Influência da ck2 no processo de interação Leishmania donovani-macrófagos

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2α em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2α. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos.

Influência das proteínas motoras e CK2 no processo de interação Leishmania braziliensis-macrófago.

O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago.

Ação do Glucantime sobre macrófagos de camundongos

Os antimoniais pentavalentes, tais como o Glucantime, são geralmente usados como fármacos de primeira escolha para o tratamento das leishmanioses, no entanto seu mecanismo de ação não é completamente esclarecido. Atua contra formas amastigotas intracelulares de Leishmania sp, comprometendo o potencial redox levando danos ao DNA do parasito. Alguns trabalhos sugerem que o Glucantime aumenta a capacidade fagocítica e a produção de TNF-alfa por fagócitos. O objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade do Glucantime modular a atividade do macrófago, a principal célula hospedeira da Leishmania. Inicialmente, a toxicidade do Glucantime foi testada sobre macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c, tratando as monocamadas in vitro por 48 horas. A viabilidade celular foi avaliada pelo método do MTT. A capacidade do Glucantime (0,1, 1 e 10 mg/ml) modular os macrófagos foi avaliada tratando as monocamadas de macrófagos peritoneais por 24 horas antes da infecção com Leishmania braziliensis. Após 48 horas de incubação com meio de cultura foi avaliado o índice de infecção por contagem. Antes e após a infecção foram analisados a produção de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess, espécies reativas de oxigênio (EROS) por fluorimetria usando a sonda H2DCFDA e a produção de citocinas por ELISA. Para avaliar se o Glucantime seria capaz de modular macrófagos in vivo, camundongos suíços foram tratados por 5 dias consecutivos com 8 mg de Glucantime pela via intraperitoneal. Macrófagos peritôneais foram avaliados quanto a sua capacidade de controlar a infecção in vitro com L. braziliensis. Os resultados mostraram que nas concentrações até 10 mg/ml, o Glucantime não alterou a viabilidade dos macrófagos in vitro. O pré-tratamento dos macrófagos com Glucantime nas concentrações de 0.1mg/mL, 1mg/mL e 10mg/mL, foi capaz de reduzir o índice de infecção em 49%, 74% e 85%, respectivamente. Em macrófagos não infectados a produção de NO foi aumentada na concentração de 10mg/ml de Glucantime. O tratamento com 1 e 10 mg/ml de Glucantime foi capaz de aumentar significativamente a produção de EROs (p<0,05 e p<0.01, respectivamente) e a produção IL-12 (p<0,05), mas a IL-10 não foi alterada. Não houve alterações significativas desses parâmetros em relação ao controle após a infecção com L. braziliensis. Os macrófagos oriundos dos animais tratados com Glucantime foram capazes de reduzir o índice de infecção por L. braziliensis (p<0,05). Esses resultados sugerem que o Glucantime é capaz de ativar os macrófagos e esse efeito pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco.