Caracterização da resistência a quinolonas em Mycobacterium abscessus subsp. bolletii e outras micobactérias de crescimento rápido relacionadas

Em diversos estados do Brasil, foram relatadas epidemias de infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido (MCR) desde o ano 2000. A maioria dos casos foi principalmente associada ao clone BRA100 de Mycobacterium massiliense, recentemente renomeada para Mycobacterium abscessus subsp. bolletii, isolado de pacientes submetidos a procedimentos invasivos nos quais os instrumentos médicos não foram adequadamente esterilizados e/ou desinfetados. Sendo as quinolonas uma opção no tratamento de infecções por MCR e sugerida para esquemas terapêuticos para esses surtos, foram avaliadas nesse trabalho as atividades in vitro de quatro gerações de quinolonas para cepas clinicas e de referência de MCR através da microdiluição em caldo. Também foram analisadas as sequências peptídicas das regiões determinantes da resistência a quinolonas (RDRQ) das subunidades A e B da DNA gyrase (GyrA e GyrB) após o seqüenciamento de DNA seguido pela tradução da sequência de aminoácidos. Cinquenta e quatro cepas de M. abscessus subsp bolletii, incluindo o clone BRA100, isoladas em diferentes estados do Brasil, e 19 cepas de referência de MCR foram caracterizadas. Todas as 54 cepas clínicas de M. abscessus subsp. bolletii foram resistentes a todas as gerações de quinolonas e mostraram o mesmo resíduo nas RDRQ, incluindo Ala-83 em GyrA, Arg-447 e Asp-464 em GyrB, descritos como sendo responsáveis por gerar um baixo nível de resistência a quinolonas em micobactérias. Porém, outras espécies de MCR apresentaram diferentes susceptibilidade e padrões de mutações contrários aos classicamente já definidos, sugerindo que outros mecanismos de resistência, diferentes de mutações em gyrA e gyrB também possam estar envolvidos na alta resistência a quinolonas.

Papel das hemaglutininas 67-72p de Corynebacterium diphtheriae na ligação a proteínas plasmáticas, superfícies celulares, invasão e indução de apoptose

