejum e insulina com uma consequente resistência à insulina (avaliado pelo HOMA-IR). No TOTG, a glicose plasmática aumentou ao máximo após 15 min. da administração de glicose oral em ambos os grupos. Entretanto os níveis de glicose foram maiores no grupo ADE que no grupo CO (P<0.0001). O clearance de glicose no grupo ADE foi reduzido, permanecendo aumentado após 120 min. (P<0.001), caracterizando intolerância a glicose no grupo ADE. O teste intraperitoneal de tolerância à insulina mostrou uma rápida redução na glicose plasmática após 15 minutos da administração de insulina em ambos os grupos, mas significativamente aumentada no grupo ADE (P<0.0001), permanecendo desta forma até os 120 min. após a administração. Concluindo, camundongos C57BL/6 respondem a dieta ADE desenvolvimento os sinais e sintomas associados à síndrome metabólica observada em humanos. Por conseguinte, este modelo animal poderá ajudar-nos a compreender melhor as alterações em órgãos alvos associadas com a síndrome metabólica, assim como a possibilidade de tratamentos diferentes.

Exposição ao material particulado 2,5 m coletado em vias de alto tráfego da cidade do Rio de Janeiro: avaliação mutagênica, genotóxica e determinação de risco à saúde induzido por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

A mutagenicidade do material particulado é atribuída primeiramente aos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPA). Investigamos a atividade mutagênica do material particulado (MP2,5) em amostras coletadas em três pontos da cidade do Rio de Janeiro. As coletas foram realizadas com auxílio de um amostrador de grande volume na Avenida Brasil, no campus da Universidade do Estado do Rio de Janeiro e no Túnel Rebouças em filtros de fibra de vidro. Metade de cada filtro foi submetido à extração por sonicação com o solvente diclorometano. Seis HPA foram identificados e quantificados por cromatografia gasosa com espectrometria de massa (GC/MS). Após a análise química as concentrações dos HPA obtidos foram correlacionados ao fatores físicos, além de ser realizado avaliação de risco para cada HPA estudado. Linhagens de Salmonella typhimurium (TA98 e derivadas TA98/1.8-DNP6, YG1021 e YG1024) foram utilizadas no ensaio de mutagenicidade e tratadas (10-50 g/placa) com extrato orgânico na presença e na ausência de metabolização exógena. Células de raiz de cebola foram tratadas com extratos orgânicos nas concentrações (5-25g/mL). A alta umidade encontrada no Túnel Rebouças pode ter influenciado na deposição de cinco dos seis HPA estudados em material particulado. Além disso, em diferentes condições de tráfego, motoristas de ônibus que cruzam a Avenida Brasil e o Rebouças túnel estão expostos ao risco induzidos por HPA na ordem de 10-6. Mutagenicidade foi detectada tanto na presença quanto na ausência de metabolização, para as linhagens YG1021 e YG1024 nos três pontos, sugerindo a presença de nitro e amino derivados de HPA. As amostras do Túnel Rebouças apresentaram os maiores valores para rev/g e rev/m3. Estes resultados podem estar relacionados ao longo trajeto e a restrita ventilação. Efeito citotóxico foi detectado pelo ensaio Allium cepa nos três pontos de monitoramento. Além disso os extratos orgânicos provenientes das coletas da Avenida Brasil, UERJ e do Túnel Rebouças induziram efeito clastogênico em células de raiz de Allium cepa

Velocidade da onda de pulso em adultos jovens acompanhados por 18 anos: impacto de variáveis pressóricas, antropométricas, metabólicas, inflamatórias e de função endotelial. Estudo do Rio de Janeiro.

Dados sobre a avaliação não invasiva da rigidez vascular e suas relações com variáveis de risco cardiovascular são escassos em jovens. Objetiva avaliar a relação entre a velocidade de onda de pulso (VOP) e a pressão arterial (PA), variáveis antropométricas, metabólicas, inflamatórias e de disfunção endotelial em indivíduos adultos jovens. Foram estudados 96 indivíduos (51 homens) do Estudo do Rio de Janeiro, em duas avaliações, A1 e A2, com intervalo de 17,691,58 anos (16 a 21 anos). Em A1 foram avaliados em suas escolas (10-15 anos - média 12,421,47 anos) e em A2 foram novamente avaliados em nível ambulatorial (26-35 anos - média 30,091,92 anos). Em A1 foram obtidos pressão arterial (PA) e índice de massa corporal (IMC). Em A2 foram obtidos a velocidade da onda de pulso (VOP)-método Complior, PA, IMC, circunferência abdominal (CA), glicose, perfil lipídico, leptina, insulina, adiponectina, o índice de resistência à insulina HOMA-IR, proteína C-Reativa ultrassensível (PCRus) e as moléculas de adesão E-selectina, Vascular Cell Adhesion Molecule-1(VCAM-1) e Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1). Foram obtidos, ainda, a variação da PA e do IMC entre as 2 avaliações. Em A2 os indivíduos foram estratificados segundo o tercil da VOP para cada sexo. Como resultados temos: 1) Os grupos foram constituídos da seguinte forma: Tercil 1:homens com VOP < 8,69 m/s e mulheres com VOP < 7,66 m/s; Tercil 2: homens com VOP ≥ 8,69 m/s e < 9,65m/s e mulheres com VOP ≥ 7,66 m/s e < 8,31m/s;Tercil 3:homens com VOP ≥ 9,65 m/s e mulheres com VOP ≥ 8,31 m/s. 2) O grupo com maior tercil de VOP mostrou maiores médias de PA sistólica (PAS) (p=0,005), PA diastólica (PAD) (p=0,007), PA média (PAM) (p=0,004), variação da PAD (p=0,032), variação da PAM (p=0,003), IMC (p=0,046), variação do IMC (p=0,020), insulina (p=0,019), HOMA-IR (p=0,021), E-selectina (p=0,032) e menores médias de adiponectina (p=0,016), além de maiores prevalências de diabetes mellitus/intolerância à glicose (p=0,022) e hiperinsulinemia (p=0,038); 3) Houve correlação significativa e positiva da VOP com PAS (p<0,001), PAD (p<0,001), PP (p=0,048) e PAM (p<0,001) de A2, com a variação da pressão arterial (PAS, PAD e PAM) (p<0,001) entre as duas avaliações, com o IMC de A2 (p=0,005) e com a variação do IMC (p<0,001) entre as duas avaliações, com CA (p=0,001), LDLcolesterol (p=0,049) e E-selectina (p<0,001) e correlação negativa com HDLcolesterol (p<0,001) e adiponectina (p<0,001); 4)Em modelo de regressão múltipla, após ajuste do HDL-colesterol, LDLcolesterol e adiponectina para sexo, idade, IMC e PAM, apenas o sexo masculino e a PAM mantiveram correlação significativa com a VOP. A VOP em adultos jovens mostrou relação significativa com variáveis de risco cardiovascular, destacando-se o sexo masculino e a PAM como importantes variáveis no seu determinismo. Os achados sugerem que a medida da VOP pode ser útil para a identificação do acometimento vascular nessa faixa etária.

Predação, eutrofização e respostas metabólicas em comunidades incrustantes de substratos artificiais na Baía da Ilha Grande, RJ

As comunidades marinhas são afetadas por diversos fatores, que dentro do contexto de estrutura trófica, podem ser divididos em forças bottom-up (forças ascendentes), como por exemplo, a disponibilidade de nutrientes, e forças top-down (forças descendentes), como por exemplo, a predação. Além de modificações na estrutura das comunidades e populações de organismos, essas forças podem influenciar a produção de metabólitos secundários pelos organismos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito das perturbações ambientais geradas pelas manipulações separadas e interativas de exclusão de macropredadores e enriquecimento com nutrientes sobre a estrutura e sobre as respostas metabólicas de comunidades marinhas incrustantes de substratos artificiais no costão rochoso de Biscaia, Baía da Ilha Grande, RJ. O desenho experimental utilizou blocos de concreto como substrato artificial, os quais foram espalhados aleatoriamente na região de infralitoral do costão rochoso. O experimento compreendeu o uso de blocos Controle (ausência de manipulação) e quatro tratamentos, todos com cinco réplicas cada. Os tratamentos foram: tratamento Exclusão de predação (gaiola contra a ação de macropredadores), tratamento Nutriente (sacos de fertilizante de liberação lenta), tratamento Nutriente + exclusão de predação (gaiola contra ação de macropredadores e sacos de fertilizante de liberação lenta) e o tratamento Controle de artefatos (gaiola semifechada para avaliar geração de artefatos). Uma área de 15 x 15 cm do bloco foi monitorada a cada 20 dias, totalizando dez medições. Foram utilizados métodos de monitoramento visual e digital de porcentagem de cobertura por espécie. O enriquecimento com nutrientes foi avaliado através de medições da concentração dos nutrientes Ortofosfato, Nitrato, Nitrito e Amônio na água do entorno do bloco. Para analisar os possíveis artefatos foi realizado experimento de fluxo de água (método Clod card) e a luminosidade dentro das gaiolas foi medida. Os dados demonstraram modificações na estrutura das comunidades bentônicas incrustantes dos substratos artificiais devido às manipulações realizadas, ou seja, pelo enriquecimento com nutrientes, pela exclusão de predação e pela interação entre os dois fatores (Nutriente + exclusão de predação). Além disso, diferenças metabólicas foram detectadas nas substâncias extraídas dos organismos dos diferentes tratamentos do experimento. Esses resultados indicam a existência de controle top-down e bottom-up sobre a comunidade bentônica do local.

Óleo de peixe (fonte de ácidos graxos n-3) atenua inflamação das vias aéreas e hiper-reatividade pulmonar induzida por alérgeno em camundongos

O óleo de peixe é rico em ácidos graxos poli-insaturados (AGPI) n-3 e vem sendo apontado como anti-inflamatório associado à melhora de diversas doenças de natureza inflamatória. No presente estudo, objetivou-se avaliar a influência do óleo de peixe sobre a inflamação pulmonar e hiper-reatividade em camundongos ativamente sensibilizados desafiados com ovoalbumina (OVA). Camundongos A/J machos foram alimentados com dieta standard-chow (SC) ou dieta rica em óleo de peixe (Px) durante 8 semanas. Após 4 semanas do início da dieta, cada grupo foi subdividido aleatoriamente para ser desafiado com salina (SC-SAL e PX-SAL) ou ovoalbumina (SC-OVA e PX-OVA). A função pulmonar (resistência e elastância) foi avaliada através de pletismografia invasiva, na condição de aerolização ou não com metacolina 24 horas após o último desafio antigênico. Foi realizado lavado broncoalveolar (LBA) para contagem de leucócitos e quantificação de eotaxina-2. A deposição de muco e de matriz peribronquiolar e o infiltrado de eosinófilos foram quantificados no tecido pulmonar. Foram avaliados interleucina (IL)-13 através de imunohistoquímica e NFκB, GATA-3 e PPARγ, por western-blotting. O desafio com OVA resultou em aumento da infiltração de eosinófilos, elevada produção de citocinas inflamatórias, remodelamento pulmonar, produção de muco e hiper-reatividade das vias aéreas. Detectou-se aumento na expressão dos fatores de transcrição NFκB e GATA-3 nos camundongos do grupo sensibilizado e desafiado com OVA em comparação aos controles. Todas essas alterações foram atenuadas nos camundongos que receberam dieta com óleo de peixe. Expressão elevada de PPARγ foi detectada nos pulmões dos camundongos dos grupos alimentados com óleo de peixe. Em conclusão, nossos resultados mostram que a ingestão de óleo de peixe atenuou as características clássicas do quadro asmático através da modulação da síntese de mediadores inflamatórios, via regulação negativa de NFκB e GATA-3 e regulação positiva de PPARγ. O óleo de peixe parece ser uma terapia alternativa para o controle e tratamento da asma.

