Correlação entre o perfil fenotípico, genotípico e a virulência de isolados geofílicos, antropofílicos e zoofílicos de Sporothrix schenckii

Sporothrix schenckii é um fungo dimórfico e agente etiológico da esporotricose, uma micose profunda que apresenta diferentes manifestações clínicas. As diversas manifestações clínicas desta e de outras doenças infecciosas podem ser relacionadas ao status imune do hospedeiro, a fatores de virulência do patógeno ou a diferentes genótipos. Dados anteriores do nosso grupo demonstram que diferenças na expressão de adesinas do S. schenckii para fibronectina estão diretamente relacionadas à virulência de diferentes cepas. Neste trabalho visamos avaliar caracteres morfológicos bioquímicos e genotípicos de doze isolados de geofílicos, zoofílicos e antropofílicos de S. schenckii, de diferentes origens geográficas, que apresentam diferentes graus de virulência. Foi analisada a morfologia das formas de micélio e levedura de cada isolado. Foi observado que a fase de micélio dos isolados estudados apresentaram morfologia típica com hifas finas e septadas, com conídios obovóides ou ovóides alongados. As leveduras apresentaram pleomorfismo típico da espécie, com células variando do formato ovóide ao alongado. Verificamos ainda a expressão de adesinas para fibronectina e laminina, do antígeno gp70 e, o padrão de bandas antigênicas reconhecidas por anticorpos IgG presentes em soro de pacientes com esporotricose ou de camundongos infectados. Para isso, foram extraídas proteínas de superfície da forma de levedura de cada isolada, sendo os extratos ensaiados por Western blot. Nestes ensaios observamos que os isolados mais virulentos de S. schenckii expressavam mais adesinas para fibronectina e laminina. A presença da gp70 foi detectada em dez dos doze isolados, sendo que apenas os isolados zoofílicos não expressam esta glicoproteína. O padrão antigênico foi variável entre os isolados, não havendo clara relação com a origem e/ou distribuição geográfica. Os dados fenotípicos foram confrontados com dados genotípicos. Para isso, sequenciamos os loci da calmodulina (CAL) e do Internal Transcribed Spacer 1/2 (ITS 1/2) a fim de averiguar se haviam diferenças genotípicas entre os isolados estudados. As análises do sequenciamento do loci CAL e ITS, contudo, apontam a divisão dos isolados em duas espécies filogenéticas, S. schenckii e S. brasiliensis não correlacionada com a distribuição geográfica dos mesmos. Nosso estudo reforça a hipótese de haver uma correlação entre virulência e expressão de adesinas, porém, sem qualquer relação entre a distribuição geográfica dos isolados zoofilicos, antropofílicos ou geofílicos, bem como dos genótipos encontrados.

Hardware paralelo reconfigurável para identificação de alinhamentos de sequências de DNA.

Amostras de DNA são encontradas em fragmentos, obtidos em vestígios de uma cena de crime, ou coletados de amostras de cabelo ou sangue, para testes genéticos ou de paternidade. Para identificar se esse fragmento pertence ou não a uma sequência de DNA, é necessário compará-los com uma sequência determinada, que pode estar armazenada em um banco de dados para, por exemplo, apontar um suspeito. Para tal, é preciso uma ferramenta eficiente para realizar o alinhamento da sequência de DNA encontrada com a armazenada no banco de dados. O alinhamento de sequências de DNA, em inglês DNA matching, é o campo da bioinformática que tenta entender a relação entre as sequências genéticas e suas relações funcionais e parentais. Essa tarefa é frequentemente realizada através de softwares que varrem clusters de base de dados, demandando alto poder computacional, o que encarece o custo de um projeto de alinhamento de sequências de DNA. Esta dissertação apresenta uma arquitetura de hardware paralela, para o algoritmo BLAST, que permite o alinhamento de um par de sequências de DNA. O algoritmo BLAST é um método heurístico e atualmente é o mais rápido. A estratégia do BLAST é dividir as sequências originais em subsequências menores de tamanho w. Após realizar as comparações nessas pequenas subsequências, as etapas do BLAST analisam apenas as subsequências que forem idênticas. Com isso, o algoritmo diminui o número de testes e combinações necessárias para realizar o alinhamento. Para cada sequência idêntica há três etapas, a serem realizadas pelo algoritmo: semeadura, extensão e avaliação. A solução proposta se inspira nas características do algoritmo para implementar um hardware totalmente paralelo e com pipeline entre as etapas básicas do BLAST. A arquitetura de hardware proposta foi implementada em FPGA e os resultados obtidos mostram a comparação entre área ocupada, número de ciclos e máxima frequência de operação permitida, em função dos parâmetros de alinhamento. O resultado é uma arquitetura de hardware em lógica reconfigurável, escalável, eficiente e de baixo custo, capaz de alinhar pares de sequências utilizando o algoritmo BLAST.

