Ader��ncia, invas��o e persist��ncia intracelular de estreptococos do grupo B em c��lulas epiteliais respirat��rias A549

Estreptococos do grupo B (EGB) comumente colonizam adultos saud��veis, sem sintomas, mas sob certas circunst��ncias possui a capacidade de invadir tecidos do hospedeiro, evadir da detec����o imunol��gica e causar doen��as invasivas graves. Por conseguinte, os EGB continuam sendo uma das principais causas de mortalidade neonatal, pneumonia, sepse e meningite. Contudo, a patog��nese desta infec����o ainda est�� pouco elucidada. O sorotipo V �� freq��entemente associado �� doen��a invasiva em mulheres adultas n��o gestantes e o segundo mais prevalente em mulheres gr��vidas. O principal objetivo deste trabalho foi estudar a ader��ncia, invas��o e persist��ncia intracelular de amostras pertencentes ao sorotipo V (88641-vagina/portador e 90186-sangue/paciente) usando as c��lulas epiteliais respirat��rias A549. As amostras de EGB demonstraram capacidade de aderir e invadir as c��lulas epiteliais A549, mas somente a amostra 90186-sangue apresentou maior invas��o quando comparada com a de vagina (P <0.001). Ambas as amostras demonstraram persist��ncia intracelular sem replica����o no interior das c��lulas A549. Apenas o isolado 90186-sangue sobreviveu dentro das c��lulas epiteliais at�� 24h de incuba����o (P <0,05). A fus��o dos lisossomas das c��lulas epiteliais com vac��olos contendo bact��rias foi observada em c��lulas A549 tratadas com Lyso Tracker Grenn DND-26 para todas as amostras testadas. Nossos dados indicam pela primeira vez que as amostras vi��veis do sorotipo V permanecem dentro de vac��olos ��cidos epiteliais. Curiosamente, a amostra 90186- sangue induziu vacuoliza����o celular e a amostra 88641-vagina promoveu a morte celular ap��s 7h de incuba����o. Finalmente, nossos resultados aumentam o nosso conhecimento sobre eventos celulares da fagocitose e da patog��nese das doen��as invasivas promovidas pelos EGB.

Desenvolvimento de t��cnica de an��lise de imagens digitais para avalia����o do est��gio da fibrose em bi��psias hep��ticas de pacientes portadores de hepatite cr��nica por v��rus da hepatite B e C