Efeitos da ingestão materna de sorbitol na lactação sobre o perfil nutricional, bioquímico e toxicológico das proles amamentadas

Sorbitol é um poliol encontrado em produtos para fins especiais, como diet e light, Dentro deste contexto, incluem-se as lactantes como grandes consumidoras, almejando o retorno mais rápido ao peso pré-gestacional. Devido à grande carência em dados referentes às consequências metabólicas do consumo excessivo destes tipos de produtos, o objetivo deste trabalho foi avaliar os possíveis efeitos da ingestão materna de sorbitol na lactação sobre os perfis nutricional, bioquímico e toxicológico nas proles amamentadas. O teste da Salmonella/microssoma foi utilizado, inicialmente, na avaliação mutagênica e citotóxica com linhagens de S. enterica sorovar Typhimurium (TA97, TA98, TA100, TA102, TA104 e TA1535). Verificamos a capacidade de reversão da mutação (I.M.) e sobrevivência (%), em diferentes concentrações (0,4; 4; 40; 400; 4000 e 5000 μg/placa). Os resultados foram considerados positivos para valores de I.M. ≥ 2,0. Ratas wistar lactantes (6 por grupo experimental), cada uma com 6 filhotes, receberam sorbitol (0,00015 mg/g/dia; 0,0015 mg/g/dia e 0,15 mg/g/dia), nos primeiros 14 dias da lactação. Neste período, avaliamos a biometria das mães e proles, consumo de ração e ingestão hídrica das mães. Após a lactação, as ratas mães foram ordenhadas, e, junto com as proles, sacrificadas por punção cardíaca, para coleta de sangue total. Os fígados das proles foram submetidos ao método de perfusão, para obtenção de hepatócitos em cultura primária, ao final dos 14 dias de lactação. Os fêmures das proles foram retirados, para obtenção da medula óssea. A bioquímica de sangue das proles (glicose, triglicerídeo, colesterol total, LDL, proteínas totais, albumina, ALT, AST, cálcio total e ionizado) foi analisada, assim como a bioquímica do leite ordenhado (triglicerídeos). Os testes do micronúcleo em medual óssea e hepatócitos, assim como o teste Cometa em sangue total, foram utilizados para avaliação genotóxica e citotóxica, de acordo com as diretrizes da OECD. Os resultados mostraram que, em concentrações mais baixas (0,00015 e 0,0015 mg/g), o sorbitol induziu o ganho de peso, principalmente na menor concentração (0,00015 mg/g), e alterações no perfil lipídico do sangue em todas as concentrações. As quantidades de triglicerídeo no leite variaram em função da dose ingerida, reduzida na maior concentração (0,15 mg/g) e aumentada na menor (0,00015 mg/g). A maior concentração (0,15 mg/g) resultou em perda de peso das mães e proles, diminuição de proteínas viscerais totais, albumina e aumento de enzimas hepáticas (ALT e AST) nas proles. Os resultados do teste da Salmonella/microssoma não indicaram mutagenicidade, entretanto, uma relação de dependência entre dose e Índice de Mutagenicidade (I.M.). Ambos os testes, micronúcleos de medula óssea e hepatócitos, apresentaram uma citotoxicidade dose dependente, estatisticamente significativa em relação ao grupo controle, corroborando com a genotoxicidade do teste Cometa e dependência de dose encontrada no teste da Salmonella/microssoma. Em concentrações mais baixas, parece existir modulação das vias lipogênicas, em contrapartida, nas mais altas a toxicidade parece dificultar tais alterações, induzindo o efeito contrário. Concluimos que o consumo excessivo de sorbitol resulta em alterações metabólicas e toxicológicas em lactentes, mesmo sendo considerado seguro pelo FDA e ANVISA.

Avaliação do papel do óxido nítrico no comprometimento da função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas em camundongos estimulados com sílica

Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico.

Modulação das vias de sinalização intracelulares pelo sistema NAD(P)H oxidase em melanoma humano

Evidências têm mostrado que as espécies reativas de oxigênio (ROS) geradas pela NAD(P)H oxidase são importantes moduladores de diversas funções celulares como migração, crescimento, proliferação e sobrevivência. Estudos recentes demonstraram o envolvimento da atividade da NAD(P)H oxidase no crescimento e sobrevivência de células de melanoma. Neste trabalho, investigamos o efeito da inibição da NAD(P)H oxidase por difenileneiodônio (DPI) sobre o crescimento das células de melanoma humano MV3 e observamos que este composto reduziu o crescimento destas células em aproximadamente 50%. A inibição da NAD(P)H oxidase induziu mudanças no formato celular, com arredondamento, diminuição do espraiamento e descolamento celular. Esta redução foi acompanhada por um rearranjo do citoesqueleto de actina, diminuição da fosforilação no resíduo Tyr397 da quinase de adesão focal (FAK) e redução na associação de FAK com actina e com a tirosina quinase c-Src. Isto indica que a inibição da geração de ROS está modulando negativamente vias de sinalização ativadas por integrinas, o que freqüentemente conduz a um tipo particular de morte celular conhecida por anoikis. Comprovando a ocorrência deste fenômeno, observamos que a inibição da atividade da NAD(P)H oxidase aumentou a apoptose das células de melanoma e induziu a ativação da caspase-3. Nossos resultados mostram ainda que a inibição da viabilidade celular por DPI foi revertida com o pré-tratamento das células MV3 com um inibidor de tirosina fosfatases (ortovanadato de sódio). Em resumo, este estudo mostra que a geração de ROS por NAD(P)H oxidase está envolvida nos mecanismos de sobrevivência em células de melanoma, uma vez que afetam as vias de sinalização dependentes de FAK-Src, através da inibição da atividade de proteína tirosina fosfatases.

Avaliação das alterações macro-hemodinâmicas, microcirculatórias, gasométricas, metabólicas e inflamatórias secundárias à sedação com dexmedetomidina em um modelo experimental de endotoxemia em hamsters

Pela sua alta incidência, morbidade, mortalidade e custos ao sistema de saúde, a sepse se destaca entre as diversas indicações de internação em unidade de terapia intensiva (UTI). A disfunção da microcirculação tem papel central na gênese e manutenção da síndrome séptica, sendo um marco fisiopatológico desta síndrome. Pacientes críticos invariavelmente estão ansiosos, agitados, confusos, desconfortáveis e/ou com dor. Neste contexto, drogas sedativas são amplamente utilizadas na medicina intensiva. A dexmedetomidina, um agonista potente e altamente seletivo dos receptores alfa-2 adrenérgicos, vem conquistando espaço como o sedativo de escolha nas UTIs por seus efeitos de sedação consciente, redução da duração e incidência de delirium e preservação da ventilação espontânea. Apesar destas possíveis vantagens, a indicação de uso da dexmedetomidina na síndrome séptica ainda carece de conhecimentos sobre seus efeitos na microcirculação e perfusão orgânica. Com o intuito de caracterizar os efeitos microcirculatórios da dexmedetomidina em um modelo murino de endotoxemia que permite estudos in vivo da inflamação e disfunção da perfusão microvascular, hamsters Sírios dourados submetidos à endotoxemia induzida por administração intravenosa de lipopolissacarídeo de Escherichia coli (LPS, 1,0 mg.kg-1) foram sedados com dexmedetomidina (5,0 μg.kg.h-1). A microscopia intravital da preparação experimental (câmara dorsal) permitiu a realização de uma análise quantitativa das variáveis microvasculares e do rolamento e adesão de leucócitos à parede venular. Também foram analisados os parâmetros macro-hemodinâmicos e gasométricos (arterial e venoso portal), as concentrações de lactato arterial e venoso portal, a água pulmonar total e a sobrevivência do animal. Animais não-endotoxêmicos e/ou tratados com solução salina a 0,9% serviram como controles neste experimento. O LPS aumentou o rolamento e a adesão de leucócitos à parede venular, diminuiu a densidade capilar funcional e a velocidade das hemácias nos capilares e induziu acidose metabólica. O tratamento com dexmedetomidina atenuou significativamente estas respostas patológicas (p < 0,05). A frequência de pulso dos animais foi significativamente reduzida pela droga (p < 0,05). Outros resultados não foram tão expressivos (estatisticamente ou clinicamente). Estes resultados indicam que a utilização de dexmedetomidina produz um efeito protetor sobre a microcirculação da câmara dorsal de hamsters endotoxêmicos. Efeitos anti-inflamatórios da dexmedetomidina sobre os leucócitos e o endotélio poderiam melhorar a perfusão capilar e representar o mecanismo in vivo de ação da droga na microcirculação.