O Complexo Cliona celata Grant, 1826 (Porifera, Demospongiae) na América do Sul: uma abordagem molecular e morfológica

Este trabalho visou a averiguação do status taxonômico das esponjas bioerosivas do complexo Cliona celata da América do Sul por meio de técnicas moleculares, utilizando como marcadores a subunidade I da Citocromo c oxidase (cox1) e os Espaçadores Internos Transcritos do RNAr nuclear (ITS1 e ITS2), além de testar outros marcadores. Igualmente, avaliou o grau de variabilidade morfológica encontrado nessas espécies, principalmente por meio da morfometria dos tilóstilos, a fim de estabelecer uma diagnose para elas. Ainda, tentou determinar as relações filogenéticas dessas espécies com as demais esponjas bioerosivas utilizando o gene 28S do RNAr nuclear. Foi possível determinar a existência de cinco clados de esponjas bioerosivas do complexo Cliona celata para a América do Sul, e dois outros clados não-sulamericanos, por meio dos marcadores moleculares utilizados. Embora seja discutida a validade desses clados como espécies distintas, continua impossível, por meio de caracteres morfológicos, distingui-los, e dessa forma, a proposição formal de novas espécies é evitada. Através da reconstrução filogenética do grupo, é possível verificar que as esponjas bioerosivas analisadas se apresentaram como um grupo monofilético, e se separa em três principais clados: Pione, Spirastrellidae, e Clionaidae. Por meio desta, é sugerida a alocação das espécies do complexo C. viridis e C. schimidti dentro de Spirastrella, além de ser necessária a criação de um novo gênero para alocar as espécies do novo complexo identificado aqui, o complexo C. delitrix.

Marcadores Inserção/Deleção (Indel): estudo de ancestralidade e identificação humana na população brasileira

Os polimorfismos denominados Indels são variações de comprimento geradas por inserção ou deleção de um ou mais nucleotídeos em uma sequência de DNA. Estes marcadores genéticos vêm apresentando um grande potencial para fins forenses e populacionais por combinar características dos marcadores SNPs, tais como a capacidade de analisar fragmentos curtos (menores que 250pb) e baixas taxas de mutação, com a facilidade da genotipagem dos STR em uma única PCR, seguida de detecção dos fragmentos amplificados por eletroforese. Com o objetivo de avaliar a eficiência dos Indels em aplicações forenses e esclarecer os detalhes da formação de diferentes populações brasileiras através de dados genéticos, amostras populacionais de diferentes estados brasileiros foram genotipadas através de dois sistemas multiplex. O primeiro (indelplex-HID) foi otimizado para fins de Identificação Humana (HID) e inclui um grupo de 38 marcadores Indels selecionados por apresentarem altos valores de diversidade genética dentro das principais populações continentais. Já o segundo (46-AI-indels), foi selecionado para estudos de ancestralidade e é composto por um conjunto de 46 marcadores informativos de ancestralidade (AIMs). Nesse último caso, ao contrário do anterior, o sistema multiplex inclui marcadores com alta divergência nas frequências alélicas entre populações continentais. Na primeira etapa, o multiplex HID foi aplicado em uma amostra populacional do Rio de Janeiro e em uma amostra populacional dos índios Terena. Um banco de dados de frequências alélicas foi construído para essas duas amostras populacionais. Os valores das frequências alélicas foram utilizados nas comparações estatísticas e parâmetros de vínculos genéticos e forenses foram calculados. O Poder de Discriminação acumulado na população do Rio de Janeiro para os 38 loci testados foi de 0,9999999999999990 e na população dos índios Terena de 0,9999999999997, validando o uso desse sistema numa população heterogênea como a brasileira. A eficiência do indelplex-HID também mostrou-se elevada nas amostras de casos forenses comprometidas, apresentando melhor resultados que marcadores STR em termos de número de loci genotipados e de qualidade de amplificação. Na segunda etapa, o multiplex 46-AI-indels foi aplicado com objetivo de avaliar a ancestralidade em amostras de diferentes estados do Brasil por permitir a identificação de diferenças entre frequências alélicas de grupos populacionais separados geograficamente. A maioria das populações analisadas apresentou elevada herança européia. As populações do Rio de Janeiro, Pernambuco, Mato Grosso do Sul, Amazonas, Alagoas, Minas Gerais e São Paulo apresentaram cerca de 50% de ancestralidade européia, enquanto que nas populações que formam o sul do país e o Espírito Santo este percentual girou em torno de 70%. De uma maneira geral, as contribuições ameríndias e africanas variaram um pouco de acordo com a região. As amostras de Santa Isabel do Rio Negro e dos índios Terena (amostras indicadas como ameríndio-descendentes) de fato mostraram majoritariamente ancestralidade ameríndia (>70%). Os resultados obtidos indicaram que os dados gerados a partir da tipagem dos AIMs estão em estreita concordância com os registros históricos e com outros estudos genéticos acerca da formação da população brasileira e os loci do sistema HID evidenciaram que os são altamente informativos, constituindo uma ferramenta importante em estudos de identificação humana e de relações de parentesco.