As hepatites cr��nicas por v��rus s��o as mais frequentes, destacando-se os v��rus das hepatites B (VHB) e C (VHC). O estudo anatomopatol��gico da bi��psia hep��tica �� considerado o padr��o ouro para avaliar com precis��o a distor����o arquitetural e o grau de fibrose do par��nquima do f��gado, importantes fatores progn��sticos para os pacientes portadores de hepatites cr��nicas virais. Na avalia����o histopatol��gica atual, em adi����o aos relatos subjetivos das altera����es histol��gicas, escores semiquantitativos que correlacionam achados morfol��gicos com graus num��ricos s��o usados, tais como os reconhecidos escores de Ishak e METAVIR. Entretanto, em todos estes sistemas h�� a desvantagem da subjetividade do examinador e da incorpora����o de altera����es categ��ricas, sem refer��ncias ��s mudan��as quantitativas do col��geno hep��tico. T��cnicas de an��lise de imagens digitais (AID) que fornecem quantifica����o objetiva dos graus de fibrose em amostras histol��gicas t��m sido desenvolvidas. Todavia, o alto custo e dificuldade ao acesso das tecnologias descritas restringem seu uso a poucos centros especializados. Este estudo visa o desenvolvimento de uma t��cnica de custo acess��vel para a an��lise de imagens digitais da fibrose hep��tica em hepatites cr��nicas virais. Foram estudadas 304 bi��psias de pacientes com hepatite cr��nica por v��rus B e C, obtidas atrav��s de agulhas Menghini. Todas as amostras tinham pelo menos 15 mm de comprimento ou cinco espa��os-porta completos e foram coradas pelo m��todo Tricr��mico de Masson. O estadiamento foi feito por um ��nico hepatopatologista experiente, sem o conhecimento dos dados cl��nicos dos pacientes. Os escores de Ishak e METAVIR foram aplicados. As imagens microsc��picas foram digitalizadas. Os ��ndices de fibrose foram determinados de forma automatizada, em t��cnica desenvolvida no programa Adobe Photoshop. Para o escore de Ishak, observamos os seguintes ��ndices de Fibrose (IF) m��dios: 0,8% 0,0 (est��gio 0), 2.4% 0,6 (est��gio 1), 4,7% 1,6 (est��gio 2), 7,4% 1,4 (est��gio 3), 14,9% 3,7 (est��gio 4), 23,4% 2,9 (est��gio 5) e 34,5% 1,5 (est��gio 6). Para a classifica����o METAVIR: 0,8% 0,1 (est��gio F0), 3,8% 1,8 (est��gio F1), 7,4% 1,4 (est��gio F2), 20,4% 5,2 (est��gio F3) e 34,5% 1,5 (est��gio F4). Observamos uma excelente correla����o entre os ��ndices de fibrose da AID e os escores de Ishak (r=0,94; p<0,001) e METAVIR (r=0,92; p<0,001). Em rela����o �� indica����o de tratamento antiviral, foi observado IF m��dio de 16,4%. Em rela����o ao diagn��stico de cirrose, foi observado IF m��dio de 26,9%, para o escore de Ishak, e 34,5% para a classifica����o METAVIR. A reprodutibilidade intra-observador foi excelente. Este novo m��todo de an��lise de imagens digitais para a quantifica����o de fibrose hep��tica tem custo acess��vel e foi desenvolvido com tecnologia que est�� dispon��vel em todo o mundo, permitindo identificar com precis��o todos os est��gios de fibrose, com excelente reprodutibilidade intra-observador.

Desenvolvimento e manuten����o de mem��ria imunol��gica ap��s imuniza����o contra Neisseria meningitidis B com a vacina VA-MENGOC-BC

Neisseria meningitidis �� uma das principais causas de meningite bacteriana e septicemia em todo o mundo, acometendo principalmente crian��as menores de 4 anos. Atualmente, n��o existe uma vacina universal contra o meningococo B (MenB). A imunidade protetora contra o meningococo caracteriza-se pela presen��a e persist��ncia de anticorpos bactericidas, por��m pouco se sabe sobre os mecanismos de desenvolvimento desta mem��ria sorol��gica. Avaliamos em modelo animal e em humanos, a gera����o e manuten����o das c��lulas secretoras de anticorpos (ASC) e dos linf��citos B de mem��ria (LBm) ap��s vacina����o contra MenB. Utilizamos como refer��ncia a vacina dift��rica (dT ou DTP), considerada ter ��tima efic��cia em humanos. Para o estudo em modelo animal, grupos de 6 a 8 camundongos su����os, f��meas, de 5 a 6 semanas, foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC ou DTP, via intramuscular, com intervalo de 2 semanas entre as doses. Aproximadamente 2, 4 ou 6 meses ap��s a ��ltima dose, os animais receberam a dose refor��o. A vacina anti-MenB induziu uma resposta prim��ria de ASC maior que a resposta �� dose refor��o. Ao contr��rio, a resposta de ASC �� vacina dT foi maior ap��s o booster. A resposta de LBm anti-MenB permaneceu constante (m��dia de 1%) ao longo de todo o estudo, mas a resposta ao tox��ide dift��rico (TD) foi maior ap��s o booster (m��dia de 1,9%) que ap��s a imuniza����o prim��ria. A concentra����o de IgG, anticorpos bactericidas e opsonizantes contra MenB foi dose-dependente e foi reativada ap��s a administra����o das doses refor��os. Esses resultados sugerem que os LBm presentes no ba��o foram respons��veis pela forte resposta de anticorpos observada ap��s a dose refor��o. Para o TD, ambos ASC e LBm foram importantes na manuten����o da mem��ria sorol��gica. Para o estudo em humanos, seis volunt��rios foram imunizados com 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC, via intramuscular, com intervalo de 6 a 7 semanas entre as doses. Seis meses ap��s a imuniza����o prim��ria, os indiv��duos receberam uma dose refor��o. Outro grupo de volunt��rios (n = 5) foi imunizado com uma dose refor��o da vacina dT. Somente ap��s a terceira dose da vacina anti-MenB foi poss��vel detectar a presen��a de LBm em todos os indiv��duos. Seis meses ap��s a imuniza����o prim��ria, a frequ��ncia de LBm voltou ao seu n��vel basal e n��o foi reativada ap��s a dose booster. A vacina dT tamb��m induziu uma resposta de LBm heterog��nea, mas esta foi 5 vezes maior que a induzida por VA-MENGOC-BC. A resposta de anticorpos funcionais anti-MenB foi de curta dura����o com pequena reativa����o ap��s a dose refor��o. As duas vacinas induziram diferentes frequ��ncias de LT de mem��ria central (TCM) e de mem��ria efetora (TEM) ap��s a vacina����o prim��ria e ap��s o booster. A resposta �� dose booster foi caracterizada pelo aumento da popula����o de linf��citos TCM e diminui����o de TEM. A popula����o de linf��citos TCM apresentou maior ativa����o (CD69+) que os linf��citos TEM, especialmente ap��s a vacina����o contra MenB. Concluindo, os dados desta tese indicam que a administra����o de 3 doses da vacina VA-MENGOC-BC teve uma efici��ncia limitada em humanos e sugerem que a baixa efic��cia da vacina, quando utilizada na d��cada de 90 em S��o Paulo e no Rio de Janeiro, pode estar relacionada �� defici��ncia na gera����o e manuten����o de LBm espec��ficos.

Efeito de ExoU na ativa����o de NF-&#954;B e na secre����o de IL-8 por c��lulas humanas infectadas por Pseudomonas aeruginosa

ExoU, uma citotoxina produzida pelo pat��geno oportunista Pseudomonas aeruginosa e translocada para o citossol de c��lulas hospedeiras via sistema de secre����o do tipo III, �� associada �� gravidade de infec����es agudas. Estudos anteriores realizados em nosso laborat��rio relataram a potente atividade pr��-inflamat��ria de ExoU, respons��vel por um intenso recrutamento de neutr��filos para o s��tio de infec����o. No presente trabalho, o efeito de ExoU na modula����o da ativa����o do fator transcricional NF-&#954;B e na regula����o da express��o e da secre����o da quimiocina para neutr��filos IL-8 foi avaliado em culturas de c��lulas epiteliais respirat��rias e endoteliais humanas infectadas com a cepa PA103 de P. aeruginosa (produtora de ExoU) ou com a mutante deletada no gene exoU, PA103&#954;exoU. An��lises por RT-PCR semi-quantitativo mostraram que a infec����o pela cepa produtora de ExoU levou ao aumento dos n��veis de mRNA de IL-8, enquanto ensaios de altera����o da mobilidade eletrofor��tica (EMSA), supershift e com gene rep��rter mostraram que ExoU induziu a transloca����o nuclear do heterod��mero transativador p65/p50 de NF-&#954;B e a ativa����o da transcri����o de genes dependente deste fator transcricional. Adicionalmente, o tratamento das culturas celulares com um inibidor de NF-&#954;B antes da infec����o bacteriana reduziu significativamente os n��veis de mRNA de IL-8 e da secre����o desta quimiocina. Em conjunto, estes resultados mostram que ExoU ativa NF-&#954;B e, consequentemente, estimula a express��o e a secre����o de IL-8 por c��lulas epiteliais respirat��rias e c��lulas endoteliais infectadas com P. aeruginosa