Efeitos do tratamento com erva-mate (Ilex paraguariensis) sobre desordens endócrinas e metabólicas em ratos obesos programados pelo desmame precoce

A erva-mate (Ilex paraguariensis) contribui para a perda de peso e reversão da resistência à insulina, mesmo em combinação com dieta hiperlipídica, despertando interesse do seu uso como uma possível estratégia no controle da obesidade. Previamente demonstramos que ratos desmamados precocemente desenvolvem sobrepeso, obesidade central, hiperleptinemia, resistência à insulina e à leptina na idade adulta. Propomos então avaliar os benefícios do extrato aquoso do Ilex paraguariensis sobre a composição corporal, perfis lipídico e hormonal, sinalização da leptina, neuropeptídeos envolvidos com o controle do consumo alimentar, marcadores inflamatórios e do estresse oxidativo. Para indução do desmame precoce, as tetas das ratas lactantes foram envolvidas com uma atadura para bloquear o acesso da prole ao leite materno nos últimos 3 dias da lactação (grupo DP). Os filhotes do grupo controle tiveram livre acesso ao leite durante todos os 21 dias do período de lactação normal (grupo C). Aos 150 dias de idade, as proles DP foram subdivididas em: DP e DP+Mate, de acordo com o tratamento (água ou extrato aquoso de erva-mate 1g/kg PC, respectivamente), por gavagem, diariamente, por 30 dias. As proles C receberam água por gavagem por 30 dias. Aos 180 dias de idade, os 3 grupos foram sacrificados por decapitação. Dados foram considerados significativos quando p <0,05. Aos 180 dias (1 mês após o tratamento), o grupo DP+Mate corrigiu várias alterações observadas no grupo DP, tais como maior massa corporal (+9%), massa de tecido adiposo retroperitoneal e epididimal (+34% e +39%, respectivamente), gordura corporal total (+76%), gordura subcutânea (+61%), área de adipócitos viscerais (+34%), triglicerídeos séricos (+35%), TNF-α no núcleo ARC (+57%), expressão de IL-1β no adipócito (+3,6 vezes), percentual de esteatose hepática (+4,8 vezes) e TBARS em fígado e plasma (+56%, +87%). A atividade SOD diminuída no grupo DP é normalizada pelo tratamento com mate, enquanto, paradoxalmente, a catalase que estava aumentada no grupo DP é normalizada com o tratamento com mate. As alterações de glicemia e HDL-c sérico no grupo DP não se modificaram ao final do tratamento com a erva-mate. A hiperfagia não foi observada na prole DP+Mate, provavelmente devido a normalização parcial da sensibilidade central à leptina (confirmada pelo teste do efeito anorexigênico da leptina) e pela redução de NPY e aumento de POMC. Assim, até o momento evidenciamos que o tratamento por 30 dias com extrato de erva-mate foi capaz de impedir a gênese de obesidade abdominal, a resistência à leptina, a hipertrigliceridemia e algumas alterações do perfil inflamatório e do estresse oxidativo nos ratos com obesidade programada pelo DP, tornando o uso da erva-mate como uma estratégia promissora no controle de peso e das desordens metabólicas presentes na obesidade.

Efeito protetor do extrato hidroalcoólico de Euterpe oleracea Mart. (Açaí) nas alterações renais, cardiovasculares e metabólicas induzidas pela restrição protéica materna durante a gestação