Corynebacterium diphtheriae pode ser isolado tanto de quadros de difteria clássica, quanto de infecções sistêmicas, como endocardite. O fibrinogênio (Fbn) e a fibronectina (Fn) são glicoproteínas presentes na matriz extracelular de tecidos conjuntivos. A influência destas proteínas na patogênese das infecções locais e invasivas causadas por C. diphtheriae é objeto de estudo devido ao fato do bacilo diftérico poder ser encontrado em lesões nas quais o Fbn e a Fn são predominantes, incluindo a pseudomembrana diftérica e vegetações cardíacas presentes na endocardite infecciosa. São crescentes as evidências de que o C. diphtheriae pode, além de aderir, ser internalizado por células em cultura. No presente estudo, investigou-se a participação de C. diphtheriae e das proteínas de superfície 67-72p na aderência à Fn e ao Fbn de plasma humano e a eritrócitos. A aderência às células HEp-2 e internalização também foram analisadas. A participação de 67-72p nos mecanismos de morte celular foi avaliada através das colorações por Azul de Tripan e 46-diamidino-2-fenil indol (DAPI), pelo ensaio de redução utilizando dimetil-tiazol-difenil tetrazólio (MTT) e por citometria de fluxo. As 67-72p foram extraídas da superfície da amostra toxigênica C. diphtheriae subsp. mitis CDC-E8392 através de processos mecânicos e precipitação com sulfato de amônio saturado. Análises por SDS-PAGE e immunoblotting detectaram a presença das bandas protéicas de 67 e 72kDa nas amostras toxinogênicas e atoxinogênicas analisadas, as quais pertenciam aos biotipos fermentador e não fermentador de sacarose. C. diphtheriae foi capazes não só de formar agregados na presença de plasma de coelho, mas também de converter Fbn em fibrina independentemente da presença do gene tox. No entanto, a amostra atoxinogênica ATCC 27010 (tox-) foi menos aderente ao Fbn do que a homóloga ATCC 27012 (tox+). A interação bacteriana com eritrócitos foi inibida somente pela Fn. Ligações entre Fn e/ou Fbn com 67-72p foram demonstradas por dot blotting, ELISA e/ou ensaios utilizando fluorescência. As 67-72p foram capazes de inibir as interações bacterianas com o Fbn, indicando que 67-72p podem participar do processo de aderência do patógeno aos tecidos do hospedeiro. Através da microscopia óptica, demonstrou-se a ligação de 67-72p adsorvidas em microesferas de látex com células HEp-2. Anticorpos de coelho do tipo IgG anti 67-72p interferiram somente com a expressão do padrão de aderência do tipo difuso, normalmente apresentado pela amostra CDC-E8392. A Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a inibição da internalização bacteriana pela IgG anti 67-72p ou por 67-72p indicaram o papel de 67-72p como invasina. Alterações do citoesqueleto de células HEp-2 com acumulação de actina polimerizada, induzida por microesferas sensibilizadas com 67-72p, foi observada pelo fluorescent actin staining (FAS) test. Foi visualizado um aumento no número de bactérias viáveis no compartimento intracelular após tratamento de células HEp-2 ou dos microrganismos com Fn. A presença de partículas de látex adsorvidas com 67-72p no interior de vacúolos frouxos em células HEp-2 sugeriu que estas proteínas podem causar efeito citotóxico. A avaliação através das colorações com Azul de Tripan, DAPI e os ensaios de redução utilizando MTT demonstraram um decréscimo na viabilidade de células tratadas com 67-72p. As mudanças morfológicas observadas 3 horas após o início do tratamento com 67-72p incluíram vacuolização, fragmentação nuclear e formação de corpúsculos apoptóticos. A citometria de fluxo revelou um decréscimo de 15,13% no volume/tamanho de células tratadas com 67-72p. Além disso, o ensaio utilizando Iodeto de Propídio (IP) e Anexina V (AV)-FITIC demonstrou que havia 66,1% de células vivas (IP-/AV-), 16,6% de células em apoptose inicial (IP-/AV+) e 13,8% de células em apoptose tardia ou necrose secundária. Em conclusão, as 67-72p estão diretamente envolvidas na interação com Fn e Fbn. As proteínas não fimbriais 67-72p são hemaglutininas implicadas na aderência a células respiratórias e na internalização. Além disso, estas proteínas podem atuar como fatores de virulência em potencial para induzir apoptose de células epiteliais nos estágios iniciais da difteria e nas infecções invasivas causadas pelo C. diphtheriae

Diversidade e padrões estruturais da vegetação halófila-psamófila das restingas do Rio de Janeiro