Construção, clonagem e expressão do fragmento B da toxina diftérica de Corynebacterium diphtheriae (cepa PW- 8) em Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau

A vacina anti-diftérica de uso corrente no Brasil (DTP), embora de alta eficácia na prevenção da difteria, está associada com episódios de toxicidade e reatogenicidade no recipiente vacinal, resultantes de proteínas residuais derivadas do processo de produção ou detoxificação. Estratégias para o desenvolvimento de vacinas menos reatogênicas e ao mesmo tempo mais eficazes e economicamente viáveis contra a difteria têm sido alvo de intensa investigação. A alternativa proposta por nosso grupo é a utilização da vacina contra a tuberculose (Mycobacterium bovis BCG sub-cepa Moreau), como vetor do gene que codifica o fragmento B da toxina diftérica (dtb) de 58,3 kDa. Neste trabalho o dtb foi clonado no vetor micobacteriano bifuncional (pUS977) de expressão citoplasmática e os clones recombinantes (pUS977dtbPW8), após a transformação do BCG, foram testados com relação a expressão do DTB em BCG e quanto a antigenicidade frente a anticorpos policlonais anti-toxóide diftérico por Immunobloting. A integridade do gene dtb e a identidade das sequências de DNA da construção plasmidial pUS977dtbPW8 foram confirmadas por sequenciamento de DNA e análise de similaridade. A imunogenicidade do BCGr pUS977dtbPW8 expressando o DTB foi investigada em camundongos BALB/c, os resultados obtidos revelaram uma soroconversão específica (IgG). A infectividade e atividade microbicida do BCGr pUS977dtbPW8 no ambiente intracelular foi avaliada através da infecção de linhagens de células de monócitos humano (THP-1), os dados obtidos indicaram que houve sobrevivência intracelular em até 12 dias. Nesse contexto, esplenócitos dos camundongos imunizados com 30 e 60 dias foram extraídos, mostrando que o BCGr pUS977dtbPW8 persistiu até 60 dias na ausência de pressão seletiva e a viabilidade celular não sofreu alteração significativa durante o período testado. Por outro lado, o BCGr pUS977dtbPW8, quando submetido a seis sub-cultivos consecutivos in vitro não apresentou diferença significativa na capacidade de expressar o DTB, demonstrando portanto a persistência da estabilidade funcional da linhagem recombinante. A estabilidade estrutural da construção pUS977dtbPW8 também foi avaliada por PCR confirmando a presença do gene dtb em colônias do BCGr pUS977dtbPW8 . Adicionalmente, foi possível avaliar preliminarmente in vitro a capacidade soroneutralizante dos soros de camundongos imunizados com BCGr pUS977dtbPW8 após 30 e 60 dias em células VERO. A ação citotóxica da toxina diftérica entre as diluições de 1/4 e 1/16 foram neutralizadas com o pool de soros imunes com 60 dias. Finalmente, em nosso estudo foi possível avaliar o potencial da vacina BCG como vetor de expressão de um antígeno de Corynebacterium diphtheriae in vitro e in vivo.