Alguns trabalhos demonstraram que a planta, Euterpe oleracea Mart. (açaí) é rica em polifenóis e que uma dieta rica em polifenóis pode estar envolvida na proteção contra o risco cardiovascular. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do tratamento com o extrato hidroalcoólico do caroço do açaí (ASE) (200mg/Kg/dia), sobre as alterações renais, cardiovasculares, metabólicas, morfológicas e o estresse oxidativo na prole adulta com dezesseis semanas, cujas mães foram submetidas a uma dieta hipoprotéica durante a gestação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas experimentais: controle (20% de proteínas); controle + ASE (20% de proteína + ASE); hipoprotéica (6% de proteína); hipoprotéica + ASE (6% de proteína + ASE) durante a gestação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma dieta controle e foram sacrificados com 4 meses de idade. A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da acetilcolina (ACh) e nitroglicerina (NG) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram determinados o peso corporal, níveis séricos de colesterol total, triglicerídeos, lipoproteína de alta densidade (HDL), albumina, uréia, creatinina, glicose, insulina, resistência à insulina (índice de Homa IR), sódio, potássio e a renina plasmática. Foi avaliada a depuração de creatinina, volume de urina, excreção fracionada de sódio (EFNa) e o número de glomérulos renais. O dano oxidativo, níveis de nitrito e a atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram dosados no plasma e homogenato de rim. O peso corporal foi menor no grupo hipoprotéico e recuperado com ASE. A PAS foi aumentada no grupo hipoprotéico e revertida pelo tratamento com ASE. Os níveis de renina plasmática foram aumentados no grupo hipoprotéico e reduzidos com ASE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM estava reduzida no grupo hipoprotéico com ASE houve uma melhora dessa resposta.O efeito vasodilatador da NG não foi diferente entre os grupos. No grupo hipoprotéico também foi observado o aumento dos níveis de triglicerídeos, colesterol total, uréia, creatinina, glicose e insulina, os mesmos foram reduzidos pelo ASE. Não houve diferença nos níveis de HDL, sódio, potássio, depuração de creatinina e volume urinário nos grupos estudados. Os níveis de malondialdeído e carbonilação de proteínas estavam aumentados e os níveis de nitrito reduzidos no grupo hipoprotéico e foram revertidos pelo ASE. As atividades das enzimas antioxidantes no plasma e no rim foram reduzidas no grupo hipoprotéico e aumentadas pelo ASE, com exceção da catalase que não apresentou diferença entre os grupos. Os animais hipoprotéicos apresentaram redução no número de glomérulos renais e aumento da EFNa e o tratamento com ASE preveniu as alterações renais encontradas neste modelo. Em conclusão, o ASE parece proteger a prole, cujas mães foram expostas a uma dieta com pouca proteína durante a gestação, através do efeito anti-hipertensivo, vasodilatador e antioxidante observado neste trabalho.

Dose terapêutica de radiação ionizante induz um fenótipo migratório em células de carcinoma de colon humano (caco-2): vias de sinalização envolvidas

O câncer colo-retal é a terceira neoplasia mais frequente em todo o mundo e a recorrência local e neoplasia refratária são desafios no tratamento do câncer colo-retal após a cirurgia convencional. Com o intuito de controlar a recorrência e aumentar a média de sobrevida dos pacientes, uma estratégia multidisciplinar que combina a radioterapia (RT) e a quimioterapia com o processo cirúrgico tem sido protocolo clínico de escolha. Embora esta combinação seja capaz de otimizar o tratamento, nem todos os pacientes são beneficiados com o protocolo quimio-rádio combinado, uma vez que existem os insucessos terapêuticos relacionados com a incidência de neoplasias secundárias tardias em pacientes que foram submetidos à RT para tratamento de neoplasias anteriores. Além da doença refratária, outro agravante da RT são os efeitos colaterais produzidos pela radiação ionizante (IR), em especial àqueles do trato gastrointestinal. Estes efeitos estão relacionados com alterações da homeostase do epitélio intestinal, através da desorganização dos complexos juncionais. Porém, os mecanismos que medeiam estes efeitos ainda não estão elucidados. Este estudo avaliou as vias de sinalização que medeiam os efeitos da IR em células Caco-2. Foi observado que a IR causa uma desorganização da junção aderente via Src, EGFR e MAPK, sendo estas alterações acompanhadas por desorganização do citoesqueleto de actina em todo o volume celular. Src, EGFR e MAPK participam de maneira diferenciada na modulação destes efeitos. Observamos também que a radiação aumenta a motilidade dessas células via Src e MAPK e não induz alteração na proliferação celular até 48 horas após o tratamento. Este é o primeiro trabalho que correlaciona vias de sobrevivência celular como Src, EGFR e MAPK com alterações nas proteínas de junção aderente, alterações do citoesqueleto e migração celular. Estes eventos são relacionados aos efeitos colaterais primários e tardios induzidos pela IR, e podem favorecer à aquisição de um fenótipo maligno herdável durante o fracionamento de doses na RT, favorecendo a progressão tumoral do câncer colo-retal. Logo, além da correlação das vias de sinalização envolvidas nos eventos induzidos pela IR mostrados neste estudo, os resultados também corroboram para um melhor entendimento da atividade farmacológica dos inibidores químicos utilizados, uma vez que muitos deles encontram-se em fase de ensaios pré-clínicos e clínicos.