Validade e confiabilidade do Question��rio de Qualidade de Vida para Pacientes Orto-cir��rgicos (B-OQLQ)

O Orthognathic Quality of Life Questionnaire (OQLQ) foi desenvolvido em 2000 e validado em 2002, com o objetivo de analisar os impactos e benef��cios do tratamento orto-cir��rgico na qualidade de vida dos pacientes. O objetivo deste trabalho foi avaliar a validade de construto e confiabilidade da vers��o brasileira deste instrumento, B-OQLQ, para verificar se, no processo de adapta����o transcultural, as propriedades psicom��tricas do question��rio original foram mantidas. Para tal, foi realizado um estudo seccional com uma amostra composta por cento e um pacientes com necessidade de tratamento ortod��ntico-cir��rgico no Hospital Universit��rio Pedro Ernesto (HUPE) e na Faculdade de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ), utilizando o B-OQLQ na forma de autopreenchimento. A m��dia de idade dos pacientes foi de 26,51 (dp= 9,25), sendo a maioria do sexo feminino (58,42%; n=59) e maior que 21 anos (n=68, 67,33%). Quanto ao tipo de cirurgia, 42,57% (n=43) da amostra necessitavam fazer procedimento cir��rgico que envolveria as duas bases ��sseas, 16,83% (n=17) necessitavam operar apenas uma das bases ��sseas e para 40,59% (n=41) dos pacientes ainda n��o era poss��vel definir qual o tipo de cirurgia seria necess��ria. Uma ortodontista treinada examinou os dentes dos pacientes para registrar o ��ndice de Dentes Cariados, Perdidos e Obturados (CPOD). A validade de construto foi acessada atrav��s do teste de correla����o de Spearman entre as pontua����es do B-OQLQ e do question��rio Oral Health Impact Profile (OHIP-14) e das pontua����es do B-OQLQ com as pontua����es obtidas atrav��s de indicadores subjetivos e objetivos de sa��de. A confiabilidade foi acessada em termos de consist��ncia interna e estabilidade (teste-reteste), utilizando-se o alfa de Cronbach e o Coeficiente de Correla����o Intraclasse (CCI), respectivamente. Os escores do B-OQLQ se correlacionaram significativamente com: o escore total do OHIP-14 (rs=0,70, p<0,001), a sa��de bucal percebida (rs=-0,24, p=0,02), a qualidade de vida medida por um item ��nico de avalia����o (rs=-0,29, p=0,03), a satisfa����o com a apar��ncia f��sica (rs=-0,40, p<0,001) e a satisfa����o com a apar��ncia facial (rs=-0,39, p=0,0001). Foi encontrada uma associa����o entre a faixa et��ria e o escore total do B-OQLQ (p=0,0012), sendo que pacientes maiores de 21 anos obtiveram escores mais elevados que pacientes mais novos. A associa����o entre o escore total do B-OQLQ e o tipo de cirurgia n��o foi estatisticamente significativa. O alfa de Cronbach e o CCI foram 0,95 e 0,90, respectivamente. Os dom��nios do B-OQLQ que mais causaram impacto na qualidade de vida foram aspectos sociais da deformidade (13,0; dp= 10,54) e est��tica facial (11,81; dp= 6,23). A vers��o brasileira do question��rio OQLQ se mostrou um instrumento v��lido e confi��vel, com boas propriedades psicom��tricas podendo, portanto, ser considerada um instrumento apropriado para acessar o impacto da deformidade dentofacial na qualidade de vida de pacientes portadores desta condi����o.