As restingas do Estado do Rio de Janeiro são áreas de sedimentação predominantemente quaternária, descontínuas geograficamente, formadas em função das mudanças paleoclimáticas, flutuações do nível do mar e transporte longitudinal de sedimentos. A diversidade e a estrutura da vegetação halófila-psamófila presente nestas restingas são os principais focos deste estudo, onde foram analisadas a similaridade florística, as formas de vida e síndrome de dispersão, o padrão de riqueza e diversidade, a distribuição das espécies e os parâmetros de cobertura vegetal, serrapilheira, solo desnudo e salinidade da água do mar. Foram amostradas nove áreas de restinga, a saber, Praia do Sul, Marambaia, Grumari, Marapendi, Maricá, Massambaba, Barra de São João, Jurubatiba e São João da Barra. Foram encontradas 90 espécies, distribuídas em 33 famílias, 69 gêneros, sendo as famílias de maior riqueza específica: Asteraceae (10), Poaceae (9 espécies), Fabaceae (9) e Rubiaceae (6). Foi registrada uma baixa riqueza de espécies nas áreas avaliadas, variando de 25 a 48. Somente 11 espécies ocorreram em todas as áreas (Alternanthera maritima, Blutaparon portulacoides, Canavalia rosea, Cereus fernambucensis, Euphorbia hyssopifolia, Ipomoea imperati, Ipomoea pes-caprae, Panicum racemosum, Remirea maritima, Sporobolus virginicus, Stenotaphrum secundatum), e 12 são dominantes, em uma ou mais áreas (Allagoptera arenaria, Alternanthera maritima, Blutaparon portulacoides, Canavalia rosea, Ipomoea imperati, Ipomoea pes-caprae, Mollugo verticillata, Panicum racemosum, Remirea maritima, Spermacoce capitata, Sporobolus virginicus, Stenotaphrum secundatum), existindo um grande número de espécies raras. O índice de diversidade de Shannon variou de 1,49 a 2,40, e a equabilidade de Pielou de 0,82 a 0,60. O agrupamento formou dois grandes grupos, sendo o primeiro constituído por Barra de São João, Praia do Sul, Marambaia, Grumari e Marapendi, e o segundo por Jurubatiba, São João da Barra, Maricá e Massambaba. As áreas mais similares floristicamente foram Maricá e Massambaba (58%), Grumari e Marapendi (56%), e Barra de São João e Praia do Sul (50%). A vegetação apresenta uma flora característica, com diferença na composição entre as áreas, e similaridade entre áreas geograficamente mais próximas. Um terço das espécies identificadas são caméfitos (34,56%), seguida por fanerófitos (20,98%), geófitos (16,04%), hemicriptófitos (12,34%), terófitos (13,58%) e duas lianas. Na dispersão predomina a autocoria (41,97%), anemocoria (33,33%) e zoocoria (24,69%). O tamanho das áreas perpendicularmente ao mar não está relacionado com aumento da riqueza, nem apresenta o padrão de aumento com o distanciamento do mar. Existem diferenças da riqueza e da diversidade entre as áreas, não havendo uma homogeneidade ao longo do litoral. Há uma zonação, com espécies distribuídas próximas ao mar (Allagoptera arenaria, Alternanthera maritima, Blutaparon portulacoides, Canavalia rosea, Cassytha filiformis, Cereus fernambucensis, Hydrocotyle bonariensis, Ipomoea pes-caprae, Schinus terebinthifolia, Sophora tomentosa, Stenotaphrum secundatum, Cyrtocymura scorpioides), e ao longo do gradiente perpendicular ao mar (Chamaecrista flexuosa, Euphorbia hyssopifolia, Ipomoea imperati, Mollugo verticillata, Panicum racemosum, Paspalum maritimum, Remirea maritima, Sporobolus virginicus). O modelo de série logarítmica é o que melhor representa a vegetação, independente da diversidade ou riqueza. A cobertura vegetal variou entre as áreas. A serrapilheira e o solo desnudo estão estreitamente relacionados com a cobertura vegetal, havendo variação entre as áreas.

Marcadores fenotípicos e genotípicos de resistência aos antimicrobianos em enterobactérias e Staphylococcus spp. e detecção de genes para a produção de enterotoxina estafilocócica em cepas isoladas de equipamentos da cozinha de um hospital universitário no município do Rio de Janeiro