Modelagem computacional aplicada na estima����o de par��metros cin��ticos em processos qu��micos e cromatogr��ficos

A estima����o de par��metros cin��ticos em processos qu��micos e cromatogr��ficos utilizando t��cnicas num��ricas assistidas por computadores tem conduzido para melhoria da efici��ncia e o favorecimento da compreens��o das fenomenologias envolvidas nos mesmos. Na primeira parte deste trabalho ser�� realizada a modelagem computacional do processo de produ����o de biodiesel via esterifica����o, sendo que, o m��todo de otimiza����o estoc��stica Random Restricted Window (R2W) ser�� correlacionado com os dados experimentais da produ����o de biodiesel a partir da esterifica����o do ��cido l��urico com etanol anidro na presen��a do catalisador ��cido ni��bico (Nb2O5). Na segunda parte do mesmo ser�� realizada a modelagem computacional do processo de cromatografia de adsor����o (batch process) onde ser��o correlacionados os dados provenientes dos modelos cin��ticos de HASHIM, CHASE e IKM2 com os dados experimentais da adsor����o de amoxicilina com quitosana, e tamb��m ser��o correlacionados os dados experimentais da adsor����o de Bovine Serum Albumin (BSA) com Streamline DEAE com os dados provenientes de uma nova aplica����o do m��todo R2W mediante a implementa����o de um modelo cin��tico revers��vel. Ademais, as constantes cin��ticas para cada processo supracitado ser��o estimadas levando em considera����o o valor m��nimo da fun����o res��duos quadrados.

Papel de metaloproteases de Estreptococos do grupo B na intera����o,viabilidade celular e indu����o de apoptose e necrose em c��lulas endoteliais e epiteliais humanas

Estreptococos do grupo B (EGB) �� a principal causa de sepse e meningite neonatal e tem sido recentemente reconhecido como pat��geno respons��vel por infec����es invasivas em adultos imunocomprometidos (idosos ou portadores de doen��as cr��nicas). Os EGB produzem in��meras enzimas extracelulares, v��rias das quais interagem com o sistema imune do hospedeiro e s��o importantes durante a intera����o EGB-hospedeiro, bem como para o desenvolvimento da doen��a. Estudos anteriores mostraram que metaloproteases est��o envolvidas em v��rias vias metab��licas em diferentes tipos celulares. Por esta raz��o, n��s decidimos investigar o poss��vel envolvimento de metaloproteases de EGB durante a intera����o celular e apoptose/necrose induzida pelo micro-organismo em c��lulas endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) e da linhagem de epit��lio respirat��rio (A549). Tratamento de EGB com inibidores de metaloproteases (EDTA, EGTA e FEN) n��o induziu altera����es no crescimento bacteriano, mas promoveu altera����es na express��o de prote��nas de superf��cie, capacidade adesiva e perfil de sobreviv��ncia intracelular do pat��geno. O EGB e o sobrenadante do crescimento bacteriano (meio condicionado; MC) promoveram a morte das c��lulas HUVEC e A549. Contudo, o tratamento com inibidores de metaloproteases restauraram a viabilidade celular induzida pelos EGB e o MC, sugerindo que metaloproteases bacteriana est��o envolvidas no rompimento da barreira celular, promovendo a dissemina����o bacteriana. Este trabalho descreve pela primeira vez apoptose e necrose induzidas pelo EGB e MC em HUVEC e c��lulas A549 ap��s 24h de incuba����o, respectivamente. N��s tamb��m observamos redu����o da pr��-caspase-3 ap��s infec����o das HUVEC com EGB e MC, sugerindo ativa����o da caspase-3. Al��m disso, o aumento da express��o da prote��na pr��-apopt��tica Bax e diminui����o dos n��veis da prote��na anti-apopt��tica Bcl-2 em HUVEC, demonstram o envolvimento do mecanismo apopt��tico mitocondrial (via intr��nseca). A melhor compreens��o das bases moleculares da patog��nese do EGB contribui para identificar novas mol��culas bacterianas e hospedeiras que podem representar novos alvos terap��uticos ou imunoprofil��ticos contra a doen��a causada por esse pat��geno neonatal.