A resistência aos antimicrobianos pela produção de β-lactamases em enterobactérias é um problema adicional neste cenário. Staphylococcus spp é considerado um patógeno humano freqüentemente associado a infecções adquiridas no ambiente hospitalar. O objetivo desse trabalho foi estudar a resistência aos antimicrobianos em cepas de Enterobactérias e Staphylococcus spp. isoladas de equipamentos utilizados no preparo de dietas destinadas à pacientes internados em um hospital universitário no município do Rio de Janeiro, além de verificar a presença de genes codificadores de enterotoxinas nas cepas de Staphylococcus spp. As enterobactérias e os Staphylococcus spp. foram isolados e identificados por metodologia convencional. Para o teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foram utilizados discos contendo antimicrobianos clinicamente relevantes. Foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) pela técnica de microdiluição em caldo para os antimicrobianos clinicamente relevantes. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases em enterobactérias foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaOXA-1 e blaCMY-2. Para Staphylococcus spp. foram pesquisados, através da PCR e sequenciamento, os genes de resistência a meticilina, gentamicina e eritromicina e os genes codificadores de enterotoxinas (sea-see, seg-sej, sen-ser e seu). Foram isoladas 97 cepas de enterobactérias, 40 de liquidificador e 57 de batedeira e 40 cepas de Staphylococcus spp., 20 de cada equipamento. Dentre as enterobactérias, o gênero Enterobacter foi isolado com maior frequencia (n=37, 38%). Foram ainda isoladas seis cepas de Salmonella spp. Das enterobactérias, 80% (n=79) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 38% (n=37) a três ou mais. A expressão fenotípica presuntiva de b-lactamases do tipo AmpC foi detectada em 32 cepas. O gene blaCMY-2 não foi encontrado. Doze cepas apresentaram halos de inibição com screaning positivo para a pesquisa de ESBL. Foi detectada a presença do gene blaSHV em K. pneumoniae subsp. pneumoniae. O sequenciamento desse gene permitiu identificá-lo como sendo blaSHV-36. Dentre os Staphylococcus spp., oito foram identificados como coagulase-positivas (SCP) e 32 como coagulase-negativas (SCN). As oito cepas de SCP foram identificadas como S. aureus subsp. aureus. Dentre os SCN, as espécies identificadas com maior frequência foram: S. caprae (n=7, 17,5%), S. simulans (n=5, 12,5%) e S. epidermidis (n=4, 10%). Destas, 83% (n=33) foram resistentes a pelo menos um antimicrobiano e 30% (n=12) foram resistentes a mais do que três. Duas cepas (5%) de S. epidermidis apresentaram perfil de resistência a até seis antimicrobianos e genes de resistência a meticilina, a eritromicina e a gentamicina. Todas as sete cepas que foram resistentes no TSA e na CIM a gentamicina, apresentaram o gene aac(2)/aph(6). O gene ermB foi observado ainda em uma S hominis subsp hominis que apresentou resistência na CIM e no TSA. Foi detectada a presença de pelo menos um gene codificador de enteroxotxina em 83% (n=33) das cepas. O gene seg foi detectado em 11 cepas, o gene sei em 17 cepas e o gene sen em 31 cepas. Os resultados encontrados implicam as dietas preparadas com esses equipamentos como veículo de disseminação de enteropatógenos e Staphylococcus spp. com marcadores de resistência e genes codificadores de enterotoxinas relevantes no ambiente hospitalar.

Comunidades macrofaunais bênticas associadas às algas de deriva e à grama marinha Halodule wrightii Ascherson na Ilha do Japonês, Cabo Frio, RJ

As extensas pradarias submersas formadas pelas gramas marinhas são importantes habitats da costa, onde ocorrem interações ecológicas entre diversas espécies da vegetação subaquática, invertebrados bentônicos e peixes. As gramas marinhas e algas de deriva são conhecidas como macrófitas marinhas e, por ocuparem o mesmo tipo de substrato, são normalmente encontradas juntas, proporcionando oxigênio, alimento, proteção, abrigo além de sítios de reprodução e pastagem para os animais associados a essas pradarias. Amostras de algas de deriva e de H. wrightii foram coletadas, ao longo de transectos fixos de 50 m paralelos à Ilha do Japonês, a fim de analisar a existência de relações positivas entre as espécies de macrófitas marinhas e sua macrofauna associada, comparar as duas comunidades e avaliar a estruturação da comunidade macrofaunal bêntica do local. Os transectos foram alocados de acordo com a posição do banco de grama marinha. Observou-se que a densidade de eixos e a biomassa de H. wrightii não explicam a variação da biomassa, riqueza de espécies e diversidade (Índice de Simpson) das algas de deriva. A grande movimentação das algas de deriva ao longo do banco de grama marinha faz com que elas se homogeneízem e ocupem diferentes lugares ao acaso na pradaria, muitos desses locais com baixa biomassa de H. wrightii devido à grande variabilidade na distribuição dessa espécie no local de estudo. Os descritores ecológicos da grama marinha também não tiveram relações positivas com sua macrofauna bêntica associada. A comunidade macrofaunal associada às gramas marinhas foi mais densa, rica e diversa do que a comunidade macrofaunal associada às algas de deriva. Os moluscos Anomalocardia flexuosa, Cerithium atratum, Ostrea sp, Tellina lineata e Divalinga quadrissulcata dominaram o ambiente de gramas marinhas. A maior complexidade estrutural das algas de deriva forneceu um habitat protegido mais atrativo para os crustáceos como, Pagurus criniticornis, Cymadusa filosa e Batea catharinensis. A malacofauna associada às algas não foi abundante, mas um novo registro foi a ocorrência do bivalve invasor Lithopaga aristatus, perfurando uma concha de Ostrea sp. As relações entre os descritores da biomassa algal foram comprovadas para a maioria dos descritores de sua fauna associada. As relações das macrófitas marinhas com a macrofauna total associada seguiram o mesmo padrão das relações das algas de deriva. As análises de agrupamento e ordenação mostraram que as comunidades macrofaunais bênticas do local são estruturadas de acordo com os táxons dos organismos associados mais dominantes influenciados pelo tipo de vegetação basibionte (algas de deriva ou grama marinha). Destaca-se com o presente estudo a importância de medidas de maior proteção no local para a preservação e manutenção do ecossistema da Ilha do Japonês, RJ, Brasil

Estudo da resistência aos antimicrobianos em enterobactérias isoladas de mãos de manipuladores de alimentos em cantinas permissionárias de uma universidade no Município do Rio de Janeiro

A contaminação dos alimentos e transmissão de patógenos via manipuladores pode ocorrer se as condições de higiene, armazenamento e preparo não estiverem satisfatórios. Procedimentos inadequados de manipulação oferecem um perigo potencial à saúde pública devido ao alto risco de ocorrência de doenças de origem alimentar por microrganismos resistentes aos antimicrobianos. Neste estudo foram coletados swabs das mãos de 49 manipuladores de alimentos, isoladas e identificadas por metodologia convencional 244 enterobactérias de 7 cantinas permissionárias em uma Universidade do Município do Rio de Janeiro. Foram utilizados discos contendo os seguintes antimicrobianos: aztreonam, tobramicina, ceftazidima, cloranfenicol, tetraciclina, sulfa, amicacina, ampicilina e sulbactam, ciprofloxacina, gentamicina, cefalotina, cefepime, cefoxitina, imipenem, ampicilina, cefotaxima. A pesquisa de genes que codificam β-lactamases foi realizada pela Reação em Cadeia da Polimerase para os genes blaTEM, blaSHV, blaCTX, blaOXA-1 e blaCMY-2. As espécies mais prevalentes identificadas foram: Enterobacter cloacae (21,3%), Citrobacter braakii (15,2%), Escherichia coli (12,7%), Klebsiella pneumoniae subesp. Pneumoniae (12,2%). O perfil de resistência aos antimicrobianos revelou que 94 (38,5%) cepas identificadas apresentaram resistência a pelo menos dois antibióticos, 55 cepas (22,5%) a pelo menos um antibiótico, 34 cepas (13,9%) a três antibióticos, 14 cepas (5,7%) mostraram-se resistentes a quatro antibióticos. Uma cepa de E. cloacae mostrou resistência múltipla a dez antibióticos e 140 cepas (57,3%) foram resistentes simultaneamente a cefalotina e cefoxitina. Nenhuma cepa foi resistente ao aztreonam e a sulfa e apenas 01 foi resistente ao ciprofloxacina, 01 ao imipenem e 02 a cefotaxima. Foi identificado a presença do gene blaSHV em uma cepa de K. pneumoniae subsp. pneumoniae. Este dado aponta para uma mudança no perfil dessas bactérias isoladas da comunidade que passam a ter características semelhantes com as de origem hospitalar. Os resultados alertam para um perigo à saúde dos consumidores e conseqüentemente à saúde pública, devido a presença de enterobactérias resistentes aos antimicrobianos nas mãos de manipuladores de alimentos.